CYP3A基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒

摘要

本发明提供了CYP3A基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法以及多态性检测用试剂盒。本发明的多态性检测用探针能高灵敏度且简便地检测CYP3A基因多态性。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张以2011年3月9日申请的日本申请特愿2011-051631为基 础的优先权，将其全部公开并入本文。

技术领域

本发明涉及CYP3A基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药 效评价方法以及多态性检测用试剂盒。

背景技术

CYP(细胞色素P450)为与类固醇激素等的生物物质的代谢、药物以 及环境污染物质等的氧化解毒反应相关的氧化酶。CYP形成含有多种分子 种的超家族，其中，已知CYP3A4和CYP3A5存在例如影响医药的代谢的 多态性(Human Mutation，2004年，Vol.23，Issue 1，p.100-108)。

编码CYP3A5的CYP3A5基因位于人的第7染色体。并且，例如已知 CYP3A5基因的部分序列(序列号1)中的第401位的碱基(r)存在从腺 嘌呤(a)向鸟嘌呤(g)的突变(CYP3A5*3)等(Clin.Pharmacol.Ther.， 2006年，Vol.80，p.179-191等)。由于该碱基的突变而产生剪接异常， CYP3A5的表达大幅降低。

另外，编码CYP3A4的CYP3A4基因位于人的第7染色体。并且例如 已知CYP3A4基因的部分序列(序列号2)中的第201位的碱基(s)存在 从胞嘧啶(c)向鸟嘌呤(g)的突变(CYP3A4*16)等(Clin.Pharmacol. Ther.，2006年，Vol.80，p.179-191等)。由该碱基的突变，CYP3A4的第 185位的苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)。

例如报告了这些突变与免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)等药物代谢 的关联(Clin.Pharmacol.Ther.，2006年，Vol.80，p.179-191)。因此，通 过检测CYP3A基因中的这些多态性，例如有可能能够以更高的灵敏度预 测耐药性。

现在，作为检测基因的多态性的方法，例如，已知有PCR(聚合酶链 式反应)-RFLP(限制性片段长度多态性)法等(Genet.Mol.Res.，2010 年，第9卷，第1号，p.34-40)。该方法使用设计为扩增含有检测目标碱 基的部分的引物进行PCR，使用因所述特定碱基中的突变的有无而切断与 否不同的限制性内切酶切断，之后通过电泳检测有没有被切断的方法。

另外，还已知在用PCR法扩增含有突变的区域之后，使用荧光染料标 记的核酸探针进行熔解曲线分析，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基 序列的突变的方法(参见专利文献2：日本特开2002-119291)。

发明内容

但是，CYP3A基因的突变中如前所述，存在各种突变。因此，PCR- RFLP法需要在PCR反应之后，提取扩增产物，进行限制性内切酶处理。 因此，所述扩增产物有可能混入到之后的反应系统中，并由此有时会得到 假阳性和假阴性的结果。另外，在PCR结束之后，用限制性内切酶进行处 理，之后再进行电泳，因此存在到检测为止需要的时间非常长的情况。另 外，由于操作复杂，难以自动化。根据这些现状，为了检测CYP3A基因 的多态性，期待进一步的技术开发。

本发明的课题为提供一种能够以高灵敏度简便检测CYP3A基因的多 态性的多态性检测用探针，使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明 的课题为提供使用了所述多态性检测方法的药效评价方法。而且，本发明 的课题为提供使用了所述多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。

本发明如下所述。

<1>一种多态性检测用探针，用于检测CYP3A基因的多态性，所述 多态性检测用探针是从包括下述P1、P1’、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、 P5和P5’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸：

(P1)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号1所示的序列中第401 位～第411位的碱基的碱基长为11～50的序列，其除了与序列号1中的第 411位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列号1相同的碱基 的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其中与序列号1所示的序列 中的第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；

(P1’)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号1所示的序列中第401 位～第411位的碱基的、碱基长为11～50的序列，其除了与序列号1中的 第411位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号1相同的碱基 的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号1所示的序列 中第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；

(P2)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201 位～第205位的碱基的碱基长为5～50的序列，其除了与序列号2中的第 205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2相同的碱 基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序 列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；

(P2’)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201 位～第205位的碱基的碱基长为5～50的序列，其除了与序列号2中的第 205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的 碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中 的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记；

(P3)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第 190位～第201位的碱基的碱基长为12～50的序列互补的序列，其除了与 序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序 列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且 其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标 记；

(P3’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第190 位～第201位的碱基的碱基长为12～50的序列互补的序列，其除了与序 列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序 列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；

(P4)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第186 位～第201位的碱基的碱基长为16～50的序列互补的序列，其除了与序 列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列 号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其 中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标 记；

(P4’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第 186位～第201位的碱基的碱基长为16～50的序列互补的序列，其除了与 序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号 2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的 序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；

(P5)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496 位～第501位的碱基的碱基长为6～50的序列互补的序列，其除了与序列 号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号 3的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其中 与序列号3所示的序列中的第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记；

(P5’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496 位～第501位的碱基的碱基长为6～50的序列互补的序列，其除了与序列 号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号3相 同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号3所示的序列 中第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。

<2>根据<1>所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷 酸识别序列号1中的第401位的碱基的多态性。

<3>根据<1>或<2>所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡 核苷酸在从3’末端起数第1～3位具有用所述荧光染料标记的所述碱基。

<4>根据<1>～<3>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述 荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用所述荧光染料标记的所述碱基。

<5>根据<1>～<4>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述 荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序 列杂交时荧光强度减少或增加。

<6>根据<1>～<5>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述 荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，在与所述靶标序列杂 交时荧光强度减少。

<7>根据<1>～<6>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述 P1和P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长为15～30碱基长，所述P2和P2’荧 光标记寡核苷酸的碱基长为10～30碱基长，所述P3和P3’荧光标记寡核 苷酸的碱基长为12～40碱基长，所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的碱基 长为16～40碱基长，所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10～40 碱基长。

<8>根据<1>～<7>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述 P1和P1’的荧光标记寡核苷酸的碱基长为15～20碱基长，所述P2和P2’ 荧光标记寡核苷酸的碱基长为10～20碱基长，所述P3和P3’荧光标记寡 核苷酸的碱基长为15～30碱基长，所述P4和P4’荧光标记寡核苷酸的碱 基长为20～30碱基长，所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸的碱基长为20～ 30碱基长。

<9>根据<1>～<8>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述 多态性检测用探针是用于分析熔解曲线的探针。

<10>根据<1>～<9>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所 述多态性检测用探针具有序列号37、序列号38、序列号39、序列号41、 序列号43或序列号45所示的碱基序列。

<11>根据<1>～<9>中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，具有 序列号4、序列号6、序列号8、序列号10、序列号44或序列号12所示 的碱基序列。

<12>一种多态性检测方法，通过使用<1>～<11>中任意一项所述的多 态性检测用探针来检测CYP3A基因的多态性。

<13>根据<12>所述的多态性检测方法，包括：

(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述 多态性检测用探针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体；

(II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，来使所述杂交 体形成体解离，并测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动；

(III)基于所述荧光信号的变动来测定Tm值，该Tm值是杂交体形 成体的解离温度；以及

(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的CYP3A基 因中的多态性的存在。

<14>根据<13>所述的多态性检测方法，其中，还包括：在所述(I) 之前或者与(I)同时扩增核酸。

<15>一种药剂的药效评价方法，包括：利用<12>所述的多态性检测 方法来检测CYP3A基因的多态性；以及基于检测的多态性的有无来评价 对药剂的耐性或者药剂的药效。

<16>一种多态性检测用试剂盒，用于检测CYP3A基因的多态性，所 述多态性检测用试剂盒包括<1>～<11>中任意一项所述的多态性检测用探 针。

<17>根据<16>所述的多态性检测用试剂盒，还包括用于扩增含有与 所述多态性检测用探针杂交的序列的区域的引物。

根据本发明，能够提供可高灵敏度且简便地检测CYP3A的多态性的 多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明能够提 供使用了该多态性检测方法的药效评价方法。而且，本发明能够提供使用 了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。此外，本发明例如不局限 于医疗领域，能够应用于生物化学等广泛领域中的CYP3A基因的多态性 检测。

附图说明

图1A和1B是本发明的实施例1涉及的试样的熔解曲线；

图2A和2B是本发明的实施例1涉及的试样的熔解曲线；

图3A和3B是本发明的实施例1涉及的试样的熔解曲线；

图4是本发明的实施例1涉及的试样的熔解曲线；

图5A和5B是本发明的实施例1涉及的试样的熔解曲线；

图6A和6B是本发明的实施例2涉及的试样的熔解曲线；

图7A和7B是本发明的实施例3涉及的试样的熔解曲线；

图8A和8B是比较例1涉及的试样的熔解曲线；

图9A和9B是比较例2涉及的试样的熔解曲线；

图10A～10C是本发明的实施例4涉及的试样的熔解曲线；

图11A和11B是本发明的实施例4涉及的试样的熔解曲线；

图12A～12C是本发明的实施例4涉及的试样的熔解曲线；

图13A和13B是本发明的实施例5涉及的试样的熔解曲线；

图14是比较例3-1涉及的试样的熔解曲线；

图15是比较例3-2涉及的试样的熔解曲线。

具体实施方式

本发明涉及的CYP3A基因的多态性检测用探针(以下，有时仅称“多 态性检测用探针”)为用于检测CYP3A基因的多态性的多态性检测用探 针，所述多态性检测用探针为从包括所述P1、P1’、P2、P2’、P3、P3’、 P4、P4’、P5和P5’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸。

本发明涉及的CYP3A基因多态性检测方法为包括使用至少一种用于 检测所述CYP3A基因的多态性的多态性检测用探针来检测CYP3A基因的 多态性的方法。

本发明涉及的药剂的药效评价方法为包括通过所述CYP3A基因多态 性检测方法检测CYP3A基因的多态性、以及基于检测的多态性的有无来 评价对药剂的耐性或者药剂的药效的方法。

本发明涉及的多态性检测用试剂盒含有用于检测CYP3A基因的多态 性的多态性检测用探针。

本发明涉及的“CYP3A基因”已经是公知的。CYP3A5基因的碱基序列 是指NCBI的登录号No.NC000007.13的99245813～99277621的序列。表 示CYP3A5基因的部分序列的序列号1为NCBI的dbSNP的登录号 No.NG007938的6683～7483的序列。CYP3A4基因的碱基序列是指NCBI 的登录号No.NC000007.13的99354583～99381811的序列。表示CYP3A4 基因的部分序列的序列号2为NCBI的dbSNP的登录号No.NG008421的 15519～15928的序列，表示CYP3A4基因的部分序列的序列号3为NCBI 的dbSNP的登录号No.NT007933.14的24616172～24616872序列。序列 号1～3的碱基序列中，r表示a或g，s表示c或g，w表示a、t或u，v 表示g、a或c。

CYP3A5基因的野生型中，与序列号1所示的序列中第401位对应的 碱基(r)为A(腺嘌呤)，突变型中，所述碱基(s)突变成G(鸟嘌 呤)。以下，将序列号1的CYP3A5基因的所述多态性称为“CYP3A5*3多 态性”。CYP3A4基因的野生型中，与序列号2所示的序列中第201位对应 的碱基(s)为C(胞嘧啶)，突变型中，所述碱基(s)突变为G(鸟嘌 呤)。以下，将序列号2的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*16 多态性”。

CYP3A4基因的野生型中，与序列号3所示的序列中的第501位对应 的碱基(r)为A(腺嘌呤)，突变型中，所述碱基(r)突变为G(鸟嘌 呤)。以下，将序列号3的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*1B 多态性”。

在CYP3A基因中，若所述3处的多态性中至少一处为前述那样的突 变型，则可以判断为例如存在免疫抑制剂tacrolimus等的药物代谢降低的 可能性。

本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探 针或者引物的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只 要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发 明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，由该互补的序列识别的序 列，在本领域技术人员的技术常识的范围内，视为将说明书全体替换为与 对应的本说明书中记载的序列互补的序列。

本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一 般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。即，当 加热含有双链核酸、例如双链核酸DNA的溶液时，260nm处的吸光度上 升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂， 解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，全部双链核酸DNA解离成单 链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸 光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设 定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升 量的50％时的温度。

本说明书中“步骤”一词，不仅包含独立的步骤，而且例如在不能与 其他的步骤明确区别的情况下，只要达到了本步骤预期的效果，则包含在 本术语之内。另外，本说明书中，使用“～”表示的数值范围为分别包含 “～”的前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。另外，在本发明中， 组成物中的各成分的量，在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的 情况下，只要不特别指出，意思是指所述组成物中存在的该多种物质的合 计量。本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第1～3 位”时为以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。

<CYP3A基因多态性检测用探针>

本发明涉及的CYP3A基因的多态性检测用探针为用于检测CYP3A基 因的多态性的多态性检测用探针，该多态性检测用探针为从包括所述P1、 P1’、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、P5和P5’的组中选择的一种荧光标记 寡核苷酸。

CYP3A5基因的野生型中，与序列号1所示的序列中的第401位对应 的碱基(r)为A(腺嘌呤)，突变型中，所述碱基(r)突变成G(鸟嘌 呤)。以下，将序列号1的CYP3A5基因的所述多态性称为“CYP3A5*3多 态性”。以下也将检测该多态性的探针称为CYP3A5*3用探针。

本发明中，从包括所述P1和P1’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸 (以下也称为“所述(P1)或(P1’)荧光标记寡核苷酸”。)为能够检测序 列号1所示的碱基序列的第401位的碱基中的多态性的探针。

本发明的所述P1的荧光标记寡核苷酸具体而言为含有序列号1所示 的序列中的第401位～第411位的碱基的序列。在所述P1荧光标记寡核 苷酸中，例如与序列号1所示的碱基序列的第401位的碱基对应的碱基 (r)可以为A，也可以为G。

(P1)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号1所示的序列中第401 位～第411位的碱基的碱基长为11～50的序列，其除了与序列号1中的第 411位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号1相同的碱 基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且与序列号1所示的序列中 第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。

本发明的所述P1的荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号1中的第411 位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外，相对于具有与序列号1相同的 碱基的碱基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P1荧光标记寡核 苷酸除了与序列号1中的第411位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之 外，相对于具有与序列号1相同的碱基的碱基序列，显示出80％以上的同 一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如，也可以显示出85％以上的 同一性，90％以上的同一性，95％以上的同一性，96％以上的同一性，97％ 以上的同一性，98％以上的同一性或者99％以上的同一性。另外，所述P1 荧光标记寡核苷酸进一步优选如下：其除了与序列号1中的第411位的碱 基对应的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第401位的碱基对应的碱基为r(A 或G)之外，相对于具有与序列号1相同的碱基的碱基序列具有同一性。 这里，“具有与序列号相同的碱基的碱基序列”是指，改变了的所述探针 中出现的所述序列号中的序列中的区域。

本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸例如在与序列号1的第401位的 碱基对应的碱基为突变型的G的情况下，例如可以说：在本发明的所述 P1荧光标记寡核苷酸和除了与序列号1中的第411位的碱基对应的碱基为 C(胞嘧啶)之外具有与序列号1相同的碱基的碱基序列进行比较时其同 一性低于80％的情况下，对于含有突变型的CYP3A5基因的试样核酸的检 测灵敏度变低。

作为本发明涉及的所述P1荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序 列号1中的第401位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。所述荧光标记 寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号1中的第401 位的碱基的多态性的功能。因此所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号1 的第401位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有针对含有突变型 的CYP3A5基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明的所述P1’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号1中的第411 位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外，还与具有与序列号1相同的碱 基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。在所述P1’荧光标记寡核苷酸 中，例如与序列号1所示的碱基序列的第401位的碱基对应的碱基(r)可 以为A，也可以为G。

(P1’)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号1所示的序列中第401 位～第411位的碱基的碱基长为11～50的序列，其除了与序列号1中的第 411位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号1相同的碱基的 碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号1所示的序列中 第411位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。

所述杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如 Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press， 2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参照并入本说明书。

严谨条件是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。典 型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mmol/L～约50mmol/L以及镁浓 度约1.0mmol/L～约5.0mmol/L中，进行杂交的条件。作为本发明的条件 的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mmol/L的KCl以及 1.5mmol/L的MgCl₂下进行杂交的条件，但是不限于此。此外，严谨条件 被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab. Press，2001)中。该文献通过参照并入本说明书。本领域技术人员可以通 过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，来容易地选择上述条件。

作为本发明涉及的所述P1’荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序 列号1中的第401位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。所述荧光标记 寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号1中的第401 位的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号 1的第401位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有对于含有突变 型的CYP3A5基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P1或者所述P1’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P1 或所述P1’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡 核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出 与所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺 失或取代了碱基的情况下，该插入、缺失或取代的位置无特别限定。插 入、缺失或者取代的碱基的数量可以为一个碱基或者两个碱基以上。所述 碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为1 个碱基～10个碱基、或者1个碱基～5个碱基。

其中，本发明中的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸还包括取代了 所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取 代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P1或所述P1’的荧光标记 寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如，从检测灵 敏度的观点来说，可以是位于序列号1所示的序列中的第401位～第411 位的碱基之外的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为1个碱基或者2 个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不 同，例如可以为1个碱基～5个碱基或者1个碱基～3个碱基。

本发明的所述P1或所述P1’的荧光标记寡核苷酸的长度需要是11～50 碱基(mer)。在所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的长度为10个碱基 以下或者51个碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降 低。另外，本发明的所述P1或所述P1’的荧光标记寡核苷酸的长度例如可 以为15～30个碱基、15～21个碱基或者15～20个碱基。例如，通过使之 为所述15～30个碱基的范围，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。另 外，通过改变所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将 Tm值设置为期望的值，该Tm值是由所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷 酸与其互补链形成的杂交体形成体的解离温度。

下面示出本发明中的所述P1荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例， 但是本发明不限于此。

5′-ttgtctttcartatctcttcc-3′(序列号37)

5′-ttgtctttcagtatctcttcc-3′(序列号4)(3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21)

5′-ttgtctttcaatatctcttcc-3′(序列号5)

在本发明的所述P1或者所述P1’的荧光标记寡核苷酸中，与序列号1 的序列中第411位的碱基对应的碱基需要用荧光染料标记。

在所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的第411位 的碱基可以存在于从3’末端起数第1～3位的任何位置，另外，可以存在 于3’末端。由此例如多态性检测灵敏度进一步提高，而且能够性良好地获 得P1或者所述P1’荧光标记寡核苷酸。

在本发明中，从包括所述P2、所述P2’、所述P3、所述P3’、所述P4 以及所述P4’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸(以下，也称为“所述 (P2)、(P2’)、(P3)、(P3’)、(P4)或(P4’)荧光标记寡核苷 酸”。)是能够检测序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基的多态性的 探针。

CYP3A4基因的野生型中，与序列号2所示的序列中第201位对应的 碱基(s)为C(胞嘧啶)，突变型中，所述碱基(s)突变为G(鸟嘌 呤)。以下，将序列号2的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*16 多态性”。下面也将检测该多态性的探针称为CYP3A4*16用探针。

本发明的所述P2的荧光标记寡核苷酸具体是含有序列号2所示的序 列中的第201位～第205位的碱基的序列。在所述P2荧光标记寡核苷酸 中，例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基对应的碱基(s)可 以为C，也可以为G。

(P2)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中的第201 位～第205位的碱基的碱基长为5～50的序列，其除了与序列号2中的第 205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号2相同的碱 基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其中与序列号2所示的序 列中的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。

本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第205 位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外，相对于具有与序列号2相同的 碱基的碱基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P2荧光标记寡核 苷酸除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之 外，相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列显示出80％以上的同一 性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如，也可以显示出85％以上的同 一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以 上的同一性、98％以上的同一性或者99％以上的同一性。另外，所述P2 荧光标记寡核苷酸进一步优选如下：除了与序列号2中的第205位的碱基 对应的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第201位的碱基对应的碱基为s(C或 G)之外，相对于具有与序列号2相同的碱基的碱基序列具有同一性。

本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的 碱基对应的碱基为突变型的G的情况下，例如可以说：在本发明的所述 P2的荧光标记寡核苷酸和除了与序列号2中的第205位的碱基对应的碱基 为C(胞嘧啶)之外具有与序列号2相同的碱基的碱基序列进行比较时， 其同一性低于80％的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核酸 的检测灵敏度变低。

作为本发明涉及的所述P2的荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别 序列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记 寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201 位的碱基的多态性的功能。因此所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2 的第201位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P2’的荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第 205位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外，与具有和序列号2相同的 碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。所述P2’的荧光标记寡核苷 酸例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基对应的碱基(s)可以 为C，也可以为G。所述杂交和严谨条件如前所述。

(P2’)荧光标记寡核苷酸，其是含有序列号2所示的序列中第201 位～第205位的碱基的碱基长为5～50的序列，其除了与序列号2中的第 205位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2相同的碱基的 碱基序列的互补链在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序列中 的第205位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。

作为本发明涉及的所述P2’荧光标记寡核苷酸，例如，可以是识别序 列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡 核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位 的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2 的第201位的碱基对应的碱基为突变型G的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P2或者所述P2’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P2 或所述P2’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡 核苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出 与所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、 缺失或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或者取代的位置无特别限 定。插入、缺失或者取代的碱基的数量可以为1个碱基或者2个碱基以 上。所述碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如 可以为1个碱基～10个碱基、或者1个碱基～5个碱基。

其中，本发明中的所述P2或者所述P2’荧光标记寡核苷酸还包括取代 了所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所 述取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P2或所述P2’的荧光 标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如从检测 灵敏度的观点来说，可以为位于序列号2所示的序列中的第201位～第 205位的碱基之外的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为1个碱基或 者2个碱基以上。被取代的碱基的数根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而 不同，例如可以为1个碱基～5个碱基、或者1个碱基～3个碱基。

本发明的所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸的长度需要是5～50个 碱基(mer)。在所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸的长度为4个碱基 以下或者51个碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降 低。另外，本发明的所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以 为10～30个碱基或者10～20个碱基。例如，通过使之为所述10～30碱基 的范围，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。另外，通过改变所述P2或 所述P2’的荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的 值，该Tm值是所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂 交体形成体的解离温度。

下面示出本发明中的所述P2的荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示 例，但是本发明不限于此。

5′-gatgtgatcastagc-3′(序列号38)

5′-gatgtgatcagtagc-3′(序列号6)(3T-CYP3A4*16-MF1)

5′-gatgtgatcactagc-3′(序列号7)

在本发明的所述P2或所述P2’荧光标记寡核苷酸中与序列号2的序列 中的第205位的碱基对应的碱基需要用荧光染料标标记。

在所述P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的第205 位的碱基可以存在于从3’末端起数第1～3位的位置，另外，可以存在于 3’末端。由此例如多态性检测灵敏度进一步提高，并且能够生产性良好地 地获得P2或所述P2’的荧光标记寡核苷酸。

在本发明中，所述P3和P3’的荧光标记寡核苷酸中例如与序列号2所 示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为G，也可以为C。

本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸具体是与含有序列号2所示的序 列中第190位～第201位的碱基的序列互补的序列。所述P3荧光标记寡 核苷酸例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s) 可以为C，也可以为G。

(P3)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第 190位～第201位的碱基的碱基长为12～50的序列互补的序列，其除了与 序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序 列号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且 其中与序列号2所示的序列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标 记。

本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第190 位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，具有相对具有序列号2的互补 链相同的碱基的碱基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P3的荧 光标记寡核苷酸除了与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为C(胞 嘧啶)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列显示 出80％以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如可以显示出 85％以上的同一性，90％以上的同一性，95％以上的同一性，96％以上的同 一性，97％以上的同一性，98％以上的同一性或99％以上的同一性。另 外，所述P3荧光标记寡核苷酸进一步优选的是，除了与序列号2中的第 190位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第201位的碱基互补的 碱基为s(C或G)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的 碱基序列具有同一性。

本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的 碱基互补的碱基为突变型的C的情况下，例如可以说：在本发明的所述 P3的荧光标记寡核苷酸和与序列号2中的第190位的碱基互补的碱基为C (胞嘧啶)之外具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列进行比较 时其同一性低于80％的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核 酸的检测灵敏度变低。

作为本发明涉及的所述P3荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序 列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡 核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位 的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2 的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P3’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第190 位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，与具有与序列号2相同的碱基 的碱基序列在严谨条件下杂交。所述P3’荧光标记寡核苷酸例如与序列号2 所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为C，也可以为 G。所述杂交和严谨条件如前所述。

(P3’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第190 位～第201位的碱基的碱基长为12～50的序列互补的序列，其除了与序 列号2中的第190位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号2 相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的序 列中的第190位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。

作为本发明涉及的所述P3’荧光标记寡核苷酸，例如，可以是识别序 列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡 核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位 的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2 的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P3或 所述P3’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核 苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与 所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失 或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插 入、缺失或者取代的碱基的数量可以为1个碱基或者2个碱基以上。所述 碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为1 个碱基～10个碱基、或者1个碱基～5个碱基。

其中，本发明中的所述P3或所述P3’的荧光标记寡核苷酸还包括取代 了所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述 取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P3或所述P3’荧光标记 寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如，从检测灵 敏度观点来说，可以为与位于序列号3所示的序列中第190位～第201位 的碱基之外的碱基互补的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为1个碱 基或者2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的 长度而不同，例如可以为1个碱基～5个碱基或者1个碱基～3个碱基。

本发明的所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的长度需要是12～50 碱基(mer)。在所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的长度为11碱基以 下或51碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另 外，本发明的所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为12～ 40碱基或15～30碱基。例如，通过使之为所述12～40碱基的范围，例如 有检测灵敏度变高等的倾向。另外通过改变所述P3或所述P3’的荧光标记 寡核苷酸的碱基长，例如，能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是所 述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体的解离温度。

下面示出本发明中的所述P3荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例， 但是本发明不限于此。

5′-tgtgctastgatcacatcc-3′(序列号39)

5′-tgtgctactgatcacatcc-3′(序列号8)(3T-CYP3A4*16-MR1)

5′-tgtgctagtgatcacatcc-3′(序列号40)

在本发明的所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸中与序列号2的序列 中第190位的碱基互补的碱基需要用荧光染料标记。

在所述P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的与第190 位的碱基互补的碱基可以存在于从3’末端起数第1～3位的任何位置，另 外，可以存在于3’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进一步提高，并且 能够生产性良好地地获得P3或所述P3’荧光标记寡核苷酸。

在本发明中，所述P4和P4’的荧光标记寡核苷酸中例如与序列号2所 示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为G，也可以为C。

本发明的所述P4的荧光标记寡核苷酸具体是与含有序列号2所示的 序列中的第186位～第201位的碱基的序列互补的序列。在所述P4荧光 标记寡核苷酸中例如与序列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的 碱基(s)可以为C，也可以为G。

(P4)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中第186 位～第201位的碱基的碱基长为16～50的序列互补的序列，其除了与序 列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列 号2的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其 中与序列号2所示的序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标 记。

本发明的所述P4荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第186 位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，相对具有序列号2的互补链相 同的碱基的碱基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P4的荧光标 记寡核苷酸除了与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为C(胞嘧 啶)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列显示出 80％以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如可以显示出 85％以上的同一性，90％以上的同一性，95％以上的同一性，96％以上的同 一性，97％以上的同一性，98％以上的同一性或99％以上的同一性。另 外，所述P4荧光标记寡核苷酸进一步优选如下，除了与序列号2中的第 205位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第201位的碱基互补的 碱基为s(C或G)之外，相对于具有与序列号2的互补链相同的碱基的 碱基序列具有同一性。

本发明的所述P4荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2的第201位的 碱基互补的碱基为突变型的C的情况下，例如可以说：在将本发明的所述 P4的荧光标记寡核苷酸和与序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为C (胞嘧啶)之外具有与序列号2的互补链相同的碱基的碱基序列进行比较 时其同一性低于80％的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试样核 酸的检测灵敏度变低。

作为本发明涉及的所述P4荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序 列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡 核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位 的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2 的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P4’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号2中的第186 位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，还与具有与序列号2相同的碱 基的碱基序列在严谨条件下杂交。所述P4荧光标记寡核苷酸中例如与序 列号2所示的碱基序列的第201位的碱基互补的碱基(s)可以为C，也可 以为G。所述杂交和严谨条件如前所述。

(P4’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号2所示的序列中的第 186位～第201位的碱基的碱基长为16～50的序列互补的序列，其除了与 序列号2中的第186位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号 2相同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号2所示的 序列中的第186位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。

作为本发明涉及的所述P4’荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序 列号2中的第201位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡 核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号2中的第201位 的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号2 的第201位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P4或 所述P4’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核 苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与 所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失 或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插 入、缺失或者取代了碱基的数量可以为1个碱基或者2个碱基以上。所述 碱基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为1 个碱基～10个碱基、或者1个碱基～5个碱基。

其中，本发明中的所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸还包括取代 了所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所 述取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P4或所述P4’的荧光 标记寡核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如从检测 灵敏度观点来说，可以为与位于序列号2所示的序列中第186位～第201 位的碱基之外的碱基互补的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为1个 碱基或者2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体 的长度而不同，例如可以为1个碱基～5个碱基或者1个碱基～3个碱基。

本发明的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸的长度需要是16～50 碱基(mer)。在所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸的长度为15碱基以 下或者51碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另 外，本发明的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为16～ 40碱基或20～30碱基。例如，通过使之为所述16～40碱基的范围，例如 具有例如检测灵敏度变高等的倾向。另外通过改变所述P4或所述P4’荧光 标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值是 所述P4或所述P4’的荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体的解离温 度。

下面示出本发明中的所述P4荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例， 但本发明不限于此。

5′-atgatgtgctastgatcacatccatgc-3′(序列号41)

5′-atgatgtgctactgatcacatccatgc-3′(序列号10)(U0-3TMR4)

5′-atgatgtgctagtgatcacatccatgc-3′(序列号42)

5′-gatgtgctastgatcacatccatgc-3′(序列号43)

5′-gatgtgctactgatcacatccatgc-3′(序列号44)

5′-gatgtgctagtgatcacatccatgc-3′(序列号11)

在本发明的所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸中与序列号2的序列 中第186位的碱基互补的碱基需要用荧光染料标记。

在所述P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸中，该荧光标记的与第186位 的碱基互补的碱基可以存在于从3’末端起数第1～3位的任何位置，另 外，可以存在于3’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进一步提高，并且 能够生产性良好地地获得P4或所述P4’荧光标记寡核苷酸。

本发明中，从包括所述P5和P5’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸 (以下也称“所述(P5)或(P5’)荧光标记寡核苷酸”。)是能够检测序列 号3所示的碱基序列的第501位的碱基中的多态性的探针。

(P5)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496 位～第501位的碱基的碱基长为6～50的序列互补的序列，其除了与序列 号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，相对于具有与序列号 3的互补链相同的碱基的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且其中 与序列号3所示的序列中的第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。

(P5’)荧光标记寡核苷酸，其是与含有序列号3所示的序列中第496 位～第501位的碱基的碱基长为6～50的序列互补的序列，其除了与序列 号3中的第496位的碱基互补的碱基为胞嘧啶之外，与具有与序列号3相 同的碱基的碱基序列在严谨条件下杂交，并且其中与序列号3所示的序列 中第496位的碱基互补的碱基用荧光染料标记。

CYP3A4基因的野生型中，与序列号3所示的序列中第501位对应的 碱基(r)为A(腺嘌呤)，而突变型中所述碱基(r)突变为G(鸟嘌 呤)。以下，将序列号3的CYP3A4基因的所述多态性称为“CYP3A4*1B 多态性”。以下也将检测该多态性的探针称为CYP3A4*1B用探针。

在本发明中，所述P5和P5’荧光标记寡核苷酸中例如与序列号3所示 的碱基序列的第501位的碱基互补的碱基(y)可以为C，也可以为T。

本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸具体是与含有序列号3所示的序 列中第496位～第501位的碱基的序列互补的序列。在所述P5荧光标记 寡核苷酸中，例如与序列号3所示的碱基序列的第501位的碱基互补的碱 基(y)可以为C，也可以为T。

本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号3中的第496 位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外，还相对于具有与序列号3的互 补链相同的碱基的碱基序列具有同一性。具体而言，本发明的所述P5荧 光标记寡核苷酸除了与序列号3中的第496位的碱基互补的碱基为C(胞 嘧啶)之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基的碱基序列显示 出80％以上的同一性。另外，从检测灵敏度的观点来说，例如也可以显示 出85％以上的同一性，90％以上的同一性，95％以上的同一性，96％以上 的同一性，97％以上的同一性，98％以上的同一性或99％以上的同一性。 另外，所述P5荧光标记寡核苷酸进一步优选如下：除了与序列号3中的 第496位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)，并且与第501位的碱基互补 的碱基为y(C或T)之外，相对于具有与序列号3的互补链相同的碱基 的碱基序列具有同一性。

本发明的所述P5荧光标记寡核苷酸例如在与序列号3的第501位的 碱基互补的碱基为突变型的C的情况下，例如可以说是：在将本发明的所 述P5荧光标记寡核苷酸和与序列号5中的第496位的碱基互补的碱基为C (胞嘧啶)之外具有与序列号5的互补链相同的碱基的碱基序列进行比较 时，在其同一性低于80％的情况下，对于含有突变型的CYP3A4基因的试 样核酸的检测灵敏度变低。

作为本发明涉及的所述P5荧光标记寡核苷酸例如也可以是识别序列 号3中的第501位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡核 苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号3中的第501位的 碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号3的 第501位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型的 CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P5’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列号3中的第496 位的碱基互补的碱基为C(胞嘧啶)之外与具有与序列号3相同的碱基的 碱基序列在严谨条件下杂交。所述P5’荧光标记寡核苷酸中例如与序列号3 所示的碱基序列的第501位的碱基互补的碱基(y)可以为C，也可以为 T。所述杂交和严谨条件如前所述。

作为本发明涉及的所述P5’荧光标记寡核苷酸，例如也可以是识别序 列号3中的第501位的碱基的多态性的荧光标记寡核苷酸。该荧光标记寡 核苷酸除了具有特定的碱基序列之外，还具有识别序列号3中的第501位 的碱基的多态性的功能。因此，所述荧光标记寡核苷酸例如在与序列号3 的第501位的碱基互补的碱基为突变型C的情况下，具有对于含有突变型 的CYP3A4基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。

本发明中的所述P5或所述P5’的荧光标记寡核苷酸还包括所述P5或 所述P5’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核 苷酸。所述插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与 所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失 或者取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插 入、缺失或者取代了碱基的数量可以为1个碱基或2个碱基以上。所述碱 基的数量根据所述荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以为1个 碱基～10个碱基，或者1个碱基～5个碱基。

其中，本发明中的所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸还包含取代了 所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。所述取 代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示出与所述P5或所述P5’荧光标记寡 核苷酸同等程度的作用即可，取代的位置无特别限定。例如，从检测灵敏 度的观点来说，可以为与位于序列号3所示的序列中的第496位～第501 位的碱基之外的碱基互补的碱基被取代。被取代的碱基的数量可以为1个 碱基或2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的 长度而不同，例如可以为1个碱基～5个碱基，或者1个碱基～3个碱基。

本发明的所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸的长度需要是6～50碱 基(mer)。在所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸的长度为5碱基以下 或者51碱基以上的情况下，CYP3A基因多态性的检测灵敏度降低。另 外，本发明的所述P5或者所述P5’荧光标记寡核苷酸的长度例如可以为 10～40碱基或20～30碱基。例如，通过使之为所述10～40碱基的范围， 例如具有检测灵敏度提高等的倾向。另外，通过改变所述P5或所述P5’荧 光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将Tm值设置为期望的值，该Tm值 是所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸与其互补链形成的杂交体的解离温 度。

下面示出本发明中的所述P5荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例， 但是本发明不限于此。

5′-taaatcgccgctctcytgccc-3′(序列号45)

5′-taaatcgccgctctcctgccc-3′(序列号12)(3PB-CYP3A4*1B-R3)

5′-taaatcgccgctctcttgccc-3′(序列号13)

本发明的所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸中与序列号3的序列中 的第496位的碱基互补的碱基需要用荧光染料标记。

在所述P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的与第496 位的碱基互补的碱基可以位于从3’末端起数第1～3位的任何位置，另 外，可以存在于3’末端。由此例如多态性检测灵敏度进一步提高，并且能 够生产性良好地获得P5或所述P5’荧光标记寡核苷酸。

关于所述P1、P1’、P2、P2’、P3、P3’、P4、P4’、P5和P5’荧光标记 寡核苷酸的杂交体形成体的Tm值例如可以使用Meltcalc 99free(http: //www.meltcalc.com/)来计算。设定条件无特别限制，例如可以为 Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件。所述杂交体形成体例如可以 是：由与检测位点对应的碱基为突变型的所述荧光标记寡核苷酸(突变型 荧光标记寡核苷酸)和检测位点为突变型的互补序列或者检测位点为野生 型的互补序列形成的杂交体形成体、由与检测位点对应的碱基为野生型的 所述荧光标记寡核苷酸(野生型荧光标记寡核苷酸)和检测位点为突变型 的互补序列或者检测位点为野生型的互补序列形成的杂交体形成体。所述 突变型荧光标记寡核苷酸和突变型互补序列的Tm值与所述突变型荧光标 记寡核苷酸和野生型互补序列的Tm值之差例如为3℃以上、4℃以上、5 ℃以上、30℃以下。另外，所述野生型荧光标记寡核苷酸和野生型互补序 列的Tm值与所述野生型荧光标记寡核苷酸和突变型互补序列的Tm值之 差例如为3℃以上、4℃以上、5℃以上或者7℃以上等，例如30℃以下 等。

本发明的所述荧光标记寡核苷酸例如可以为与未与互补链杂交时的荧 光强度相比，与互补链杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记 寡核苷酸。其中，可以为与未与互补链杂交时的荧光强度相比，与互补链 杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。

利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为 鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓QProbe(注册商标)。其中尤其优选如下寡 核苷酸：其被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并用荧光染料标记 使得该末端的C靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这种探针，例如可 以根据信号变动而容易地确认杂交和解离。

除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作 为这种检测方式，可举出Taq-man Probe法、Hybridization Probe法、 Molecular Beacon法或MGB Probe法等。

作为所述荧光染料无特别限制，例如可以为荧光素、磷光体、罗丹 明、聚甲炔染料衍生物等。所述荧光染料市售品例如有Pacific Blue、 BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。

所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述 荧光染料适当确定。例如Pacific Blue在波长445～480nm下能够检测，对 TAMRA在波长585～700nm下能够检测，对BODIPY FL在波长520～ 555nm下能够检测。

如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动 来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开 2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷 酸。

另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3′末端添加有磷酸基。因 为通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针 自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶 标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端 添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应的反应液 中。另外，通过在所述探针的3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光 染料)，也能够得到同样的效果。

所述各荧光标记寡核苷酸能够作为检测CYP3A基因中的多态性、尤 其是CYP3A5*3、CYP3A4*16和/或CYP3A4*B1的CYP3A基因多态性检 测用探针来使用。另外，所述CYP3A基因多态性检测用探针能够用作后 述的用于分析熔解曲线的探针。

此外，本发明中的所述荧光标记寡核苷酸例如除使用基于前述的条件 用荧光染料标记的碱基之外，还能够按照已知为寡核苷酸的合成方法的公 知的方法，例如特开2002-119291号公报等记载的方法来制备。

<引物>

在后述的CYP3A基因多态性检测方法中，例如在利用PCR法等扩增 法扩增含有作为检测对象的CYP3A基因多态性的序列时使用引物。本发 明中可以使用的引物无特别限制，只要能够扩增含有作为目标的检测对象 的CYP3A基因的多态性的位点的核酸即可。所述核酸例如可以为含有与 序列号1的第401位的碱基对应的碱基的核酸、含有与序列号2的第201 位的碱基对应的碱基的核酸、含有与序列号3的第501位的碱基对应的碱 基的核酸等。

应用于扩增法中的引物只要能够扩增本发明的多态性检测用探针能够 杂交的区域即可，无特别限制，本领域技术人员能够基于序列号1、序列 号2和序列号3所示的碱基序列，来适当设计。所述引物的长度和Tm值 例如可以设为12～40碱基(mer)和40～70碱基，或者16～30碱基和 55～60碱基。另外，引物对的各引物的长度例如可以不相同，但是两个引 物的Tm值优选大致相同，或者两个引物的Tm值之差为5℃以内。

以下示出在本发明的多态性检测方法中能够用于扩增含有本发明的多 态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物的示例。此外，这些仅是例 示而已，并不限制本发明。

用于检测所述序列号1所示的序列中的第401位的碱基(r)的多态性 的引物，优选从包括P6、P6’、P7和P7’的组中选择的至少一种寡核苷 酸。所述杂交和严谨条件如前所述。

(P6)相对于含有序列号1所示的碱基序列中的第322位～第344位 的碱基的碱基长为23～50的碱基序列，具有至少80％以上的同一性的寡 核苷酸。

(P6’)与含有序列号1所示的碱基序列中的第322位～第344位的碱 基的碱基长为23～50的碱基序列的互补链，在严谨条件下杂交的寡核苷 酸。

(P7)相对于含有序列号1所示的碱基序列中的第446位～第463位 的碱基的碱基长为18～50碱基的碱基序列的互补链，具有至少80％以上 的同一性的寡核苷酸。

(P7’)与含有序列号1所示的碱基序列中第446位～第463位的碱基 的碱基长为18～50的碱基序列，在严谨条件下杂交的寡核苷酸。

所述P6寡核苷酸也可以是相对于含有序列号1所示的碱基序列中的 第322位～第344位的碱基的碱基长为23～50的碱基序列具有至少80％ 以上的同一性、并且扩增含有序列号1中的第401位的碱基的区域的寡核 苷酸。所述P6’寡核苷酸也可以是与含有序列号1所示的碱基序列中的第 322位～第344位的碱基的碱基长为23～50的碱基序列的互补链在严谨条 件下杂交、并且扩增含有序列号1中的第401位的碱基的区域的寡核苷 酸。

所述P7寡核苷酸也可以是相对于含有序列号1所示的碱基序列中的 第446位～第463位的碱基的碱基长为18～50碱基的碱基序列的互补链具 有至少80％以上的同一性、并且扩增含有序列号1中的第401位的碱基的 区域的寡核苷酸。所述P7’寡核苷酸也可以是与含有序列号1所示的碱基 序列中第446位～第463位的碱基的碱基长为18～50的碱基序列在严谨条 件下杂交、并且扩增含有序列号1中的第401位的碱基的区域的寡核苷 酸。

以下示出本发明的多态性检测方法中，能够在扩增含有所述序列号1 中的第401位的碱基(r)的区域时使用的引物的示例。

P6F引物(序列号14)(CYP3A5*3F4)

5′-cgtatgtaccacccagcttaacg-3′

P7R引物(序列号15)(CYP3A5*3R4)

5′-cacaggagccacccaagg-3′

另外，为了检测所述序列号1中的第401位的碱基(r)的多态性，更 优选将所述P6或P6’所示的寡核苷酸、以及P7或P7’所示的寡核苷酸作为 一对引物对使用。

用于检测所述序列号2所示的序列中的第201位的碱基(s)的多态性 的引物优选从包括下述P8、P8’、P9、P9’、P10和P10’的组中选择的至少 一种寡核苷酸。所述杂交和严谨条件如前所述。

(P8)相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第118位～第137位 的碱基的碱基长为20～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性的寡核 苷酸。

(P8’)与含有序列号2所示的碱基序列中的第118位～第137位的碱 基的碱基长为20～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷 酸。

(P9)相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第22位～第49位的 碱基的碱基长为28～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性的寡核苷 酸。

(P9’)与含有序列号2所示的碱基序列中的第22位～第49位的碱基 的碱基长为28～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。

(P10)相对于含有序列号2所示的碱基序列中的第292位～第312 位的碱基的碱基长为21～50碱基的碱基序列的互补链具有至少80％以上 的同一性的寡核苷酸。

(P10’)与含有序列号2所示的碱基序列中的第292位～第312位的 碱基的碱基长为21～50的碱基序列在严谨条件下杂交的寡核苷酸。

所述P8寡核苷酸也可以是相对于含有序列号2所示的碱基序列中的 第118位～第137位的碱基的碱基长为20～50的碱基序列具有至少80％ 以上的同一性、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核 苷酸。所述P8’寡核苷酸也可以是与含有序列号2所示的碱基序列中的第 118位～第137位的碱基的碱基长为20～50的碱基序列的互补链在严谨条 件下杂交、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷 酸。

所述P9寡核苷酸也可以是相对于含有序列号2所示的碱基序列中的 第22位～第49位的碱基的碱基长为28～50的碱基序列具有至少80％以 上的同一性、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷 酸。所述P9’寡核苷酸也可以是与含有序列号2所示的碱基序列中的第22 位～第49位的碱基的碱基长为28～50的碱基序列的互补链在严谨条件下 杂交、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区域的寡核苷酸。

所述P10寡核苷酸也可以是相对于含有序列号2所示的碱基序列中的 第292位～第312位的碱基的碱基长为21～50碱基的碱基序列的互补链具 有至少80％以上的同一性的寡核苷酸、并且扩增含有序列号2中的第201 位的碱基的区域的寡核苷酸。所述P10’寡核苷酸也可以是与含有序列号2 所示的碱基序列中的第292位～第312位的碱基的碱基长为21～50的碱基 序列在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列号2中的第201位的碱基的区 域的寡核苷酸。

以下示出在本发明的多态性检测方法中能够用于扩增含有所述序列号 2中的第201位的碱基(s)的区域的引物的示例。

P8F引物(序列号16)

5′-aggatggtaaaaaggtgctg-3’

P10R引物(序列号17)

5’-gagagaaagaatggatccaaa-3’

所述引物例如也可以如后面所述具有添加序列，可以例示为以下的引 物。下述序列中，下划线部分的CTAGA和GACGA对应于所述添加序 列。

P9F引物(序列号18)(CYP3A4*16-F6+CTAGA)

5’-CTAGAggagtgtgatagaaggtgatctagtaga-3’

P10R引物(序列号28)(U0-R3+GACGA)

5’-GACGAgagagaaagaatggatccaaa-3′

另外，为了检测所述序列号2中的第201位的碱基(s)的多态性，更 优选将所述P8、P8’、P9或P9’所示的寡核苷酸和P10或P10’所示的寡核 苷酸作为一对引物对来使用。

用于检测所述序列号3所示的序列中的第501位的碱基(r)的多态性 的引物，优选从包括下述P11、P11’、P12和P12’的组中选择的至少一种 寡核苷酸。所述杂交和严谨条件如前所述。

(P11)相对于含有序列号3所示的碱基序列中的第432位～第457 位的碱基的碱基长为26～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性的寡 核苷酸。

(P11’)与含有序列号3所示的碱基序列中的第432位～第457位的 碱基的碱基长为26～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷 酸。

(P12)相对于含有序列号3所示的碱基序列中的第508位～第539 位的碱基的碱基长为32～50碱基的碱基序列的互补链具有至少80％以上 的同一性的寡核苷酸。

(P12’)与含有序列号3所示的碱基序列中的第508位～第539位的 碱基的碱基长为32～50的碱基序列在严谨条件下杂交的寡核苷酸。

所述P11寡核苷酸也可以是相对于含有序列号3所示的碱基序列中的 第432位～第457位的碱基的碱基长为26～50的碱基序列具有至少80％ 以上的同一性、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核 苷酸。所述P11’寡核苷酸也可以是与含有序列号3所示的碱基序列中的第 432位～第457位的碱基的碱基长为26～50的碱基序列的互补链在严谨条 件下杂交、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核苷 酸。

所述P12寡核苷酸也可以是相对于含有序列号3所示的碱基序列中的 第508位～第539位的碱基的碱基长为32～50碱基的碱基序列的互补链具 有至少80％以上的同一性、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的 区域的寡核苷酸。所述P12’寡核苷酸也可以是与含有序列号3所示的碱基 序列中的第508位～第539位的碱基的碱基长为32～50的碱基序列在严谨 条件下杂交、并且扩增含有序列号3中的第501位的碱基的区域的寡核苷 酸。

以下示出在本发明的多态性检测方法中，能够用于扩增含有所述序列 号3中的第501位的碱基(r)的区域的引物的示例。

P11F引物(序列号26)(CYP3A4-1B-F1)

5′-ctgtaggtgtggcttgttgggatgaa-3′

P12R引物(序列号27)(CYP3A4-1B-R1)

5′-ggagccattggcataaaatctattaaatcgc-3′

另外，为了检测所述序列号3中的第501位的碱基(r)的多态性，优 选将所述P11或P11’所示的寡核苷酸和P12或P12’所示的寡核苷酸，作为 一对引物对使用。

所述P6、P7、P8、P9、P10、P11和P12中，所述同一性例如也可以 显示出85％以上的同一性，90％以上的同一性，95％以上的同一性，96％ 以上的同一性，97％以上的同一性，98％以上的同一性或99％以上的同一 性。

本发明中的引物可以是含有所述寡核苷酸的引物，也可以是由所述寡 核苷酸构成的引物。前者的情况下，本发明的引物例如可以在所述寡核苷 酸的3’末端和5’末端的至少一者上具有添加序列。所述添加序列无特别限 制，其长度例如为1～20碱基长、3～15碱基长、5～10碱基长等，其GC 含量例如为20～80％左右、40～70％左右、40～60％左右。

本发明的多态性的检测方法只要是将所述荧光标记核苷酸用作探针的 方法即可，无特别限制。下面说明利用了Tm分析的多态性检测方法，作 为将所述荧光标记核苷酸用作探针的多态性检测方法的一个示例。

<多态性检测方法>

本发明涉及的CYP3A基因多态性检测方法使用至少一种所述CYP3A 基因多态性检测用探针来检测CYP3A基因的多态性。根据本发明涉及的 多态性检测方法，能够通过使用至少一种所述多态性检测用探针，来简便 并高灵敏度地检测CYP3A基因的多态性。

本发明的多态性检测方法是检测CYP3A基因中的多态性的方法，能 够包括下述步骤(I)～(IV)，也可以包括下述步骤(V)。此外，本发 明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的结构 和条件不限于以下的记载。

(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述 多态性检测用探针和所述单链核酸杂交来获得杂交体形成体。

(II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，来使所述杂交 体形成体解离，并测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动。

(III)基于所述荧光信号的变动来测定Tm值，该Tm值是杂交体形 成体的解离温度。

(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的、CYP3A基 因中的多态性的存在。

(V)基于所述多态性的存在，检测所述试样中的单链核酸中的、具 有多态性的单链核酸的丰度比。

另外，在本发明中，除了所述步骤(I)～(IV)或所述步骤(I)～ (V)之外，还可以包括在步骤(I)之前或者与步骤(I)同时扩增核酸。 此外，在所述(III)中测定Tm值时，例如，不仅测定杂交体形成体的解 离温度，还可以包括测定在杂交形成体熔解时根据温度而变动的荧光信号 的微分值的大小。

在本发明中，所述试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。 在所述核酸为双链核酸的情况下，例如优选包括：在与所述荧光标记寡核 苷酸杂交之前，通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核 酸。通过将双链核酸解离成单链核酸，可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂 交。

在本发明中，试样中包含的作为检测对象的核酸例如可以是生物试样 中本来含有的核酸，但优选以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过 PCR等扩增法扩增含有CYP3A基因的突变了的位点的区域而得到的扩增 产物，因为这样能够提高检测精度。所述扩增产物的长度无特别限制，例 如可以设为50～1000碱基(mer)或者80～200碱基。另外，试样中的核 酸例如可以是源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR (Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。

在本发明中，本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的 添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA，例如可以为1倍 以下。另外，从确保充分的检测信号的观点来说，可以将本发明的多态性 检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以 下。这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核 酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检 测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检 测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样中的核酸中的所述检测对象核 酸的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对 象序列的扩增产物)可使所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)为 10倍以下。另外，可以将所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)相 对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，设为5倍以下或3 倍以下。另外，其下限无特别限制，但是可以设为0.001倍以上，0.01倍 以上或0.1倍以上。

本发明的多态性检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是 相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。

本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定可以基 于前述那样的原理，通过260nm的吸光度测定来进行，优选测定如下信 号：所述信号是基于所述多态性检测用探针上添加的标记的信号的信号， 并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体的形成状态 而变动。因此，优选使用前述的荧光标记寡核苷酸来作为所述多态性检测 用探针。所述荧光标记寡核苷酸例如可以是与靶标序列(互补序列)杂交 时的荧光强度比未与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度减少(淬 灭)的荧光标记寡核苷酸，或者与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标 序列(互补序列)杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。

如果是前者那样的探针，例如，在该探针和检测对象序列形成了杂交 体(双链核酸DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热探 针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。另外，如果是后者的探 针，例如通过与如检测对象序列形成杂交体(双链核酸DNA)而显示荧 光信号，通过加热而探针解离时荧光信号减少(消失)。因此，通过在所 述荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号 的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地，确定熔解的发生以及 Tm值。

接着，举出具体例来说明检测基于荧光染料的信号的变化的方法，即 本发明的多态性检测方法。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使 用所述多态性检测用探针，其他的步骤和条件没有任何限制。

作为含有进行核酸扩增时的模板的试样，只要是含有核酸尤其是 CYP3A基因即可，无特别限制。例如大肠或肺等的组织、白血球细胞等血 球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等的体细胞、 生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜 液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此 外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采 用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使 用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。例如，在将全血 作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组 DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic  Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。

接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记 寡核苷酸的多态性检测用探针。所述多态性检测用探针可以添加到含有分 离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA 混合。所述溶剂无特别限制，例如可以是Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、 MgCl₂、MgSO₄、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。

所述多态性检测用探针的添加时机无特别限制，例如在进行后述的 PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物 中，也可以在扩增处理前添加。在利用PCR等进行扩增处理前添加所述检 测用探针的情况下，例如，如前所述，优选在所述检测用探针的3’末端添 加荧光染料，或者添加磷酸基。

作为核酸扩增的方法，例如可以为利用聚合酶的方法等。作为其示 例，有PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过使用聚合酶 的方法进行扩增的情况下，优选在本发明探针存在的情况下进行扩增。根 据使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等，对本领域技术人员来说 是容易的。由此，在核酸扩增后分析探针的Tm值即可评价多态性，因此 在反应结束之后，不需要处理扩增产物。由此，不用担心所述扩增产物带 来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因 此不需要移动容器，容易自动化。

另外，作为使用PCR法的DNA聚合酶，无特别限制，可以使用通常 所用的DNA聚合酶。例如可以为GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。 作为聚合酶的使用量无特别限制，例如可以采用通常使用的浓度。例如， 在使用Taq聚合酶的情况下，相对于反应溶液量50μl，例如可以为 0.01U～100U的浓度。由此，具有CYP3A基因多态性的检测灵敏度变高 等的倾向。

另外，PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。此外，在扩 增时，例如也可以通过实时PCR来监视扩增，调查试样中包含的DNA (检测对象序列)的拷贝数。即，随着DNA(检测对象序列)通过PCR 而扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光强度发生变动。通过对 此进行监视，能够评价试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变 DNA)的拷贝数和丰度比。

在本发明的多态性检测方法中，使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的 单链核酸接触，来使两者杂交。试样中的单链核酸例如可以通过将前述那 样得到的PCR扩增产物解离而制备。

所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度无特别限制，可以 为所述扩增产物能够解离的温度。所述温度例如为85～95℃。加热时间也 无特别限制。加热时间例如可以为1秒～10分，或1秒～5分。

另外，解离的单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在 所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件 例如为40～50℃。

杂交步骤的反应液中的各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体 例，所述反应液中的DNA的浓度例如可以为0.01μmol/L～1μmol/L，或 0.1μmol/L～0.5μmol/L。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于 所述DNA的添加比例的范围，例如可以为0.001μmol/L～10μmol/L，或 0.001μmol/L～1μmol/L。

然后，将所得的所述单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交体形 成体慢慢加热，测定随温度上升的荧光信号的变动。例如，在使用QProbe 的情况下，在其与单链DNA杂交的状态下，与解离状态相比荧光强度减 少(或淬灭)。因此，例如只要将荧光减少(或淬灭)的杂交体形成体慢 慢加热，测定随温度上升的荧光强度的增加即可。

测定荧光强度变动时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室 温～85℃，或25～70℃。结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的 上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/ 秒。

接着，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧 光强度计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确 定为Tm值。另外，可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加 量/t)最高的点确定为Tm值。此外，在标记探针采用由于杂交体形成而信 号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减 少量即可。

另外，本发明中，如前所述，对杂交体形成体进行加热，并测定伴随 温度上升的荧光信号变动(优选的是荧光强度的增加)，但是替代该方 法，例如也可以检测杂交体形成时的信号变动。即，检测降低添加了所述 探针的试样的温度来形成杂交体形成体时的随所述温度下降的荧光信号变 动。

作为具体例，在使用QProbe的情况下，当在试样中添加了所述探针 时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交 体形成体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加 热的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。另一方面，在 使用由于杂交体形成而信号增加的标记探针的情况下，当在试样中添加了 所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭)，但是在 由于温度下降而形成杂交体时，荧光强度增加。因此，例如可以慢慢降低 所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的增加。

在本发明的多态性检测方法中，所述多态性检测用探针例如可以使用 任何一种，也可以并用两种以上。使用的所述多态性检测用探针的种类， 例如可以根据检测目标多态性而适当确定。本发明中，例如，可以仅检测 CYP3A5*3多态性，仅检测CYP3A4*16多态性，仅检测CYP3A4*1B多态 性，也可以在一个反应体系中检测任何两种或三种全部的多态性。另外， 可以在一个反应体系中检测所述CYP3A5*3多态性、CYP3A4*16多态性 和CYP3A4*1B多态性中的至少任一个和其他的多态性。

在本发明的多态性检测方法中，在并用两种以上所述多态性检测用探 针的情况下，例如各探针优选为具有不同的荧光染料的标记探针。所述不 同的荧光染料例如可以为检测条件不同的荧光染料。

作为在同一体系中检测多个基因多态性的方法，无特别限制。例如， 可以预先将能够检测各多态性的各探针混合，添加到试样中，也可以将能 够检测各多态性的各探针连续添加到含有单链核酸的试样中。这里，“体 系”是指使用含有由荧光标记寡核苷酸和单链核酸杂交的杂交体形成体的 试样形成的一个独立的反应体系。

<药效判定方法>

本发明的药效判定方法包括：通过前述的多态性检测方法检测 CYP3A基因的多态性；以及基于所述检测结果来判定对药剂的耐性或者药 剂的药效。

在所述多态性检测方法中，使用本发明中的多态性检测用探针，高灵 敏度并简便地检测CYP3A基因的多态性。因此，基于CYP3A基因中的该 多态性，可以高灵敏度并简便地进行药剂的判定。

另外，基于多态性的有无、突变序列和正常序列的丰度比，可以判断 针对药剂的耐性或药剂的药效。因而，本发明的药效判定方法在基于有无 突变、突变序列的丰度比来确定疾病的治疗方针中有用，例如增加药剂施 与量、改为其他治疗药等治疗方针的更改。作为所述判定对象的药剂，例 如可以为免疫抑制剂、分子靶向治疗药、抗抑郁药等，尤其可以为免疫抑 制剂和分子靶向治疗药。作为所述药剂的具体例，例如可以为tacrolimus 等免疫抑制剂。

CYP3A基因与具体药剂的耐性或药剂的药效的判定之间的关系是本领 域技术人员已知的，例如可以参见：

http://www.genemedrx.com/Cytochrome_P450_Metabolism_Table.php

例如，作为具体实例，可以给出以下的具体药剂：

<多态性检测用试剂盒>

用于检测本发明的CYP3A基因中的多态性的CYP3A基因多态性检测 用试剂盒包括前述的多态性检测用探针。

所述多态性检测用试剂盒通过含有能够简便且高灵敏度地检测 CYP3A基因中序列号1所示的序列中的第401位的碱基中的多态性、序列 号2所示的序列中的第201位的碱基中的多态性和/或序列号3所示序列中 第501位的碱基中的多态性的至少一种所述多态性检测用探针，具有能够 更简便地检测例如CYP3A基因的多态性等的倾向。

另外，本发明中的多态性检测用试剂盒也可以还包括用于扩增含有作 为前述的检测对象的CYP3A基因多态性的序列的引物。由此，本发明中 的多态性检测用试剂盒可以高精度地检测CYP3A基因的多态性。

此外，对于所述多态性检测用试剂盒中可以包含的所述探针和引物， 可以直接适用前述的事项。

在包含两种以上的荧光标记寡核苷酸作为所述多态性检测用探针的情 况下，各个荧光标记寡核苷酸可以以混合的状态被包含，也可以单独包含 各个荧光标记寡核苷酸。另外，在两种以上的本发明的探针以混合的状态 被包含在本发明的多态性检测用试剂盒中的情况、以及两种以上的本发明 的探针作为单独的试剂被包含但例如在使用时在相同的反应系中进行各荧 光标记寡核苷酸与各检测对象序列的Tm分析的情况下，优选两种以上的 各探针通过发光波长互不相同的荧光染料被标记。通过如此改变荧光物质 的种类，即使在相同的反应体系中也能够进行针对各个探针的检测。

另外，本发明中的检测用试剂盒除了所述探针之外，也可以还含有进 行本发明检测方法中的核酸扩增所需要的试剂类。另外，所述探针、所述 引物和其他试剂类，可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成混合物。

此外，“单独收容”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不 一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。

本发明的检测用试剂盒通过包括用于扩增含有多态性位点的序列(与 探针杂交的区域)的引物对，例如能够更高灵敏度地检测多态性。

另外，本发明的多态性检测用试剂盒优选含有使用说明书。所述使用 说明书例如可以是记载了使用所述多态性检测用探针对含有作为检测对象 的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测CYP3A基 因中的突变的使用说明书，或者是记载了检测用试剂盒中可包含或者添加 包含的各种试剂的使用说明书。

实施例

下面说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。

[实施例1]

在本例中，在野生型的被检核酸和突变型的被检核酸共存的情况下进 行Tm分析，并检测了CYP3A基因的CYP3A5*3多态性和CYP3A4*16多 态性。

准备稀释血液、精制基因组和质粒作为核酸试样。所述稀释血液如下 制备：将使用EDTA采血管采集的全血10μL和下述表2所示的稀释液1 70μL混合制备混合液，将所述混合液10μL和下述表2所示的稀释液2 70μL混合之后，再将其在95℃下加热10分钟。在所述全血中包含的被检 核酸中，CYP3A5*3多态性为野生型和突变型的杂合子，CYP3A4*16多态 性为野生型的纯合子。所述精制基因组利用常用方法由全血制备。在所述 精制基因组中，CYP3A5*3多态性为突变型的纯合子，CYP3A4*16多态性 为野生型的纯合子。作为所述质粒，准备了插入有作为CYP3A4基因的部 分序列的、序列号2中的碱基编号1～411的寡核苷酸的CYP3A4*16突变 型质粒。在所述CYP3A4*16突变型质粒中，序列号2中的碱基编号201 的碱基(s)为鸟嘌呤(g)。

【表2】

(稀释液1：70μl)

10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)

0.1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.3w/v％SDS

(稀释液2：70ul)

10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)

0.1mmol/L EDTA(pH8.0)

以下述所示的比例混合所述核酸试样，制备了下述试样1～4。

(试样)

制备了含有所述各试样的、50μL的PCR反应混合物。所述PCR反应 混合物通过将所述试样4μL和下述表3所示的PCR反应液的各成分混合成 以下的浓度而制备。对于所述PCR反应混合物，使用全自动SNPs检查装 置(商品名i-densy(注册商标)IS-5310、爱科来公司制)进行了PCR和 Tm分析。所述PCR如下进行：在95℃下处理1分钟之后，以95℃下1秒 和56℃下15秒为一个周期反复进行了50个周期。然后，进一步在95℃ 下处理了1秒，在40℃下处理了60秒。然后，接下来以1℃/3秒的温度上 升速度，将所述反应液从40℃加热到75℃，并通过测定与荧光染料对应 的检测波长下的、荧光强度随时间的变化来进行了Tm分析。另外，作为 对照，除了替代所述试样使用所述稀释液2之外，与前述同样地进行了 PCR和Tm分析。BODIPY FL的检测波长为520-555nm，TAMRA的检测 波长为585-700nm(以下相同)。

【表3】

以下示出所述CYP3A5*3用引物和CYP3A4*16用引物的序列。

(CYP3A5*3用引物)

F引物(序列号14)(CYP3A5*3F4)

5′-cgtatgtaccacccagcttaacg-3′

R引物(序列号15)(CYP3A5*3R4)

5′-cacaggagccacccaagg-3′

(CYP3A4*16用引物)

F引物(序列号16)(UO-F2)

5′-aggatggtaaaaaggtgctg-3′

R引物(序列号17)(UO-R3)

5′-gagagaaagaatggatccaaa-3′

所述CYP3A5*3用探针使用了下述序列的CYP3A5*3突变型探针。所 述CYP3A5*3用探针为用于CYP3A5*3突变型的CYP3A基因的反义链的 突变型探针。在所述序列中，下划线部分的碱基为相对于CYP3A5*3突变 型序列显示出同一性的碱基。所述CYP3A5*3用探针的3’末端用荧光染料 BODIPY FL进行了标记。所述CYP3A4*16用探针使用了下述序列的 CYP3A4*16突变型探针。所述CYP3A4*16用探针为CYP3A4*16突变型 的CYP3A基因的正义链用的突变型探针。在所述序列中，下划线部分的 碱基为与CYP3A4*16突变型序列互补的碱基。所述CYP3A4*16用探针的 3’末端用荧光染料TAMRA进行了标记。

CYP3A5*3用探针(序列号4)(3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21)

5′-ttgtctttcaGtatctcttcc-(BODIPY FL)-3′

CYP3A4*16用探针(序列号10)(U0-3TMR4)

5′-atgatgtgctaCtgatcacatccatgc-(TAMRA)-3′

图1A～图5B中示出了它们的结果。图1A～5B是示出随温度上升的 荧光强度的变化的Tm分析曲线图。图1A、1B为试样1的结果，图2A、 2B为试样2的结果，图3A、3B为试样3的结果，图4为试样4的结果， 图5A、5B为对照的结果。图1A、图2A、图3A和5A是关于CYP3A5*3 用探针的熔解曲线，图1B、图2B、图3B和5B是关于CYP3A4*16用探 针的熔解曲线。图4是关于CYP3A4*16用探针的熔解曲线。横轴表示测 定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下也称“荧光变化 量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。所述CYP3A5*3用探针与 CYP3A5*3野生型的Tm值在49℃附近，与CYP3A5*3突变型的Tm值在 56℃附近，所述CYP3A4*16用探针与CYP3A4*16野生型的Tm值在59℃ 附近，与CYP3A4*16突变型的Tm值在67℃附近。

如图1A所示，关于CYP3A5*3多态性，以杂合子的形式具有野生型 和突变型的试样1在野生型和突变型的Tm值处，分别确认了峰。如图1B 所示，关于CYP3A4*16多态性，以纯合子的形式具有野生型的试样1仅 在野生型的Tm值处确认了峰。

如图2A所示，关于CYP3A5*3多态性，以纯合子的形式具有突变型 的试样2仅在突变型的Tm值处确认了峰。如图2B所示，关于 CYP3A4*16多态性，以纯合子的形式具有野生型的试样2仅在野生型的 Tm值处确认了峰。

如图3A所示，关于CYP3A5*3多态性，以纯合子的形式具有突变型 的试样3仅在突变型的Tm值处确认了峰。如图3B所示，关于 CYP3A4*16多态性，具有所述精制基因组的野生型和所述质粒的突变型的 试样3在野生型和突变型的Tm值处分别确认了峰。

如图4所示，关于CYP3A4*16多态性，以纯合子的形式具有突变型 的试样4仅在突变型的Tm值处确认了峰。此外，不具有含有CYP3A5*3 多态性的区域的碱基序列的试样4没有确认到CYP3A5*3的多态性的峰。

如图5A和5B所示，作为对照的稀释液2没有确认到两个峰。

[实施例2]

在本例中，使用与反义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人工 核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A4*16)。

制备了下述序列所示的、与序列号2中的碱基编号173～222互补的 突变型人工核酸(mt)和野生型人工核酸(wt)。所述序列中，下划线部 分对应于序列号2中的碱基编号201的碱基。将各人工核酸调节为 0.1μmol/L作为试样。

mt(序列号19)

TtcactccaratgatgtgctaCtgatcacatccatgctgtaggccccaaa

wt(序列号20)

ttcactccaratgatgtgctaGtgatcacatccatgctgtaggccccaaa

制备了含有所述各试样的、50μL的反应混合物。所述反应混合物通过 将下述表4所示的反应液的各成分混合成以下的浓度而制备。对于所述反 应混合物，使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(注册商标)IS- 5310、爱科来公司制)进行了Tm分析。所述Tm分析如下进行：将所述 反应液在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒之后，以1℃/3秒的温度上升 速度从40℃加热至75℃，并测定与荧光染料对应的检测波长处的、荧光 强度随时间的变化。

【表4】

所述探针使用了下述序列的CYP3A4*16突变型探针。所述探针是突 变型CYP3A4基因的反义链用的突变型探针。所述序列中，下划线部分的 碱基是相对于CYP3A4*16突变型序列显示出同一性的碱基。所述探针的 3’末端用荧光染料TAMRA进行了标记。

CYP3A4*16用突变型探针(序列号6)(3T-CYP3A4*16-MF1)

5′-gatgtgatcagtagc-(TAMRA)-3′

图6A和6B示出了它们的结果。图6A和6B是示出随温度上升的荧 光强度的变化的Tm分析曲线图。图6A是mt100％的结果，图6B是wt 100％的结果。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化 (以下也称“荧光变化量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。所 述CYP3A4*16突变型探针与mt的Tm值在60℃附近，与wt的Tm值在 53℃附近。

如图6A所示，关于mt，仅在mt的Tm值处确认了峰。另一方面，如 图6B所示，关于wt，仅在wt的Tm值处确认了峰。

[实施例3]

在本例中，使用与正义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人工 核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A4*16)。除 了使用以下示出的野生型人工核酸、突变型人工核酸和CYP3A4*16突变 型探针之外，与上述实施例2同样地进行了Tm分析。

制备了下述序列所示的、与序列号2中的碱基编号173～222同源的 突变型人工核酸(mt)和野生型人工核酸(wt)。所述序列中，下划线部 分对应于序列号2中的碱基编号201的碱基。将各人工核酸调节至 0.1μmol/L作为试样。

mt(序列号21)

tttggggcctacagcatggatgtgatcaGtagcacatcatytggagtgaa

wt(序列号22)

tttggggcctacagcatggatgtgatcaCtagcacatcatytggagtgaa

所述探针使用了下述序列的CYP3A4*16突变型探针。所述探针是突 变型的CYP3A4基因的正义链用的突变型探针。所述序列中，下划线部分 的碱基是与CYP3A4*16突变型序列互补的碱基。所述探针的3’末端用荧 光染料TAMRA进行了标记。

CYP3A4*16用探针(序列号8)(3T-CYP3A4*16-MR1)

5′-tgtgctactgatcacatcc-(TAMRA)-3′

它们的结果示于图7A和图7B。图7A和图7B是示出随温度上升的 荧光强度的变化的Tm分析曲线图。图7A是mt100％的结果，图7B是wt 100％的结果。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化 (以下也称“荧光变化量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。所 述CYP3A4*16突变型探针与mt的Tm值在75℃附近，与wt的Tm值在 68℃附近。

如图7A所示，关于mt，在mt的Tm值处确认了峰。另一方面，如图 7B所示，关于wt，仅在wt的Tm值处确认了峰。

[比较例1]

在本例中，使用了与正义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人 工核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A5*3)。除 了使用以下所示的野生型人工核酸、突变型人工核酸和CYP3A5*3突变型 探针之外，与所述实施例2同样地进行了Tm分析。

制备了下述序列所示的、与序列号1中的碱基编号379～428同源的 突变型人工核酸(mt)和野生型人工核酸(wt)。在下述序列中，下划线 部分对应于序列号1中的第401位的碱基。将各人工核酸调节至0.1μmol/L 作为试样。

mt(序列号23)

taaagagctcttttgtctttcaAtatctcttccctgtttggaccacatta

wt(序列号24)

taaagagctcttttgtctttcaGtatctcttccctgtttggaccacatta

所述探针使用了下述序列的CYP3A5*3突变型探针。所述探针是突变 型的CYP3A5基因的正义链用的突变型探针。在所述序列中，下划线部分 的碱基是与CYP3A5*3突变型序列互补的碱基。所述CYP3A5*3突变型探 针的3’末端用荧光染料TAMRA进行了标记。

CYP3A5*3突变型探针(序列号25)(5T-CYP3A5*3-mt-R1-22)

5′-(TAMRA)-cagggaagagataCtgaaagac-P-3′

其结果示于图8A和图8B。图8A和图8B是示出随温度上升的荧光 强度的变化的Tm分析曲线图。图8A是mt 100％的结果，图8B是wt 100％的结果。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化 (以下也称“荧光变化量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。

如图8A和8B所示，mt和wt均没有确认到清楚的峰。

[比较例2]

在本例中，使用了与正义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人 工核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A4*16)。 除了使用以下示出的CYP3A4*16突变型探针之外，与所述实施例3同样 地进行了Tm分析。

所述探针使用了下述序列的CYP3A4*16突变型探针。所述探针是突 变型的CYP3A4基因的正义链用的突变型探针。在所述序列中，下划线部 分的碱基是与CYP3A4*16突变型序列互补的碱基。所述CYP3A4*16突变 型探针的3’末端用荧光染料TAMRA进行了标记。

CYP3A4*16突变型探针(序列号9)(U0-3TMR2)

5′-ctaCtgatcacatccatgctg-(TAMRA)-3′

其结果示于图9A和图9B。图9A和图9B是示出随温度上升的荧光 强度的变化的Tm分析曲线图。图9A是mt100％的结果，图9B是wt 100％的结果。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化 (以下也称“荧光变化量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。

如图9A所示，关于mt，仅在mt的Tm值处确认了峰。另一方面，如 图9B所示，wt没有确认到峰。

[实施例4]

在本例中，使用了同一反应液检测了CYP3A4基因的CYP3A4*1B、 CYP3A4*16和CYP3A5*3的多态性。

准备精制基因组、质粒和经前处理的全血作为核酸试样。所述精制基 因组通过常用方法由使用EDTA采血管采集的全血制备，并将其调节为 400拷贝/μL作为试样使用。作为所述质粒，准备了插入有作为CYP3A4 基因的部分序列的、序列号3中的碱基编号366～651的寡核苷酸的 CYP3A4*1B突变型质粒、以及插入有作为CYP3A4基因的部分序列的、 序列号2中的碱基编号1～411的寡核苷酸的CYP3A4*16突变型质粒。在 前者的CYP3A4*1B突变型质粒中，使序列号3中的碱基编号501为突变 型(g)，在后者的CYP3A4*16突变型质粒中，使序列号2中的碱基编号 201为突变型(g)。将各质粒分别调节至2000拷贝/μL后各混合0.5μL作 为试样使用。所述经前处理的全血如下制备：通过将与制备所述精制基因 组是使用的全血相同的所述全血10μL和所述表2所示的稀释液170μL混 合而制备混合液，将所述混合液10μL和所述表2所示的稀释液270μL混 合之后，再将其在95℃下加热10分钟。在所述全血中包含的被检核酸 中，CYP3A4*1B多态性为野生型的纯合子，CYP3A5*3多态性为野生型 和突变型的杂合子，CYP3A4*16多态性为野生型的纯合子。

制备了含有所述各试样的、50μL的PCR反应混合物。所述PCR反应 混合物通过将所述试样和下述表5所示的PCR反应液的各成分混合成以下 的浓度而制备。在所述PCR反应混合物中，精制基因组试样的浓度为 2×106copy/L(拷贝/L)，质粒试样的浓度为2×107copy/L，全血试样为 5.3mL/L。对于所述PCR反应混合物，使用全自动SNPs检查装置(商品 名i-densy(注册商标)IS-5310，爱科来公司制)进行了PCR和Tm分 析。所述PCR如下进行：在95℃下处理1分钟之后，以95℃下1秒和58 ℃下30秒为一个周期反复进行了50个周期。然后，进一步在95℃下处理 1秒、40℃下处理60秒之后，以1℃/3秒的温度上升速度将所述反应液从 40℃加热到75℃，测定与荧光染料对应的检测波长处的、荧光强度随时间 的变化，由此进行了Tm分析。另外，作为对照，除了替代所述试样使用 所述稀释液2之外，与前述同样地进行了PCR和Tm分析。Pacific Blue的 检测波长为445-480nm，BODIPY FL的检测波长为520-555nm，TAMRA 的检测波长为585-700nm。

【表5】

以下示出所述CYP3A4*1B用的引物和探针的序列。

(CYP3A4*1B用引物)

F引物(序列号26)(CYP3A4-1B-F1)

5′-ctgtaggtgtggcttgttgggatgaa-3′

R引物(序列号27)(CYP3A4-1B-R1)

5′-ggagccattggcataaaatctattaaatcgc-3′

(CYP3A4*1B用探针)

突变型探针(序列号12)(3PB-CYP3A4*1B-R3)

5′-taaatcgccGctctcctgccc-(Pacific Blue)-3′

以下示出所述CYP3A4*16用的引物和探针的序列。

(CYP3A4*16用引物)

F引物(序列号18)(CYP3A4*16-F6+CTAGA)

5′-ctagaggagtgtgatagaaggtgatctagtaga-3′

R引物(序列号28)(U0-R3+GACGA)

5′-GACGAgagagaaagaatggatccaaa-3′

(CYP3A4*16用探针)

突变型探针(序列号6)(3T-CYP3A4*16-MF1)

5′-gatgtgatcaGtagc-(TAMRA)-3′

以下示出所述CYP3A5*3用的引物和探针的序列。

(CYP3A5*3用引物)

F引物(序列号14)(CYP3A5*3F4)

5′-cgtatgtaccacccagcttaacg-3′

R引物(序列号15)(CYP3A5*3R4)

5′-cacaggagccacccaagg-3′

(CYP3A5*3用探针)

突变型探针(序列号4)(3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21)

5′-ttgtctttcaGtatctcttcc-(BODIPY FL)-3′

它们的结果示于图10A～12C。图10A～12C是示出随温度上升的荧 光强度的变化的Tm分析曲线图。图10A～10C是精制基因组的试样的结 果，图11A和11B是混合质粒的试样的结果，图12A～12C是经前处理的 全血的试样的结果。图10A和图12A是关于CYP3A4*1B用突变型探针的 熔解曲线，图10B和图12B是关于CYP3A5*3用突变型探针的熔解曲线， 图10C和图12C是关于CYP3A4*16用突变型探针的熔解曲线。图11A是 关于CYP3A4*1B用突变型探针的熔解曲线，图11B是关于CYP3A4*16 用突变型探针的熔解曲线。横轴表示测定是的温度(℃)，纵轴表示荧光 强度的变化(以下也称“荧光变化量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt” (dF/dt)。CYP3A4*1B突变型与CYP3A4*1B用突变型探针的Tm值在 61℃附近，CYP3A5*3突变型与CYP3A5*3用突变型探针的Tm值在56℃ 附近，CYP3A4*16突变型与CYP3A4*16用突变型探针的Tm值在53℃附 近。

如图10A所示，关于CYP3A4*1B多态性，作为野生型的纯合子的精 制基因组在比突变型的Tm值低的温度处确认了峰。如图10B所示，关于 CYP3A5*3多态性，野生型和突变型的杂合子的精制基因组在突变型的 Tm值以及比该Tm值低的温度处总共确认了两个峰。如图10C所示， CYP3A4*16多态性为野生型的纯合子的精制基因组在比突变型的Tm值低 的温度处确认了峰。

如图11A所示，关于CYP3A4*1B多态性，含有作为突变型的质粒的 试样仅在突变型的Tm值处确认了峰。如图11B所示，关于CYP3A4*16 多态性，含有作为突变型的质粒的试样仅在突变型的Tm值处确认了峰。 所述质粒试样由于不含CYP3A5*3多态性，因此没有确认到峰。

如图12A所示，关于CYP3A4*1B多态性，作为野生型的纯合子的经 处理的全血在比突变型的Tm值低的温度处确认了峰。如图12B所示，关 于CYP3A5*3多态性，作为野生型和突变型的杂合子的经处理的全血在突 变型的Tm值以及比该Tm值低的温度处总共确认了两个峰。如图12C所 示，关于CYP3A4*16多态性，作为野生型的纯合子的经前处理的全血在 比突变型的Tm值低的温度处确认了峰。

[实施例5]

在本例中，使用与正义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人工 核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A4*1B)。

作为正义链的人工核酸，制备了下述序列所示的、与序列号3中的碱 基编号482～521同源的野生型人工核酸(WT1)和突变型人工核酸(mt1- 1、mt1-2)。在所述序列中，下划线部分与序列号3中的碱基编号501的 碱基对应。在所述序列中，小写字母的碱基取代为与序列号3不同的碱 基。将所述各人工核酸调节成0.1μmol/L。

WT1(序列号29)(CYP3A4*1B-WT-F)

AGCCATAGAGACAAGGGCAAGAGAGgGGCGATTTAATAGA

mt1-1(序列号30)(CYP3A4*1B-mt1-F)

AGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGAGaGGCGATTTAATAGA

mt1-2(序列号31)(CYP3A4*1B-mt2-F)

AGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGAGgGGCGATTTAATAGA

制备了含有所述各人工核酸的、50μL的反应混合物。所述反应混合物 通过将下述表6所示的反应液的各成分混合成以下的浓度而制备。对于所 述反应混合物，使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(注册商标) IS-5310、爱科来公司制)进行了Tm分析。所述Tm分析如下进行：将所 述反应液在95℃处理1秒、40℃处理60秒之后，以1℃/3秒的温度上升速 度从40℃加热到75℃，并测定与荧光染料对应的检测波长处的、荧光强 度随时间的变化。Pacific Blue的检测波长设为445-480nm。

【表6】

使用下述序列的CYP3A4*1B突变型探针作为所述探针。所述探针是 用于突变型的CYP3A4基因的正义链的突变型探针。在所述序列中，下划 线部分的碱基是与CYP3A4*1B突变型序列互补的碱基。

CYP3A4*1B用探针(序列号12)(3PB-CYP3A4*1B-R3)

5′-taaatcgccGctctcctgccc-(Pacific Blue)-3′

[比较例3]

(比较例3-1)

在本例中，使用与正义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人工 核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A4*1B)。

使用下述序列的探针作为所述CYP3A4*1B用探针。所述探针是野生 型的CYP3A4基因的正义链用的野生型探针。在所述序列中，下划线部分 的碱基是与CYP3A4*1B突变型序列互补的碱基。

探针3-1(序列号32)(5PB-CYP3A4*1B-R1)

5′-(Pacific Blue)-ctctcttgcccttgt-3′

除了使用所述探针3-1作为所述CYP3A4*1B用探针之外，与所述实 施例5同样地进行了Tm分析。

(比较例3-2)

在本例中，使用与反义链杂交的探针对野生型人工核酸和突变型人工 核酸进行Tm分析，并检测了CYP3A基因的多态性(CYP3A4*1B)。

作为反义链的人工核酸，制备了下述序列所示的、与序列号3中的碱 基编号482～521互补的野生型人工核酸(WT2)和突变型人工核酸(mt2- 1、mt2-2)。在所述序列中，下划线部分与序列号3中的碱基编号501的 碱基对应。将所述各人工核酸调节为0.1μmol/L。

WT2(序列号33)(CYP3A4*1B-WT-R)

tctattaaatcgccCctctcttgcccttgtctctatggct

mt2-1(序列号34)(CYP3A4*1B-mt1-R)

tctattaaatcgccTctctcctgcccttgtctctatggct

mt2-2(序列号35)(CYP3A4*1B-mt2-R)

tctattaaatcgccCctctcctgcccttgtctctatggct

使用下述序列的探针2-2作为所述CYP3A4*1B用探针。所述探针是 野生型的CYP3A4基因的反义链用的野生型探针。在所述序列中，下划线 部分的碱基是相对于CYP3A4*1B野生型序列显示出同一性的碱基。

探针2-2(序列号36)(5PB-CYP3A4*1B-F1)

5′-(Pacific Blue)-CAAGGGCAAGAGAGAG-3′

除了使用所述WT2作为所述野生型人工核酸、使用所述mt2-1或 mt2-2作为所述突变型人工核酸、使用所述探针2-2作为CYP3A4*1B用探 针之外，与所述实施例5同样地进行了Tm分析。

它们的结果示于图13A～15。图13A～15是示出随温度上升的荧光强 度的变化的Tm分析曲线图。图13A和13B是实施例5的结果，图14是 比较例3-1的结果，图15是比较例3-2的结果。横轴表示测定时的温度 (℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下也称“荧光变化量”)，单位为“d 荧光强度增加量/dt”(dF/dt)。

如图13A和图13B所示，在实施例5中，在向PCR反应液中添加了 WT1和mt1-1或者WT1和mt1-2的情况下，在mt1-1(64℃)或mt1-2 (64℃)中的一者以及WT1(55℃)中均确认了峰。另一方面，如图14 所示，在比较例3-1中，在向PCR反应液中添加了WT1和mt1-1的情况 下，WT1和mt1-1的峰重叠，另外，在添加WT1和mt1-2的情况下，没 有确认到WT1和mt1-2的峰。另外，如图15所示，在比较例3-2中，在 向PCR反应液添加了WT2和mt2-2的情况下，WT2和mt2-2的峰重叠， 另外，在添加了WT2和mt2-1的情况下，没有确认到WT2和mt2-1的 峰。

如上所述，根据本发明，能够以高灵敏度且简便地检测CYP3A基因 中的多态性。

根据本发明的多态性检测方法，能够提供可高灵敏度且简便地检测 CYP3A的多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另 外，本发明能够提供使用了该多态性检测方法的药效评价方法。另外，本 发明还能够提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。

本发明可以在不脱离其精神或实质特点的情况下以其他形式实现。本 申请中公开的实施例旨在作为说明在各个方面考虑并且并非限制性的。本 发明的范围由所附权利要求而不是由前述说明书指出，并且权利要求的含 义之内以及权利要求的等价范围之内的所有改变均包含在内。