一种用于改良感病水稻品种黑条矮缩病抗性的引物和方法

摘要

本发明提供了水稻黑条矮缩病抗性主效QTL——qRBSDV-6的紧密连锁SSR分子标记及利用标记辅助选择改良感病水稻品种抗性的方法。对以明恢63作抗源，与感病受体亲本杂交、回交的衍生后代分离群体，针对来自于明恢63的第6染色体短臂上的黑条矮缩病抗性主效QTL——qRBSDV-6，通过检测其双侧紧密连锁标记RM7158、RM587的基因型，可将其成功导入感病品种的遗传背景中，有效提高其黑条矮缩病抗性，选择效率达到92.31%。该方法操作简单，快捷高效，为水稻黑条矮缩病的抗性改良提供了一种有效方法。

说明书

技术领域

    本发明针对水稻黑条矮缩病主效抗性QTL——qRBSDV-6，提供了一种利用其紧密连锁分子标记进行辅助选择而改良水稻品种黑条矮缩病抗性的方法，属于分子遗传学领域。

背景技术

水稻黑条矮缩病是一种主要由灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallèn）充当媒介而传播的病毒病，感病植株一般表现严重矮缩、叶色浓绿、叶片背部叶脉出现短线白色条纹、不能抽穗或包颈穗、穗粒形变小甚至畸形而显著影响经济产量等症状。由于水稻一旦感染该病毒便无法防治，因而被喻之为水稻“癌症”。该病害上世纪60年代在中国首次发生，近年来，随着耕作制度的变化及暖冬年份的持续出现，黑条矮缩病在浙江、江苏、上海等地重新猖獗流行，局部地区严重发生，而生产上应用的绝大多数品种对该病害均表现感病，给水稻生产造成巨大危害。

目前，虽然没有发现对黑条矮缩病表现免疫的水稻种质，有关其抗性遗传、育种研究的报道也较少，但已有报道表明不同类型水稻品种对黑条矮缩病的抗性有明显差异。本研究小组利用“珍汕97/明恢63”的重组自交系群体，通过2个发病区的自然接种鉴定，分别在第6、7、9和11染色体上检测到6个水稻黑条矮缩病的抗性QTL，均来自于亲本明恢63，尤其是第6染色体上R2869-Waxy区间定位的2个紧密连锁的QTL（因为是初步定位，究竟是一个效应较大的QTL，还是两个紧密连锁的QTL还不能确定，将其初步命名为qRBSDV-6），具有LOD值大、效应显著等特点，具有重要育种价值（潘存红、李爱宏等，水稻黑条矮缩病抗性QTL分析，作物学报，2009，35（12）：1-5）。

生产上目前对水稻黑条矮缩病的防治主要结合耕作制度调整、栽培技术改进以及适期防治病虫害等，但往往难以达到预期效果，且对环境造成较大污染。培育抗病品种是防治各类病害最经济、有效的手段，具有重要理论和实践意义。针对定位的主效抗性QTL，通过分子标记辅助选择的方法，将其导入感病品种的遗传背景中，可有效改良其抗性。

发明内容

本发明的目的是针对第6染色体短臂上的黑条矮缩病主效抗性QTL——qRBSDV-6，提供了其基于PCR技术基础上的双侧紧密连锁分子标记，通过分子标记辅助选择，将其导入感病品种的遗传背景中而改良其黑条矮缩病抗性的方法。

qRBSDV-6初步定位在标记R2869与Waxy之间，由于R2869和Waxy都是RFLP标记，若直接应用于标记辅助选择，存在工作量大、操作烦琐等缺点，因而我们根据上述标记在水稻日本晴基因组序列中的物理位置（RGP网站，http：//rgp.dna.afrc.go.jp/)），结合Gramene网站（http://www.gramene.org）上公布的水稻SSR标记，在标记R2869与Waxy的外侧筛选了2个在抗性QTL供体亲本明恢63与部分感病亲本（如淮稻5号、武陵粳1号、扬粳9538等）间具有良好多态性的SSR标记RM7158和RM587，用于目标抗性QTL（qRBSDV-6）的分子标记辅助选择。

本发明公开了水稻SSR标记RM7158和RM587在水稻品种黑条矮缩病抗性分子标记辅助选择中的应用。

本发明提供的分子标记RM7158和RM587，分别由下列引物对经PCR扩增获得： 

1）标记引物RM7158，

正向引物序列，5’-CGTCCATGGACTTGTTAGC-3’（SEQ ID NO.1）

反向引物序列，5’-ACGGATACGCCATCCACAT-3’ （SEQ ID NO.2）；

2）标记引物RM587，

正向引物序列，5’-ACGCGAACAAATTAACAGCC-3’ （SEQ ID NO.3）

反向引物序列，5’-CTTTGCTACCAGTAGATCCAGC-3’ （SEQ ID NO.4）。

上述标记中，RM7158在抗性QTL供体亲本明恢63中的扩增产物是128 bp，而在感病亲本中的扩增产物是144 bp；RM587在抗性QTL供体亲本明恢63中的扩增产物是222 bp，而在感病亲本中的扩增产物是210bp。

本发明还提供了分子标记辅助选择改良水稻品种黑条矮缩病的方法，是对以明恢63作抗源，通过杂交或回交等方法获得的衍生分离群体植株，以待检测水稻的基因组DNA为模板，由标记RM7158和RM587的2对引物进行PCR扩增，如待检测水稻的扩增产物中分别有128 bp和222 bp大小的条带，则该水稻植株携带有目标抗性QTL“qRBSDV-6”。

DNA的提取采用常规的CTAB法（Murray & Thompson, 1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8:4321-4325）。

PCR反应在EPPENDORF梯度PCR仪（型号：Mastercycler Pro）上进行，扩增产物在3%的琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙淀（EB）染色后，BIO-RAD凝胶成像仪（型号：Gel Doc XR）紫外灯下扫描拍照和分析。

所述PCR扩增体系为：0.2 μmol L^-1的正、反向引物各1.5 μL，200 μmol L^-1的dNTPs 2 μL，10×PCR buffer 2 μL，50~100 ng的DNA模板2 μL，1 U μL^-1的Tag酶0.3 μL，ddH₂O 10.7 μL。

所述PCR反应条件为：94°C预变性5 min，94°C变性1 min，55°C复性1 min，72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸5 min。

本发明的有益效果：

1）通过本发明首次用SSR标记限定了水稻品种明恢63中黑条矮缩病主效抗性QTL“qRBSDV-6”；

2）本发明分子标记限定的主效抗性QTL“qRBSDV-6”位置明确，鉴定方便。通过检测与该抗性QTL紧密连锁的分子标记，可以预测水稻植株是否含又目标抗性QTL，进而筛选黑条矮缩病抗性单株或品系用于水稻育种。其检测方法方便快捷，不受环境影响，加速目标品种培育进程。

附图说明

图1为本发明提供的分子标记RM7158、RM587对明恢63作供体、淮稻5号为轮回亲本的BC₃F₃世代株系的检测结果。图中，P1：明恢63；P2：淮稻5号；1-18：BC₃F₃世代不同基因型株系；R1：纯合抗病基因型；S3：纯合感病基因型。

具体实施方式

以下实例结合附图进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明范围。

本发明实施例中所用水稻品种均有现在品种，其中淮稻5号由该品种选育单位江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所提供；明恢63由该品种选育单位福建省三明市农科所提供；武陵粳1号由该品种选育单位扬州大学提供。

实施例1：

1）淮稻5号遗传背景下携带“qRBSDV-6”的近等基因系构建

以高度感病的“淮稻5号”为母本，与供体亲本“明恢63”杂交获得F₁，然后以“淮稻5号”为轮回亲本进行连续回交，从BC₁F₁分离世代开始，针对不同水稻单株，利用本发明提供的目标抗性QTL“qRBSDV-6”两侧的SSR标记RM7158和RM587进行基因型检测。DNA的提取采用常规的CTAB法。

PCR扩增体系为：0.2 μmol L^-1的正、反向引物各1.5 μL，200 μmol L^-1的dNTPs 2 μL，10×PCR buffer 2 μL，50~100 ng的DNA模板2 μL，1 U μL^-1的Tag酶0.3 μL，ddH₂O 10.7 μL。

PCR反应条件为：94°C预变性5 min，94°C变性1 min，55°C复性1 min，72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸5 min。

选择两标记均为杂合带型且农艺性状与轮回亲本接近的单株进行回交，经过连续3次回交获得BC₃F₁后代后（扬州、海南一年两季加代），进行自交，BC₃F₂分离世代选择双侧标记均为纯合抗性基因型且农艺性状优良的单株18个（图1），BC₃F₃世代种植成株系，经农艺性状鉴别与评价，最终确定13个与轮回亲本最为接近的株系用于后续的黑条矮缩病抗性鉴定。

2）获得的近等基因系的黑条矮缩病抗性鉴定与评价

2011年正季，在扬州市湾头镇里下河地区农科所试验基地对上述13个近等基因系及对照分两个播期进行自然诱发鉴定，以穴发病率来评价其抗性水平（其方法参见：李爱宏、戴正元等，不同基因型水稻种质对黑条矮缩病抗性的初步分析，扬州大学学报（农业与生命科学版），2008，29（3）：18-22）。结果显示，两个感病对照淮稻5号、武陵粳1号在2个播期的自然鉴定试验中发病率均超过50%，表明发病情况充分。方差分析显示培育的近等基因系其抗性与轮回亲本“淮稻5号”相比有显著改良（表1），5月5日播种的近等基因系，除MTJ-12外，其余12个株系其黑条矮缩病发病率一般在20-30%之间，较“淮稻5号”56%左右的发病率下降25%左右；5月12日播种的近等基因系，同样除MTJ-12外，其余株系发病率一般在25-40%，发病率普遍比5月5日播种的提高约10%，同样，感病对照“淮稻5号”的发病率也明显上升，达到65.85%，大多数改良近等基因系的发病率仍然较轮回亲本下降25%左右，充分证明了目标QTL在育种实践中选择的有效性。

人工接种鉴定采用人工捕捉灰飞虱成虫接种的方法，将待鉴定株系在5月5日至15日之间播种，出苗后适当间苗，保持在120株左右的群体规模，用60目的尼龙丝网封罩。2叶期开始从周围秧田采集灰飞虱成虫，对其进行灰飞虱携毒率测定后（吕永平，雷娟利等， 水稻黑条矮缩病的RT-PCR检测，浙江农业学报，2002，14（2）：117-119），按每苗5头灰飞虱的虫量接种，每天人工搅动，5天后喷施杀虫剂，移栽到田间防虫网内。试验结果与两次分期自然诱发鉴定结果基本一致，相关系数达到0.88和0.87，验证了自然鉴定结果的可靠性。

 由于分子标记RM7158、RM587之间的距离较大，参照日本晴的基因组序列，两标记间的物理距离达到2000Kb左右，因而其间容易发生交换重组。株系MTJ-12虽然标记选择为阳性，两侧标记均为抗病基因型，但表现感病表型，可能与该株系两标记间染色体区段发生了交换重组有关。

本实例中，标记选择与抗性表型的吻合率达到92.31%，充分证明了本方法的有效性。

表1  不同近等基因系的黑条矮缩病抗性表现

同一列中不同小写字母表示在0.05水平的差异显著性。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏里下河地区农业科学研究所

 

<120>  一种用于改良感病水稻品种黑条矮缩病抗性的引物和方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cgtccatgga cttgttagc                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

acggatacgc catccacat                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acgcgaacaa attaacagcc                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ctttgctacc agtagatcca gc                                              22