一种胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料的制备方法

摘要

本发明公开了一种胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料的制备方法，包括以下步骤：将胰凝乳蛋白酶溶液滴加到氯金酸溶液中，搅拌均匀；在避光条件下，调节混合溶液的pH值为碱性，并于20～37℃水浴条件下反应1～48h后，分离纯化制得所述的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料。本发明操作步骤简便，反应条件温和，所用试剂环境友好，生成的金纳米团簇不易团聚；本发明制备的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料具有高产量的荧光量子，还具有良好的生物相容性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种金纳米团簇，尤其涉及一种胰凝乳蛋白酶保护金纳米 团簇荧光材料的制备方法。

背景技术

迄今为止，研究者已经发明了多种荧光纳米材料，如半导体量子点、 涂料掺杂纳米粒子、掺镧系元素纳米粒子和碳纳米点等。与小分子染料和 荧光蛋白相比，上述荧光纳米材料具有高的光物理性、大的比表面积、易 于进行表面修饰以及颜色可调等特点。因此，它们有可能补足小分子染料 的不足甚至替代传统荧光探针，在生物传感、小分子成像、光电子学和纳 米医学上有巨大的应用前景。

金属纳米团簇是一个备受关注的新型纳米荧光材料，它由几个到几百 个原子组成，通常直径小于2nm，性质介于单原子和纳米粒子或者大体积 的贵金属之间。金属纳米团簇的尺寸接近电子的费米波长，连续的能态分 裂为离散的能态，与纳米粒子不同的光学、电学和化学性质。其最突出的 特征是光致发光的性质，以及具有较大的斯托克斯位移和高发射率。金属 纳米团簇荧光材料主要应用于生物标记和光电发射。

最近科研人员致力于研究水溶性荧光金纳米团簇的合成途径。由于纳 米团簇很容易团聚，所以还原溶液中的金属离子很容易得到大分子纳米粒 子而不是小分子的纳米团簇。此外，包裹在粒子表面的配体对它的发射性 质有很大的影响。所以，选择合适的试剂用于稳定超小纳米粒子簇不仅可 以防止其团聚还可以提高荧光量子产量。

蛋白质作为生物大分子可以用作合成强荧光的金属纳米团簇模板。蛋 白质结构中含有大量结合点，这些结合点可以稳定甚至还原金属离子，从 而建立合成小分子金属纳米团簇的支架。2009年，以牛血清白蛋白(BSA) 作为还原剂和保护剂，合成了第一个以蛋白质作为稳定剂的金纳米团簇荧 光材料(Au NCs)。值得注意的是，该金纳米团簇荧光材料在BSA和氯金 酸溶液中原位合成。因此，BSA不仅仅是氯金酸的还原剂，还是金纳米团 簇的保护剂。受这个发现的鼓舞，研究者们开始报道比如溶菌酶和铁蛋白 等作为生物支架去合成荧光Au NCs。酶是催化特殊化学反应的蛋白质， 目前，已有文献报道辣根过氧化物酶(HRP)作为还原剂和保护剂，用于合 成荧光Au NCs。

发明内容

本发明提供了一种胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料的制备方 法，该方法可以阻止金纳米粒子的生成，防止金纳米团簇的团聚，并且制 得的材料具有较好的生物相容性。

一种胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料的制备方法，包括以下步 骤：

将胰凝乳蛋白酶溶液滴加到氯金酸溶液中，搅拌均匀；在避光条件下， 调节混合溶液的pH值为碱性，并于20～37℃水浴条件下反应1～48h后， 分离纯化制得所述的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料。

胰凝乳蛋白酶为蛋白质分子，在本发明中用作合成强荧光的金属纳米 团簇模板，它分子中含有大量含巯基、二硫键、氨基的氨基酸结合位点， 这些位点在制备过程中通过金-硫键或静电作用与氯金酸结合，形成胰凝 乳蛋白酶-氯金酸复合物，将溶液pH调至碱性时，胰凝乳蛋白酶中的酪氨 酸及含有伯氨基的赖氨酸、精氨酸在碱性条件下可原位还原氯金酸，得到 胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇。

如图1所示本发明方法的原理图，一方面，胰凝乳蛋白酶使氯金酸定 位，可以降低溶液中氯金酸的含量，阻止比金纳米团簇粒径大的金纳米粒 子的生成，另一方面，胰凝乳蛋白酶可以防止金纳米团簇团聚。与现有的 包裹在金纳米团簇表面的材料相比较，胰凝乳蛋白酶对金纳米团簇的发射 性质影响较小，可以提高荧光量子的产量；而且胰凝乳蛋白酶为绿色生物 制剂，表面富含氨基，生成的荧光材料具有良好的生物相容性。

所述的胰凝乳蛋白酶可以是来源于动物的胰凝乳蛋白酶，如猪胰凝乳 蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶等，优选为牛胰凝乳蛋白酶。

在氯金酸浓度一定的条件下，胰凝乳蛋白酶溶液浓度影响单个酶分子 结合氯金酸的量，进而影响生成金纳米团簇的量和荧光材料的发光强度， 所述胰凝乳蛋白酶溶液浓度优选为15～90mg/mL，更优选为40～60mg/mL， 最优选为50mg/mL。

氯金酸溶液浓度太高，以导致金纳米团簇的团聚以及金粒子的生成， 所述氯金酸溶液的浓度优选为0.1％～2％，更优选为0.5％～1％，最优选为 1％。

单个胰凝乳蛋白酶分子结合位点是有限的，因此胰凝乳蛋白酶与氯金 酸之间的摩尔比会最终影响荧光材料的性能，如发光量、粒径等等，胰凝 乳蛋白酶与氯金酸之间摩尔比优选为0.068∶1～0.410∶1，更优选为 0.1～0.3∶1。

在碱性条件，有利于提高酪氨酸及含有伯氨基的赖氨酸、精氨酸的还 原性，所述混合溶液的pH值为10～12，最优选为12。

所述分离纯化的方法为透析，该方法操作简单，条件温和，对产品影 响较小。

所述反应时间优选为4h。

本发明提供的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料由于其良好的 生物相容性和无毒副作用，因此在细胞成像、蛋白及细菌的检测、免疫分 析、生物传感器等方面具广泛应用前景。如本发明提供的一种胰凝乳蛋白 酶保护金纳米团簇荧光材料，由于胰凝乳蛋白酶的存在而具有丰富的羧 基，可通过催化形成酰胺键而进一步固定含有氨基的叶酸，得到具有特异 性选择功能的复合荧光纳米探针，通过叶酸与癌细胞表面叶酸受体的特异 性识别，可进行细胞的荧光标记成像。

与现有技术相比较，本发明有益效果为：

(1)本发明引入了胰凝乳蛋白酶作为还原剂和保护剂，胰凝乳蛋白 酶上的还原性功能基团在碱性条件下还原性强，有利于金纳米团簇的合 成；

(2)本发明操作步骤简便，反应条件温和，所用试剂环境友好，生 成的金纳米团簇不易团聚；

(3)本发明制备的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料具有高产 量的荧光量子，还具有良好的生物相容性。

附图说明

图1本发明胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇的制备示意图。

图2本发明实施例1的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇的高分辨透射 电镜图。

图3紫外光(365nm，紫色背景)照射下本发明实施例1的胰凝乳蛋白 酶保护金纳米团簇(左，红色荧光)和胰凝乳蛋白酶(右，无荧光)溶液的照 片。

图4本发明实施例1的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇(A)和胰凝乳蛋 白酶(B)的荧光发射光谱图，激发波长为475nm。

图5本发明实施例1的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇的荧光激发光 谱和发射光谱图。

图6本发明实施例1的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇的可见光谱图。

图7本发明实施例1的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇的X射线光电 子能谱(Au4f)。

图8本发明实施例1的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇的能量色散光 谱。

具体实施方式

实施例1

a)将氯金酸溶于超纯水中制得浓度为1％的氯金酸溶液，在磁力搅拌 下将50mg/mL的牛胰凝乳蛋白酶溶液逐滴加入到氯金酸溶液中，胰凝乳 蛋白酶/氯金酸摩尔比为0.212∶1，磁力搅拌10min；

b)在避光条件下，向a)中所得溶液中加入1mol/L氢氧化钠溶液，调 节溶液pH至12，在37℃的水浴中搅拌反应4h后，将所得溶液装入透析 袋中用蒸馏水透析至透析液电导率不变为止，将透析袋内溶液冷冻干燥得 到胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料。

随后，对经步骤(a)～(b)制备的胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇进 行荧光光谱分析、透射电镜扫描等操作，得到的测试分析结果如图2～8所 示。

图2所示高分辨透射电镜图中，只观测到粒径在2nm以下粒子，证明 所得材料为纳米团簇。图3中紫外光(365nm，紫色背景)照射下胰凝乳蛋 白酶保护金纳米团簇显示红色荧光(左)和而纯胰凝乳蛋白酶溶液(右)则无 荧光。图4所示荧光发射光谱图中，用475nm的光激发时，胰凝乳蛋白酶 保护金纳米团簇具有的荧光发射峰，而胰凝乳蛋白酶无荧光峰，图五胰凝 乳蛋白酶保护金纳米团簇的荧光激发光谱和发射光谱图表明最大激发波 长约为475nm，最大发射波长约为628nm。图6中，可见光谱中未出现金 纳米粒子特征的等离子体吸收峰，再次证明合成的是纳米团簇。图7中， X射线光电子能谱表征提供了金纳米团簇中金的价态信息(Au(4f_7/2))和 Au(4f_5/2))。图8中能量色散光谱表征证明了C、N、O、Au元素的存在， 证明了胰凝乳蛋白酶和金的复合。这些结果表明胰凝乳蛋白酶保护金纳米 团簇荧光材料的有效制备。选用与胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料 荧光性质类似的罗丹明B为参考物质，计算得出胰凝乳蛋白酶保护金纳米 团簇荧光材料的荧光量子产率为2.3％。

实施例2

a)将氯金酸溶于超纯水中制得浓度为0.5％的氯金酸溶液，在磁力搅 拌下将20mg/mL的牛胰凝乳蛋白酶溶液逐滴加入到氯金酸溶液中，胰凝 乳蛋白酶/氯金酸摩尔比为0.170∶1，磁力搅拌10min；

b)在避光条件下，向a)中所得溶液中加入1mol/L氢氧化钠溶液，调 节溶液pH至10，在25℃的水浴中搅拌反应8h后，将所得溶液装入透析 袋中用蒸馏水透析至透析液电导率不变为止，将透析袋内溶液冷冻干燥得 到胰凝乳蛋白酶保护金纳米团簇荧光材料。

经上述实验证明，实施例2同样有效制得了胰凝乳蛋白酶保护金纳米 团簇荧光材料。