快速筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法

摘要

本发明是一种快速筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法，该方法以采集的海水或海泥为样品进行富集培养，再制备2216E平板制备、有机溶剂、橄榄油双层平板和橄榄油双层平板，然后对富集液进行梯度稀释，测定平板同样位置产生的荧光圈直径，计算有机溶剂、橄榄油双层平板上荧光圈直径和橄榄油双层平板上荧光圈直径的比值，比值越大，脂肪酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物。本发明能够快速、直观、高效的筛选到分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物，为耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的研究提供了极大方便。

说明书

技术领域

 本发明涉及一种微生物的快速分离方法，更具体的说是一种快速耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法。

背景技术

脂肪酶 (lipase)，也称为三脂酰甘油水解酶 (triacylglycerol hydrolase，EC 3.1.1.3)，能够在油水界面上催化三脂酰甘油 (甘油三酯) 的酯键水解。除此之外，脂肪酶还可以催化酯合成、酯交换反应。和在水相进行催化相比，脂肪酶在有机相催化具有催化效率高、产物易于回收，可以催化水解的逆反应等优点。脂肪酶的有机相催化在食品、制药、精细化工、有机合成等领域均有广泛的应用，尤其是在食品及其相关领域，研究日益广泛 (王刚，陈光. 蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus SWWL6 产耐有机溶剂脂肪酶发酵条件优化及酶学性质, 2011, 32: 241-245)。但是在有机相中，脂肪酶酶活力容易受到抑制或失活，在有机介质中维持较高的脂肪酶活性及脂肪酶催化底物的广泛性，是实际生物催化过程中的难题。因此, 开发天然耐有机溶剂脂肪酶, 在理论和工业应用上具有重要的意义 (肖素静, 曹艳, 孙磊, 何冰芳. 耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选及其酶学性质, 食品与生物技术学报, 2009, 28: 816-821)。目前有关耐有机溶剂脂肪酶产生微生物的报道较少，多为陆源微生物，且耐受极性常数较小的短链烃的能力较弱。因此，筛选新的分泌耐有机溶剂脂肪酶微生物至关重要。

海洋覆盖着地球表面积71 %，且环境独特，包罗了高盐、高压、低温、低光照、寡营养等特点。海洋环境中分布着数量极其庞大、种类繁多的微生物。据估计有0.1~2 亿种（李艳华等, 2003），而且相对于陆地微生物而言，来自海洋的微生物在物种、基因组成和生态功能上具有多样性。通过实验室人工培养培养已经分离和描述的海洋微生物物种数量仅仅占估计数量的1%~5%，其余的微生物种群仍然未被分离和认识 (李艳华, 张利平. 海洋微生物资源的开发与利用. 微生物学通报, 2003, : 113-114)。因此，从海洋微生物中筛选新的分泌耐有机溶剂脂肪酶微生物机会较大。 

目前，耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选采用传统液体发酵方法。首先筛选脂肪酶产生菌，分离单菌，对所有菌株分别液体发酵产脂肪酶，测定蛋白酶耐有机溶剂特性，才能获得耐有机溶剂脂肪酶产生菌 (李俊峰, 李红芳, 段效辉, 门晋名, 宿 烽. 耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶酶学性质, 食品科学, 2012, 33: 116-120)。该方法成本高，周期长，劳动强度大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种成本低、操作简单、周期短、效率高的快速筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法。

本发明所要解决定的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是 一种快速筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）样品采集：用无菌取样瓶采集海水或海泥样品，4℃保存；

（2）富集培养：将0.5g样品加入2216E培养基中，25℃，140rpm 培养24h，得富集液；

（3）平板制备：

2216E平板制备：蛋白胨 5g/L，酵母膏 1g/L，磷酸高铁 0.1g/L，琼脂 20g/L，pH7.0，海水配制；每个直径9cm的平皿加入15ml 2216E 固体培养基；

有机溶剂、橄榄油双层平板制备：

下层培养基：将橄榄油、甲苯、20g/L PVA按体积比1:1:6置于烧杯中，300W 超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；体积比20% 乳化液，20g/L琼脂、1 g/L CaCl₂，0.01 g/L罗丹明B，海水配制，pH 7.0；每个直径9cm的平皿加入8 mL培养基；

上层培养基：5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，1 g/L CaCl₂，海水配制，pH7.0；

待下层琼脂凝固后，再向平皿中加入8 mL下层培养基；

橄榄油双层平板制备：

下层平板：将橄榄油、20g/L PVA按体积比1：3置于烧杯中，300W 超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；体积比10% 乳化液，20g/L琼脂、1 g/L CaCl₂，0.01 g/L罗丹明B，海水配制，pH 7.0；每个直径9cm的平皿加入8 mL培养基；

上层平板：5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，1 g/L CaCl₂，海水配制，pH7.0；

待下层琼脂凝固后，再向平皿中加入8 mL下层培养基；

（4）分离筛选：对富集液进行梯度稀释，取50μL不同稀释度的稀释液涂布2216E平板，25℃倒置培养36h，用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、橄榄油双层平板和橄榄油双层平板，22℃倒置培养值菌落36h，分别测定两个双层平板同样位置产生的荧光圈直径，计算有机溶剂、橄榄油双层平板上荧光圈直径和橄榄油双层平板上荧光圈直径的比值，比值越大，脂肪酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法可以快速的筛选分离分泌耐有机溶剂蛋白酶海洋微生物。与传统的液体发酵法相比，该方法不用单独进行菌株的分离和液体发酵而直接快捷的筛选出分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物。整个过快速，操作简单，劳动强度较小，为筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶微生物提供了极大方便。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种快速筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法，其步骤如下：

（1）样品采集：用无菌取样瓶采集海水或海泥样品，4℃保存；

（2）富集培养：将0.5g样品加入2216E培养基中，25℃，140rpm 培养24h，得富集液；

（3）平板制备：

2216E平板制备：蛋白胨 5g/L，酵母膏 1g/L，磷酸高铁 0.1g/L，琼脂 20g/L，pH7.0，海水配制；每个直径9cm的平皿加入15ml 2216E 固体培养基；

有机溶剂、橄榄油双层平板制备：

下层培养基：将橄榄油、甲苯、20g/L PVA按体积比1:1:6置于烧杯中，300W 超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；体积比20% 乳化液，20g/L琼脂、1 g/L CaCl₂，0.01 g/L罗丹明B，海水配制，pH 7.0；每个直径9cm的平皿加入8 mL培养基；

上层培养基：5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，1 g/L CaCl₂，海水配制，pH7.0；

待下层琼脂凝固后，再向平皿中加入8 mL下层培养基；

橄榄油双层平板制备：

下层平板：将橄榄油、20g/L PVA按体积比1：3置于烧杯中，300W 超声波乳化，超声5s，间歇5s，再超声5s，共5min，制备成乳化液；体积比10% 乳化液，20g/L琼脂、1 g/L CaCl₂，0.01 g/L罗丹明B，海水配制，pH 7.0；每个直径9cm的平皿加入8 mL培养基；

上层平板：5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，1 g/L CaCl₂，海水配制，pH7.0；

待下层琼脂凝固后，再向平皿中加入8 mL下层培养基；

（4）分离筛选：对富集液进行梯度稀释，取50μL不同稀释度的稀释液涂布2216E平板，25℃倒置培养36h，用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂、橄榄油双层平板和橄榄油双层平板，22℃倒置培养值菌落36h，分别测定两个双层平板同样位置产生的荧光圈直径，计算有机溶剂、橄榄油双层平板上荧光圈直径和橄榄油双层平板上荧光圈直径的比值，比值越大，脂肪酶耐有机溶剂性能越强，依此筛选得到分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物。

海洋微生物菌株的培养特征及生理生化鉴定，参照《常见细菌鉴定手册》和《Bergey’s manual of detrerminative bacteriology》（ninth edition）进行。

实施例2，快速筛选分泌耐有机溶剂脂肪酶的海洋微生物的方法应用实验。

将淮海工学院海洋学院微生物研究室保存的海洋耐有机溶剂脂肪酶产生菌Bacillus subtilis DS9 (Shu L， Yaowei F, Weifeng, Mingsheng L, Shujun W, Li C. Screening and identification of a novel organic solvent-stable lipase producer, Annals of Microbiology, 2009, 59: 539-543)和非耐有机溶剂脂肪酶产生菌Pseudomonas fluorescens TS182, (刘姝，房耀维，王淑军，吕明生，陈丽，焦豫良. 一株海洋低温碱性脂肪酶产生菌TS182 的分离与鉴定研究，淮海工学院学报，2009, 18, 83-86) 接种到250ml 三角瓶中装入的30ml 2216E培养基中，25℃，140rpm 培养24h。 用无菌水对培养液进行梯度稀释，取稀释10⁷倍的稀释液50μL涂布2216E平板，25℃倒置培养36h，分别用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上做成影印工具，将菌落影印到有机溶剂橄榄油双层平板和橄榄油双层平板，22℃倒置培养值菌落36h，随即选取两种菌的10个菌落，测定两个双层平板同样位置产生的荧光圈直径，计算有机溶剂、橄榄油双层平板上荧光圈直径和橄榄油双层平板上荧光圈直径的比值。结果显示耐有机溶剂脂肪酶产生菌Bacillus subtilis DS9 在有机溶剂、橄榄油双层平板上荧光圈直径和橄榄油双层平板上荧光圈直径的平均比值为96.9%，普通脂肪酶产生菌Proteus vulgaris T6的平均比值为36.3%。