用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法

摘要

一种用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法，该方法先将病原鳗利斯顿氏菌BH1菌株灭活、离心得灭活菌体；然后制得黄芪浸出液；再由白油、硬脂酸铝、司班80制得油相，灭活菌体与黄芪浸出液混合制得疫苗水相；最后将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的副溶血弧菌油乳剂灭活疫苗。该疫苗可以得到抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体，高免卵黄抗体的使用能增强半滑舌鳎等海水鱼类对病原鳗利斯顿氏菌的免疫力，提高其成活率，增加其产量，提高半滑舌鳎等海水鱼类养殖生产的经济效益。从根本上解决了目前半滑舌鳎等海水鱼类养殖生产过程中易发生鳗利斯顿氏菌所致疾病的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，特别是涉及一种用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法。 

背景技术

鳗利斯顿氏菌作为水产养殖动物的病原菌早已被确认，该菌最早由意大利的Canestrini于1893年首次从发生“红疫”的鳗鲡中分离到。现已知其能引起硬头鳟、大麻哈鱼、大菱鲆、香鱼、鳗鱼、太平洋鲑、鰤鱼、竹筴鱼、真鲷、鲈鱼、鲽鱼、鳕鱼、鲐鱼、各种热带淡水鱼以及虾、蟹、牡蛎、文蛤、鲍等多种水产养殖动物发生致死性的弧菌病。由鳗利斯顿氏菌引起的疾病给水产动物养殖生产造成了很大的损失，因此，对鳗利斯顿氏菌引起的疾病的有效预防，以最大限度地降低其危害程度，将能显著地提高水产动物养殖生产的经济效益。 

目前养殖户大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制水产养殖动物弧菌病的发生与流行，市场上缺乏一种适用于水产养殖动物苗期幼体的使用方便的抗鳗利斯顿氏菌的免疫制剂。因此，开发研制抗鳗利斯顿氏菌的疫苗，对于有效控制水产养殖动物鳗利斯顿氏菌病的发生与流行具有重要的应用前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高水产养殖动物免疫力、降低海水鱼养殖生产中由病原鳗利斯顿氏菌所造成的危害、以满足水产动物养殖生产上的抗病需求的用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法，其特点是：该方法以病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）经甲醛溶液灭活后作为免疫原，以白油、司班80和硬脂酸铝作油乳剂，以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原鳗利斯顿氏菌BH1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28-30℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至50-55℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为1-3：100 g / ml，继续加热至65-70℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为5-7：100，直至终温度115-120℃，维持15-20 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鳗利斯顿氏菌BH1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗。

本发明所述的病原鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum BH1）已经在公开文献《半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究》中所公开（菌株BH1），上述公开文献发表于《海洋学报》，2009，31（5）：112-121。菌株BH1的DNA序列长度及Genebank登录号见下表： 

该菌株BH1为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋学院实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外发放。

本发明方法制得的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗的使用方法是：采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡，第1次免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法继续加强免疫，免疫剂量为1 mL，一周后按前述方法再加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，共免疫4次，收集被免疫鸡所产鸡蛋，分离出卵黄，并测定其抗体效价。免疫结束后第1周至第2周卵黄抗体效价维持在2¹³左右，第3周以后卵黄抗体效价为2¹⁴左右。然后将所获得的高免鸡蛋作为原料，经冷冻干燥（蛋黄液厚度6mm，冻干时间10h）制备成含有抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体的蛋黄粉，按5%左右比例添加在配合饲料中投喂使用。 

本发明方法制得的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗可以得到抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体，高免卵黄抗体的使用能增强半滑舌鳎等海水鱼类对病原鳗利斯顿氏菌的免疫力，提高半滑舌鳎等海水鱼类养殖的成活率，增加半滑舌鳎等海水鱼类养殖的产量，提高半滑舌鳎等海水鱼类养殖生产的经济效益。从根本上解决了目前半滑舌鳎等海水鱼类养殖生产过程中易发生鳗利斯顿氏菌所致疾病的问题。 

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。 

实施例1，一种用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法，该方法以病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）经甲醛溶液灭活后作为免疫原，以白油、司班80和硬脂酸铝作油乳剂，以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原鳗利斯顿氏菌BH1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上， 30℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至50℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为1：100 g / ml，继续加热至65℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为5：100，直至终温度115℃，维持15min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鳗利斯顿氏菌BH1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗。

实施例2，一种用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法，该方法以病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）经甲醛溶液灭活后作为免疫原，以白油、司班80和硬脂酸铝作油乳剂，以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原鳗利斯顿氏菌BH1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，29℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至52℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为3：100 g / ml，继续加热至68℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为7：100，直至终温度118℃，维持18 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鳗利斯顿氏菌BH1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗。

实施例3，一种用于制备抗鳗利斯顿氏菌的卵黄抗体的灭活疫苗制法，该方法以病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）经甲醛溶液灭活后作为免疫原，以白油、司班80和硬脂酸铝作油乳剂，以黄芪浸出液作为免疫增强剂，乳化制备成油乳剂灭活疫苗；其具体步骤如下： 

（1）将病原鳗利斯顿氏菌BH1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃摇床培养24h，加入体积终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，离心得灭活菌体；

（2）取黄芪用蒸馏水浸泡45min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

（3）将白油加热至55℃，加入硬脂酸铝，硬脂酸铝与白油的重量体积比为2：100 g / ml，继续加热至70℃，加入司班80，司班80与白油的体积比为6：100，直至终温度120℃，维持20 min，制得油相，冷却备用；

（4）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鳗利斯顿氏菌BH1免疫原为10¹¹cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL，水相中还加入了终体积浓度为4%的吐温80；

（5）将油相和水相按体积比2:1混合乳化研磨5min，制得黄芪和白油为联合佐剂的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗。

实施例4，取实施例3制得的鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗进行的应用实验。 

1．鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡。 

鳗利斯顿氏菌油乳剂灭活疫苗采用颈部皮下注射免疫的方法免疫成年产蛋鸡，第1次免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，一周后按前述方法继续加强免疫，免疫剂量为1 mL，一周后按前述方法再加强免疫，免疫剂量为0.5 mL，共免疫4次，收集被免疫鸡所产鸡蛋，分离出卵黄作高免卵黄抗体，并测定其抗体效价。免疫结束后第1周至第2周卵黄抗体效价维持在2¹³，第3周以后卵黄抗体效价为2¹⁴。 

2．用抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体进行的免疫实验及其结果。 

实验时间：2011年度4月~5月。 

实验地点：江苏省淮海工学院水产动物病害实验室。 

实验动物：半滑舌鳎和大菱鲆。 

高免卵黄抗体与方法：使用所述的方法制得的抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体。使用时以所获得的高免鸡蛋作为原料，经冷冻干燥（蛋黄液厚度6mm，冻干时间10h）制备成含有抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体的蛋黄粉，按5%比例添加在配合饲料中投喂使用。 

试验用半滑舌鳎和大菱鲆投喂抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体饲料2d后，分别用浓度为1.56×10⁸CFU/mL的鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）菌悬液注射感染受免半滑舌鳎和大菱鲆，感染剂量为0.3mL。试验期为7d，并持续投喂抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体饲料。 

对照组为用浓度1.56×10⁸CFU/mL的鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）菌悬液注射感染投喂普通饲料的半滑舌鳎和大菱鲆，感染剂量为0.3mL。 

实验结果：半滑舌鳎和大菱鲆经实验例1所述的抗鳗利斯顿氏菌的高免卵黄抗体和使用方法进行免疫后，两种海水鱼都能产生一定的免疫保护力，其免疫保护率分别为85％、75％。见下表： 

 

组别试验鱼数存活鱼数存活率/%免疫保护率/%半滑舌鳎实验组201785%85%半滑舌鳎对照组20420%20%大菱鲆实验组201575%75%大菱鲆对照组20315%15%