紫云英根瘤菌高密度发酵工艺

摘要

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种为获得最高生物量而进行的紫云英根瘤菌高密度发酵工艺，特别是采用补加与原始发酵培养基不同C、N源的发酵工艺，本工艺获得的紫云英根瘤菌生物量可达130亿/mL以上。本发明的工艺方法是将生长至对数中后期的种子接种于YM培养基中，发酵罐装液量40～60％，接种量1～6％，控制罐温26～30℃，转速400～800rpm，发酵24～48h后进行第一次补料，生长至48～72h后进行第二次补料，第二次补料完成后继续发酵至60～84h结束发酵。补料成分为葡萄糖，终浓度0.5～1.5g/L；酵母粉，终浓度1～4g/L和蛋白胨，终浓度1～4g/L。本发明工艺简洁，效率优于现有技术，生产成本更低。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种紫云英根瘤菌高密度发酵工艺。

背景技术

紫云英是南方各省种植稻类作物所普遍应用的一种成本低廉的绿肥。近年来，随着农业 生产的持续发展，土地往往进行反复耕种，因而肥料来源需求量也越来越大，大力发展紫云 英绿肥或生物有机肥是解决这一问题的有效手段。紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula) 是一种跟紫云英共生固氮的有益根际微生物，可极大程度的提高紫云英的产量。然而，在我 国绝大多数种植紫云英的新区，土壤中普遍缺乏紫云英根瘤菌，必须进行人工接种，才能保 证紫云英正常生长从而获得高产。目前市场上的紫云英根瘤菌接种剂主要有固体制剂和液体 制剂两种类型，它们都要求大量的紫云英根瘤菌活菌，因而紫云英根瘤菌的高密度发酵成为 目前微生物肥料行业的研究热点。紫云英根瘤菌除对紫云英具有增产作用外，某些种对禾本 科类植物亦有明显的增产作用，张晓霞等人(2001)曾筛选到两株对水稻具有明显增产作用 的紫云英根瘤菌。

紫云英根瘤菌菌体呈短杆菌，革兰氏染色呈阴性，鞭毛端生，不产芽胞，个体较小(0.5～ 0.9μm)，无分枝，由于菌体在发酵过程中会产生大量胞外多糖和聚羟基丁酸(PHB)，故番红 染色较浅，进入平稳期的菌体在显微镜下观察会由于PHB的折光现象呈现出“断点”现象。 紫云英根瘤菌在固体培养基上的菌落形态呈玻璃珠状，表面光滑湿润，菌落后期中央呈乳白 色。

紫云英根瘤菌在根瘤菌属中属于中慢生型，发酵周期相对较长。培养基一般用根瘤菌专 用的培养基-即YM培养基，在LB培养基中不生长。一级种子用接种环挑取单菌落接入YM培 养基中，延滞期约为40h，培养76h后进入平稳期。由于紫云英在液体发酵周期较长，且在 发酵过程中不产生任何具有抑菌作用的代谢产物，因此极易感染杂菌，尤其是环境适应能力 较强的芽胞菌，在无菌操作过程中尤其需要注意。

目前，国内对根瘤菌高密度发酵研究相对较少，张建国等人(2005)发现碳源种类对柠 条根瘤菌菌体浓度影响极显著，氮源与生长因子对菌体浓度影响显著。在含有蔗糖、豆芽汁 和(NH₄)₂SO₄的10L发酵罐中，菌体干重最高可达17.8418g/L。王宝林等人(2006)曾在四 种培养基中做过花生根瘤菌深层发酵的相关研究，发现在发酵条件为28℃，pH值7.0，控制 溶氧在90％以上的情况下，黄豆浸出液培养基的最大生物量可达53.20亿/mL，且生物量越大， 对数期就越长。

由于根瘤菌对豆科类植物结瘤具有转移性，紫云英根瘤菌作为根瘤菌家族中的一员有举 足轻重的作用。目前紫云英根瘤菌存在发酵液菌浓较低，发酵周期较长的系列问题，建立紫 云英高密度发酵廉价的、实用性较强的技术平台对紫云英根瘤菌剂的大面积推广应用具有重 要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种紫云英根瘤菌发酵产量和缩短发酵周 期的高密度发酵方法，通过补加与原始培养基碳、氮源不同的补料发酵方法，区别于传统的 补料发酵方法，本发明获得的紫云英根瘤菌生物量可达130亿/mL(在本说明书中该“亿/mL” 还表示为“10⁸cfu/mL”)以上。本发明适用于获取生物量更高的根瘤菌高密度发酵工艺方法， 特别是本发明提供一种可以更高获取紫云英根瘤菌的高密度补料发酵方法。

实现本发明的技术方案如下：

本发明的紫云英根瘤菌的高密度发酵工艺方法是将工作种子接种于含10g/L甘露醇为唯 一碳源和1g/L酵母粉为唯一氮源的YM培养基中，发酵罐装液量发酵罐装液量40～60％，接 种量为1～6％，控制罐温26～30℃，转速400～800rpm，培养24～48h后进行第一次补料， 生长至48～72h后进行第二次补料，第二次补料完成后继续发酵至60～84h结束发酵。补料 成分为葡萄糖，其终浓度为0.5～1.5g/L；酵母粉的终浓度为1～4g/L，以及蛋白胨的终浓度 为1～4g/L。

具体地，本发明的紫云英根瘤菌的高密度发酵工艺如下：

A、将斜面保存的紫云英根瘤菌例如紫云英根瘤菌20026(不限于该菌株，现有报道的或常 用的或商业上可以购买得到的紫云英根瘤菌的菌株均可以作为本发明的实施菌株)在超净工 作台中用接种环取一环，在固体培养基平皿中划线，培养72h，取单菌落纯种接种到液体YM 培养基中培养72h，使OD₆₀₀达到0.7～0.8，此时可作为工作种子取按照体积比计为1～6％接 入下一步高密度补料发酵用的YM培养基中；

B、将酵母粉10～40g/L、蛋白胨10～40g/L用蒸馏水溶解后，定容至1000mL，调pH至7.0～ 7.4，此为补料用10倍氮源母液，在115～121℃高压蒸汽灭菌15～25min；

C、称取葡萄糖5～15g，加蒸馏水定容至1000mL，此为补料用10倍碳源母液，在110～115℃ 高压蒸汽灭菌15～25min；

D、紫云英根瘤菌发酵培养24～48进行第一次补料，启动发酵罐的补料蠕动泵向发酵罐中 一次泵入相当于发酵罐装液量体积的10％的碳源母液和10％体积的氮源母液至紫云英根瘤菌 发酵液中。之后继续发酵至48～72h重复以上补料方法进行第二次补料，第二次补料完成后 继续发酵至60～84h结束发酵。

上述YM培养基的组分及配制方法如下：

甘露醇10.0g/L，酵母粉1.0g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L， 0.5％刚果红5mL/L，琼脂1.80g/L，其余用蒸馏水补充至1L，调整pH至6.8～7.0，121℃高 压蒸汽灭菌20min，此为固体培养基。液体培养基为甘露醇10.0g/L，酵母粉1.0g/L， K₂HPO₄.3H₂O 0.5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，CaCO₃ 5g/L，其余用蒸馏水补充至 11，调整pH至6.8～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明设计的紫云英根瘤菌高密度补料发酵方法有如下特点：传统的紫云英根瘤菌发酵 较大多直接采用以10g/L甘露醇为唯一碳源和1g/L酵母粉为唯一氮源的YM培养基进行发酵 培养，由于紫云英根瘤菌自身的一些特点如生长较慢、极易染菌等，目前国内外报道的生物 量和OD值均不高。本发明在实验过程中发现紫云英根瘤菌在生长前期对氮源需求较少，过高 的氮源甚至会抑制其生长，然而当其生长至对数期后期后对氮源的需求量开始增大，此时供 给其充足的氮源会极大地促进其生长。本发明在紫云英根瘤菌生长前期使用甘露醇做碳源目 的是让其在最适碳源中快速生长，缩短发酵周期，而补料时紫云英根瘤菌对碳源需求量较低， 同时考虑到原料来源及成本，采用较低含量的葡萄糖作为补料用碳源。经相关的试验与对比 可见，本发明的采用的通过替换原始培养基中C、氮源高密度补料发酵方法效率更高，生产 成本更廉价，具有比现有根瘤菌发酵技术更高的生物量产量。

本发明获得的紫云英根瘤菌生物量可达130亿/mL以上。在后面的实施例中申请人特别 给出一种紫云英根瘤菌(菌株号为20026)的高密度补料发酵方法的实例。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1本发明的紫云英根瘤菌发酵方法获得的生物量有了显著高，可达130亿/mL以上；

2本发明的紫云英根瘤菌培养基成分简单，成本低廉，适于大规模生产；

3本发明的紫云英根瘤菌发酵工艺简单，易于操作。

附图说明

图1：为紫云英根瘤菌菌株20026种子生长曲线图。

图2：为紫云英根瘤菌菌株20026采用本发明的高密度补料发酵生长曲线图，

具体实施方式

以下为本发明的实施例，但不是限制本发明。在下面的实施例中的所用的紫云英根瘤菌 菌株20026为商业购买的紫云英根瘤菌20026菌株(购自：北京，中国工业微生物菌种保藏 管理中心，http://www.china-cicc.org)，在具体应用中不限于该菌株，现有报道的或常用 的或商业上可以购买得到的紫云英根瘤菌的菌株均可以作为本发明的实施菌株。

实施例1

A、工作种子紫云英根瘤菌20026培养

从划线并生长72h的YM固体培养基平板上挑取紫云英根瘤菌20026的1个单菌落到液体 种子YM培养基中，培养72h左右至菌体浓度OD₆₀₀达到0.7～0.8，获得发酵工作种子液。

B、接种前准备

(1)补料用碳源母液配制：称取10g葡萄糖用去离子水定容至1000mL；在113℃高压蒸汽下 灭菌25min。

(2)补料用氮源母液配制：称取25g酵母粉和25g蛋白胨用去离子水定容至1000mL，并调 pH值为7.0～7.2；于118℃高压蒸汽下灭菌25min。

C、接种

将工作种子紫云英根瘤菌20026按4％体积的接种量一次加入装液量为50％YM培养基的发 酵罐中，之后继续培养，控制罐温为28℃，转速为600rpm，培养36h后进行补料。

D、补料

启动发酵罐的补料蠕动泵向发酵罐中一次泵入相当于发酵罐装液量10％体积的碳源母液 和10％体积的氮源母液至紫云英根瘤菌20026发酵液中。之后继续发酵培养至60h重复以上 补料方法进行第二次补料。

E、结束发酵

在第二次补料后继续发酵至72h结束发酵，OD₆₀₀达到8.0以上，收获菌体。

上述YM培养基的组分及配制方法如下：

甘露醇10.0g/L，酵母粉1.0g/L，K₂HPO₄.3H₂O 0.5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L， 0.5％刚果红5mL/L，琼脂1.80g/L，其余用蒸馏水补充至1L，调整pH至6.8～7.0，121℃高 压蒸汽灭菌20min，此为固体培养基。液体培养基为甘露醇10.0g/L，酵母粉1.0g/L， K₂HPO₄.3H₂O 0.5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，CaCO₃ 5g/L；其余用蒸馏水补充至 11；调整pH至6.8～7.0；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

实施例2

A、工作种子紫云英根瘤菌20026培养

从划线并生长72h的YM固体培养基平板上挑取1个紫云英根瘤菌20026单菌落到液体种 子YM培养基中，培养72h左右至菌体浓度OD₆₀₀达到0.7～0.8，获得发酵紫云英根瘤菌20026 工作种子液。

B、接种前准备

(1)补料用碳源母液配制：称取15g葡萄糖用去离子水定容至1000mL；在115℃高压蒸汽下 灭菌30min。

(2)补料用的氮源母液配制：称取40g酵母粉和40g蛋白胨用去离子水定容至1000mL，并 调pH值为7.0～7.2；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

C、接种

将紫云英根瘤菌20026工作种子按6％体积比计的接种量一次加入装液量为60％YM培养基 的发酵罐中，之后继续培养，控制罐温为26℃，转速为800rpm，培养48h后进行补料。

D、补料

启动发酵罐的补料蠕动泵向发酵罐中一次泵入相当于发酵罐装液量10％体积的碳源母液 和10％体积的氮源母液至紫云英根瘤菌20026发酵液中。之后继续发酵培养至72h重复以上 补料方法进行第二次补料。

E、结束发酵

在第二次补料后继续发酵至84h结束发酵，OD₆₀₀达到8.0以上，收获菌体。

上述YM培养基的组分、配制方法及灭菌方法参照实施例1。

实施例3

A、工作种子培养

从划线并生长72h的YM固体培养基平板上挑取1个紫云英根瘤菌20026单菌落到液体种 子YM培养基中，培养72h左右至菌体浓度OD₆₀₀达到0.7～0.8，获得紫云英根瘤菌20026发 酵工作种子液。

B、接种前准备

(1)补料用碳源母液配制：称取5g葡萄糖用去离子水定容至1000mL，在110℃高压蒸汽下 灭菌40min。

(2)补料用氮源母液配制：称取10g酵母粉和10g蛋白胨用去离子水定容至1000mL，并调 pH值为7.0～7.2，于115℃高压蒸汽下灭菌30min。

C、接种

将紫云英根瘤菌20026工作种子按2％体积的接种量一次加入装液量为40％YM培养基的发 酵罐中，之后继续培养，控制罐温为30℃，转速为400rpm，培养24h后进行补料。

D、补料

启动发酵罐的补料蠕动泵向发酵罐中一次泵入相当于发酵罐装液量10％以及的碳源母液 和10％体积的氮源母液至紫云英根瘤菌20026发酵液中。之后继续发酵培养至48h重复以上 补料方法进行第二次补料。

E、结束发酵

在第二次补料后继续发酵至60h结束发酵，OD₆₀₀达到8.0以上，收获菌体。

上述YM培养基的组分、配制方法及灭菌方法参照实施例1。

本发明的实施效果如表1-3所示。

表1 YM培养基36h补加不同氮源对生物量的影响

注：表中的处理中CK1为完全不补料处理，CK2为不补加任何氮源的处理，之后的处 理都在补加了1g/L的葡萄糖的基础上补加5g/L的不同氮源。

从表1可以看出：在36h进行一次补料的情况下，补加酵母粉对紫云英根瘤菌的生物量 影响是最显著的，培养至60h，OD值和活菌数达最高。按酵母粉∶蛋白胨体积比为1∶1的比例 补加混合氮源的效果次之，按酵母粉∶蛋白胨体积比为1∶2和1∶3补加混合氮源的菌浓度与活 菌数呈阶梯状下降，出于成本考虑本发明选择补加酵母粉与蛋白胨体积比为1∶1的混合氮源 为最佳发酵工艺方法。

表2YM培养基36h补加不同碳源对生物量的影响

  处理(5g/L)   OD₆₀₀  10⁸cfu/mL   pH   CK1(不补料)   0.95±0.08   14.05±1.28   7.50±0.06   CK2(不补碳源)   3.25±0.03   40.23±5.41   7.56±0.08   甘露醇   5.03±0.04   66.54±6.28   7.52±0.03   葡萄糖   4.88±0.08   54.41±5.76   6.22±0.05   麦芽糖   4.26±0.07   34.62±4.35   6.35±0.07   蔗糖   4.04±0.05   30.15±3.25   6.64±0.06   乳糖   3.06±0.03   33.24±3.40   6.19±0.04   可溶性淀粉   3.15±0.07   32.64±4.57   6.78±0.06

注：表中的处理中CK1为完全不补料处理，CK2为不补加任何碳源的处理，之后的处 理都在补加了5g/L酵母粉和5g/L蛋白胨混合氮源的基础上补加1g/L的不同碳源。

从表2可以看出：在36h进行一次补料的情况下，补加甘露醇对紫云英根瘤菌的生物量 影响最显著，其次为补加葡萄糖，培养至60h，活菌数分别达到66和54亿/mL以上，但考虑 的紫云英根瘤菌补料发酵成分的成本及来源，选择补加葡萄糖作为作为最佳发酵工艺方法。

表3不同发酵工艺的比较

  处理(5g/L)   OD₆₀₀  10⁸cfu/mL   pH   YM培养基不补料   1.02±0.15   15.13±1.30   7.42±0.08   36h补料一次   5.03±0.67   56.93±2.58   6.89±0.15   36h和60h各补料一次   8.55±0.56   137.25±3.30   6.56±0.17

从表3可以看出：本发明的紫云英根瘤菌高密度发酵工艺与不补料处理及一次补料处理 相比，OD₆₀₀分别提高了8.33和1.70倍，活菌数分别提高了9.05和2.41倍，具有较大突破， 而发酵液pH补料之后略有下降，但降幅不大，未补料的发酵液pH略有上升。

参考文献

[1]张晓霞，王平，胡正嘉.对水稻有促生作用的紫云英根瘤菌的筛选初报.土壤肥料，2001 (6)：30-33；

[2]张建国，冯涛，肖婧凡.一株根瘤菌培养条件优化及代谢调控研究.生物技术，2005，15 (1)74-76

[3]王宝林，詹火元，李茹.花生根瘤菌的深层发酵培养研究.安徽农业科学，2006，34(20)： 5298-5299