用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法

摘要

一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法，该方法先将病原副溶血弧菌JGB080708-1菌株灭活、离心得灭活菌体；然后制得黄芪浸出液；再由白油、硬脂酸铝、司班80制得油相，灭活菌体与黄芪浸出液混合制得疫苗水相；最后将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。本发明副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗，可以用于免疫成年产蛋鸡，进而得到抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体，能增强凡纳滨对虾对病原副溶血弧菌的免疫力，提高凡纳滨对虾养殖的成活率，增加凡纳滨对虾养殖的产量，提高凡纳滨对虾养殖生产的经济效益。从根本上解决了目前凡纳滨对虾养殖生产过程中易发生副溶血弧菌所致疾病的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，特别涉及一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法。 

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称白对虾、万氏对虾等，是一热带虾种，其具有适盐范围广、耐密养、生长快、抗逆能力强等优点，我国于1988年引进后，现已在全国沿海各地大规模养殖。随着凡纳滨对虾养殖规模的扩大，养殖生态环境日益恶化，病害发生频率急剧上升，由病原副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）引起的红体病在全国各养虾地区均广泛流行，且传播快，可造成海水养殖凡纳滨对虾毁灭性死亡，已成为凡纳滨对虾养殖过程中最常见且是造成经济损失最严重的疾病之一。 

目前凡纳滨对虾海水养殖生产中很难控制副溶血弧菌引起的疾病的发生与流行，市场上缺乏一种使用方便的抗凡纳滨对虾红体病的灭活疫苗。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高凡纳滨对虾针对副溶血弧菌的免疫力、降低凡纳滨对虾海水养殖生产中由病原副溶血弧菌所造成的危害、以满足凡纳滨对虾养殖生产上的抗病需求的用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法，其特点是：它以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus）作为免疫原，以白油、司班80、硬脂酸铝作油乳剂，以及以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原副溶血弧菌JGB080708-1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28-30℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至50-55℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为1-3：100 g / ml，继续加热至65-70℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为5-7：100，直至终温度115-120℃，维持15-20 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原副溶血弧菌JGB080708-1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。

本发明所述的病原副溶血弧菌JGB080708-1已经在公开文献《凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征》中所公开（菌株JGB080708-1），上述公开文献发表于《海洋与湖沼》，2009，40（5）：654-661。菌株JGB080708-1的DNA序列长度及Genebank登录号见下表： 

该菌株JGB080708-1为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋学院实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外发放。

本发明制备方法制得的抗凡纳滨对虾红体病的灭活疫苗的使用方法如下：用制得的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗，采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡，第1次免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法继续加强免疫，免疫剂量为1 mL，一周后按前述方法再加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，共免疫4次，收集被免疫鸡所产鸡蛋，分离出卵黄，制得卵黄抗体。免疫结束后第4周，卵黄抗体效价可达2¹²。然后以上述方法所获得的高免鸡蛋作为原料，经冷冻干燥（蛋黄液厚度6mm，冻干时间10h）或喷雾干燥制备成含有抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体的蛋黄粉，可在育苗生产中直接投喂，或按5%比例添加在配合饲料中投喂使用。抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体，不仅具有良好的抗病作用，而且使用方便，同时又具有较高的营养价值。 

本发明副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗，可以用于免疫成年产蛋鸡，进而得到抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体，能增强凡纳滨对虾对病原副溶血弧菌的免疫力，提高凡纳滨对虾养殖的成活率，增加凡纳滨对虾养殖的产量，提高凡纳滨对虾养殖生产的经济效益。从根本上解决了目前凡纳滨对虾养殖生产过程中易发生副溶血弧菌所致疾病的问题。 

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。 

实施例1，一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法，它以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus）作为免疫原，以白油、司班80、硬脂酸铝作油乳剂，以及以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原副溶血弧菌JGB080708-1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上， 30℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至50℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为1：100 g / ml，继续加热至65℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为5：100，直至终温度115℃，维持15 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原副溶血弧菌JGB080708-1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。

实施例2，一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法，它以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus）作为免疫原，以白油、司班80、硬脂酸铝作油乳剂，以及以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原副溶血弧菌JGB080708-1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，29℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至52℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为3：100 g / ml，继续加热至68℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为5-7：100，直至终温度118℃，维持18 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原副溶血弧菌JGB080708-1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。

实施例3，一种用于制备抗凡纳滨对虾红体病的卵黄抗体的灭活疫苗制法，它以经甲醛溶液灭活后的凡纳滨对虾红体病的病原副溶血弧菌JGB080708-1（Vibrio parahaemolyticus）作为免疫原，以白油、司班80、硬脂酸铝作油乳剂，以及以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原副溶血弧菌JGB080708-1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡45min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至55℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为2：100 g / ml，继续加热至70℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为6：100，直至终温度120℃，维持20 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原副溶血弧菌JGB080708-1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。

实施例4，实施例3制得的抗凡纳滨对虾红体病的灭活疫苗的应用实验。 

1．副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡。 

副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡，第1次免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法继续加强免疫，免疫剂量为1 mL，一周后按前述方法再加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，共免疫4次，收集被免疫鸡所产鸡蛋，分离出卵黄作高免卵黄抗体，并测定其抗体效价。免疫结束后第1周至第2周卵黄抗体效价维持在2¹¹，第3周以后卵黄抗体效价为2¹²。 

2．用上述方法制得的抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体进行的免疫实验及其结果。 

实验时间：2012年度4月~5月。 

实验地点：江苏省淮海工学院水产动物病害实验室。 

实验动物：凡纳滨对虾蚤状幼体及糠虾幼体。 

（1）使用抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体。使用时以所获得的高免鸡蛋作为原料，经冷冻干燥（蛋黄液厚度6mm，冻干时间10h）制备成含有抗凡纳滨对虾红体病病原副溶血弧菌高免卵黄抗体的蛋黄粉。 

（2）实验组凡纳滨对虾蚤状幼体投喂用含有抗凡纳滨对虾红体病病原副溶血弧菌高免卵黄抗体的蛋黄粉及市售虾片，对照组凡纳滨对虾蚤状幼体投喂市售普通蛋黄粉及市售虾片。 

（3）投喂4d后，对实验组与对照组凡纳滨对虾幼体进行保护力检验，分别取幼体100尾，用副溶血弧菌进行浸浴感染，菌体终浓度均为1.8×10⁶CFU/mL。试验期间继续按上述（2）进行投喂，试验期为72h。 

（4）实验结果：实验组凡纳滨对虾幼体投喂实验例1所述的抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体后，可获得较高的抗副溶血弧菌感染能力，幼体感染72h后存活率达78％，幼体存活率为26%。实验结果表明抗凡纳滨对虾红体病的高免卵黄抗体可使凡纳滨对虾获得较高的免疫保护力。