与猪白细胞数相关的分子标记及应用

摘要

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪白细胞计数相关的分子标记及应用。所述的分子标记为SN基因的片段，其mRNA核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。在该序列表的第699bp处存在一个等位基因突变，即如附图4所示序列的第367位bp处存在一个367G-367A的突变，导致Hin6I-RFLP多态性。本发明还公开了扩增SN基因核苷酸序列所用的引物对及其多态性检测方法，本发明还包括制备的分子标记在猪白细胞数关联分析中的应用，猪的标记辅助选择提供了新的分子标记。

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪白细胞数相关的分子标记及应用。本发明 包括与猪白细胞数相关的SN基因变异位点的发现、检测方法及其在猪标记辅助选择中应用。

背景技术

近10年以来，现代育种技术使猪的生产性能(生长，胴体与肉质性状)得到了显著的改良，而对猪 健康及抵抗疾病能力的遗传改良却重视不够。疾病控制一直是畜牧业生产中的一项重要环节，提高管理水 平、改善卫生环境、注射药物和疫苗等预防性措施，在预防疾病发生中确实起了重要的作用。但它们都不 能从根本上解决预防疾病这个难题，提高机体的自然抗病力成了目前研究的重点，尤其是抗病育种。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom，PRRS)是由PRRSV引起怀孕母猪 发热、厌食、早产、晚期流产、死胎、弱仔和木乃伊胎儿等繁殖障碍，以及仔猪的呼吸系统症状和高死亡 率的接触性传染病(童光志等，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析.中国 预防兽医学报.2007，29(5)：323-327.)。自1987年该病首先在美国爆发以来，先后在加拿大、德国、法国、 意大利、波兰、丹麦、马耳他等欧美国家。该病给世界养猪业造成巨大的损失，国际兽医局(OIE)将该病列 为B类传染病。

sialoadhesin(Sn)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom Virus， PRRSV)的两个受体。目前已经证明PRRSV的受体有4个：Sn(Delputte P L等，Analysis of porcine  reproductive and respiratory syndrome virus attachment and internalization：distinctive roles for heparan sulphate  and sialoadhesin.J Gen Virol，2005，86(Pt 5)：1441-1445)，HS(heparan sulphate)(Delputte P L等，Involvement  of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike  receptor on porcine alveolar macrophages.2002，J Virol，76(9)：4312-4320)、CD151(Shanmukhappa K等，Role  of CD151，A tetraspanin，in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection.Virol J，2007，4：62)和 CD163分子(Calvert，J.G等，CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory  syndrome viruses.J Virol，2007，81(14)：7371-7379)。有囊膜的病毒通过病毒蛋白与细胞膜上的受体相互作 用，激活细胞内的信号通路，引起病毒粒子与细胞膜的融合，进入细胞，释放病毒基因组，进而在宿主细 胞内大量繁殖，引起细胞裂解和死亡，释放病毒粒子，完成感染过程。PRRSV首先与HS接触，但并不发 生病毒内化，在Sn的参与下，病毒大量的吸附细胞，并发生内化，进入宿主细胞。

Sn是PRRSV的一个重要受体，是Ⅰ型糖基化跨膜蛋白，属于Ig超家族中的一员，是一个具有17个 结构域的复杂蛋白，在病毒感染细胞的过程中介导病毒吸附和内化。研究表明，Sn蛋白的单克隆抗体可以 完全阻止PRRSV对细胞的感染。Sn蛋白N末端的结构域在PRRSV吸附病毒肺巨噬细胞的过程中有重要 作用(Delputte P L等，Porcine arterivirus attachment to the macrophage-specific receptor sialoadhesin is  dependent on the sialic acid-binding activity of the N-terminal immunoglobulin domain of sialoadhesin.J Virol. 2007，81(17)：9546-9550)。Tong-Qing An等(2009)构建了SN基因的一系列的突变体，发现只有Sn蛋白N 末端的19-150位氨基酸对于PRRSV吸附PK-15细胞有决定作用，缺失这段区域的蛋白突变体不能介导 病毒的吸附。

Sn蛋白参与了病毒吸附细胞和内化的过程，在病毒感染细胞过程中发挥着不可或缺的作用，对于感染 是必需的。研究该基因的变异位点在群体中的多态性，并与白细胞数进行关联分析，为把这个基因做为猪 白细胞数性状候选基因寻找证据，为分子育种提供素材。

发明内容

本发明的目的在于根据SN基因已知序列，寻找SN基因的变异位点以及基因多态性的检测方法，获得 一个与白细胞数相关的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

从猪SN基因片段中克隆得到一种作为猪标记辅助选择的与猪白细胞数相关的分子标记，它的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO：1和图2所示。在SEQ ID NO：1所示序列的第699位碱基处有一个碱基突变 (该等位基因的突变和碱基替换见图2的699位所示)，即在图4所示序列的第367位碱基处有一个 367G-367A的碱基突变，该突变位于第4外显子内，能够引起氨基酸精氨酸到组氨酸的改变，导致 Hin6I-RFLP多态性。

扩增SN基因部分mRNA的引物对，其核苷酸序列如下所示：

SN_CD3F 5′CTATGACTACTC AGGCAAGCG 3′

SN_CD3R 5′GGTGT CAGGCATCAG GCTC 3′

扩增SN基因部分DNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：

SN_SNPF 5′CGGCTGCTGTAGCTCTGATTG 3′

SN_SNPR 5′GCCTTGGCCTGGTTTCCTTA 3′

申请人提供了一种筛选猪白细胞数的分子标记的方法，按照以下步骤：

从NCBI数据库中的获取猪SN基因的mRNA信息，设计引物，扩增部分mRNA序列。分别提取“通 城猪”和“长白猪”肺组织的RNA，反转录成cDNA。根据设计的引物(SN_CD3F和SN_CD3R)，分别扩增“通 城猪”和“长白猪”肺组织SN基因的cDNA序列，克隆，测序。分析测序结果，在参照序列(Genebank 登录号DQ176853)的878位存在碱基G-A突变。NCBI数据库中调取SN基因组DNA信息设计引物(SN_SNPF 和SN_SNPR)，从猪血液中提取总DNA，PCR扩增，应用PCR-RFLP的方法检测该变异位点在群体中的多 态性，并初步进行该突变位点与猪白细胞数性状之间的关联分析。

本发明为猪的分子育种提供了新的分子标记。依照本发明，所述的猪白细胞数相关分子标记可应用在 猪标记辅助选择中。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的白细胞数相关SN基因的mRNA序列。

序列表SEQ ID NO：2-5是本发明所用引物对的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：6是本发明克隆与白细胞数相关分子标记的核苷酸序列。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：筛查SN基因SNPs的mRNA序列。在该序列的699bp处有一个699G-699A的碱基替换(括号内显 示该等位基因的替换)，导致Hin6I-RFLP多态性

图3：筛查SN基因SNPs的测序峰图(箭头所指碱基为说明中的碱基突变为位点)。其中：图3A是“通 城猪”肺脏cDNA扩增产物的部分测序结果图3B是“大白猪”肺脏cDNA扩增产物的部分测序结 果。

图4：本发明中猪SN基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段。所用的引物序列用下划线标注，突变位点用 斜体字和括号标出。

图5：是本发明中猪SN基因Hin6I-RFLP的三种基因型(GG AG AA)电泳结果。图中DNA分子量标准 DL2000。

具体实施方式

实施例1、SN基因SNPs的筛选

1.1引物设计

根据NCBI数据库中SN基因的mRNA信息(GenBank登录号：DQ176853)，在第2外显子和第7外 显子上设计一对引物，用来扩增“通城猪”(中国地方猪品种血缘，湖北省通城县地方品种商用品种，一 种公知公用的品种)和“长白猪”(引进的具有外国猪血缘的品种，华中农业大学国家家畜工程中心从美 国引进，一个大规模推广应用的外国商用猪品种)SN基因的mRNA.设计的引物对的核苷酸序列如下所示：

SN_CD3F 5′CTATGACTACTC AGGCAAGCG 3′，

SN_CD3R 5′GGTGT CAGGCATCAG GCTC 3′。

1.2PCR扩增

PCR反应总体积10μl，其中含“通城猪“和”长白猪“肺组织RNA反转录成cDNA约100ng，含1×PCR buffer(购自宝生物工程大连有限公司)，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，0.5U Taq  DNA聚合酶(购自宝生物工程大连有限公司)。

PCR扩增程序是：94℃4min，35×(94℃30s，56℃30s，72℃1min20s)，最后72℃延伸5min.PCR反 应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到1444bp特异扩增片段(见序列表SEQ ID NO：1)。

1.3PCR产物的纯化、克隆和测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff 管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司) 纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

连接反应：将纯化的PCR产物与载体pMD18-T(购自宝生物工程大连有限公司)连接，连接反应总 体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的载体，2μl的纯化PCR产物，灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中， 于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有100ml LB的试剂瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600 达到0.3～0.4时将试剂瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心 10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴 30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂和甘油重悬沉淀，置4℃ 保存备用。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀， 在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗 生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前涂布氨苄青霉素(50μg/ml)的LB 培养基琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

1.4单克隆的测序

挑取平板上的单菌落，接种于1ml LB中，37℃220r/min培养8h。取1μl菌液PCR扩增验证后，用 双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上对重组质粒采进行测序，序列测定由上海英俊生物技术有限公司 完成。用DNASTAR软件中的Seqman程序进行拼接和比对，发现在序列的第699位为一突变位点，(如图 2所示)。测序“通城猪”在该位点为A，“长白猪”为G.。

1.5DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information， http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的 DNA序列与GenBank数据库中公布的序列同源性比较，确认测序得到的序列为SN基因mRNA序列的一 部分。

实施例2SN基因PCR-RFLP诊断方法的建立

2.1引物序列

设计了一对包含第4外显子的用于扩增猪SN基因组序列的引物对，检测该变异位点在群体中的多态 性。该引物对名称和核苷酸序列如下所示：

SN_SNPF 5′CGGCTGCTGTAGCTCTGATTG 3′

SN_SNPR 5′GCCTTGGCCTGGTTTCCTTA 3′

2.2PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×PCR buffer(购自宝生物工程大连有限公司) dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，0.5U Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程大连有限公 司)。PCR扩增程序是：94℃3min，35×(94℃30s，61℃30s，72℃25s)，最后72℃延伸5min.PCR反应产物 用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到530bp特异扩增片段(如图4)，该片段中第367位碱基突变367G-367A 可造成Hin6I(G/CGC)酶切位点的丢失。

2.3PCR-RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物4μl，限制性内切酶Hin6I为0.1μl(2U)， 用灭菌双蒸水定容至10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴8h，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录 基因型，在凝胶成像系统中拍照。当第367bp位置是367A时，Hin6I酶切位点不存在，Hin6I酶切后检测 结果只有1个片段，其长度是530bp(定为等位基因A)，但存在367A-367G的替换时，其结果导致Hin6I 酶切位点的产生，得到2个片段，其长度分别为365bp和165bp(定为等位基因G)，三种基因型AA(530bp)， AG(530bp+365bp+165bp)，GG(365+165bp)如图5所示。

2.4本发明的分子标记在与猪免疫性状关联分析中的应用

试验共检测了145个猪个体：中国地方猪“通城猪”纯种26头，引进给外国血缘的“大白猪”纯种 31头，“长白猪”纯种27头，中国地方猪与外来猪的杂交猪“大长通”(大白猪×长白猪×通城猪)31头和 长大通(长白猪×大白猪×通城猪)30头的多态，确定其基因型，并进行基因突变位点与红细胞计数，白细 胞数，血清中IgG含量的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：y_ijk＝μ+G_i+C_j+B_k+ε_ijk，其中，y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，G_i为基因型效应，C_j为品种效应，B_k为批次效应，ε_ijk为随机误差，假定ε_ijk 相互独立，服从N(0，σ²)分布。基因型检测结果表明在145个个体中AA基因型有47个个体，AG基 因型有61个个体，GG基因型有37个个体。基因突变位点与性状关联分析的结果是：SN基因在Hin6I-RFLP 多态位点与血液中白细胞数量(WBC)含量显著相关(P＝0.0492)，AA基因型个体与GG基因型个体差 异显著(P＜0.05)(表1)，等位基因G与等位基因A在各个群体中的分布情况见表2，通过观察可以看出 在“通城猪”和“大白猪”中，A等位基因为优势等位基因，而在长白猪中，G等位基因为优势等位基因。

                表1.SN基因SNP与白细胞数关联分析结果

注：^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01。表中性状值为平均数±标准差。

                表2SN基因的SNP在群体中基因型频率和基因频率分布