一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法

摘要

本发明公开了一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法，其在融合过程中依次添加一定量的聚乙二醇和胶原蛋白来高效诱导细胞融合，其中聚乙二醇能使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。胶原蛋白可以使融合后细胞膜紧缩，修复细胞膜，从而形成稳定、高效的融合细胞，适用于生产肿瘤疫苗、单克隆抗体等特定的生物制品。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，更具体地说，涉及一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法。

背景技术

树突状细胞（dendritic cell，DC）是已知体内抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞（胶原蛋白PC），不仅它表达丰富的MHC-I，MHC-II类分子、共刺激分子、粘附分子及高水平的Th1型应答主导因子IL-12，而且DC能有效活化同源淋巴细胞产生抗原特异性免疫应答，成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点。问题的关键是如何使DC能有效呈递肿瘤抗原。近年来人们已尝试采用不同形式的肿瘤抗原如多肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞凋亡产物或应用基因工程将肿瘤抗原基因通过载体转入DC，致敏的DC疫苗可以在体内外诱导CTL细胞的生成，激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能，并在恶性肿瘤尝试性治疗中取得了一定的疗效。但鉴于目前为止，人们可获得的已知抗原甚少，大多数的肿瘤抗原是未知的，于是科学家们遂将DC与肿瘤细胞直接融合，这样就确保DC在获得肿瘤细胞全部基因的基础上表达且呈递多种抗原，并诱导出抗多种肿瘤抗原（包括已知的和未知的）的多克隆免疫反应，在抗肿瘤方面已经展示出令人欣喜的疗效。

在DC与肿瘤细胞直接融合时，其融合效率不高一直是研究的难点，如何提高融合效率亟待解决。目前已有的研究方法诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（如病毒诱导融合法）、化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）、物理方法（如电场诱导融合法）。利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。由于病毒诱导细胞融合存在诸多缺点，所以1975年以后，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种规范的重要化学融合方法。PEG法的优点是没有种间、属间、科间的特异性或专一性，所以这种方法一直沿用至今，PEG法以其低廉的实验成本和相对较高的融合率，大量应用于诸多实验中。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但仍存在着融合率较低及经验性大等缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有树突状细胞与肿瘤细胞的融合方法的融合率较低的缺陷，提供一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法，包括以下步骤：

S1、收集肿瘤细胞于离心管A，收集树突状细胞于离心管B，室温下分别以1500rpm离心10分钟，使用磷酸缓冲液分别重悬离心管A、B中的细胞并计数；

S2、按肿瘤细胞:树突状细胞=1:2-5的数量比将离心管A、B中的两种细胞加入到离心管C中，细胞总数控制在1×10⁷-5×10⁷个，涡旋混匀，室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，将离心管C置于40°C水浴3-5分钟；

S3、将分子量为1500-6000的聚乙二醇置于40°C水浴2分钟，将200-1000μl聚乙二醇在1分钟内加入离心管C中，并将细胞搅匀，将离心管C置于40°C水浴3-5分钟；

S4、先在1分钟内向离心管C中加入1ml磷酸缓冲液以终止反应，再在3-5分钟内向离心管C中加入30-40ml磷酸缓冲液混匀；将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，向离心管C中加入30-40ml磷酸缓冲液混匀；将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，向离心管C中加入200μl-800μl磷酸缓冲液重悬细胞；

S5、向离心管C中加入2-8μl胶原蛋白，37°C水浴30-50分钟；

S6、向离心管C中加入30ml磷酸缓冲液混匀，将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，向离心管C中加入完全1640培养基重悬细胞，获得融合后的细胞。

在根据本发明所述的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法中，所述步骤S5中采用的胶原蛋白的相对分子量为：1600-4000，质量浓度为50%（m/v）。

在根据本发明所述的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法中，所述步骤S5中采用的胶原蛋白为I型胶原。

在根据本发明所述的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法中，所述步骤S3中采用的聚乙二醇的相对分子量为：1600-4000，质量浓度为50%（m/v）。

在根据本发明所述的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法中，所述步骤S3中采用的聚乙二醇为300-1000μl。

实施本发明的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法，具有以下有益效果：本发明的融合方法中所采用的聚乙二醇能使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合；胶原蛋白可以使融合后细胞膜紧缩，修复细胞膜，从而形成稳定的融合细胞；经荧光显微镜和共聚焦显微镜检测和细胞实验证明，该方法融合效率高，对细胞损伤小。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为根据本发明提供的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法的流程图；

图2a-2e为未使用胶原蛋白情况下融合细胞在共聚焦显微镜下的照片；

图3a-3e为使用胶原蛋白情况下融合细胞在共聚焦显微镜下的照片；

图4为未使用胶原蛋白和使用胶原蛋白进行细胞融合的融合率比较。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明提供了一种采用PEG联合胶原蛋白来高效诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法，该方法融合的细胞效率高，简便，易得，重复性好，细胞损伤小。适用于生产肿瘤疫苗、单克隆抗体等特定的生物制品。对于研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，该融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗及抗肿瘤免疫等方面起到重要作用。

请参阅图1，为根据本发明提供的诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法的流程图。如图1所示，该方法主要包括以下步骤：

首先，在步骤S1中，将肿瘤细胞和树突状细胞分别离心重悬。具体为：预先将磷酸缓冲液、胶原蛋白和完全1640培养基分别置于37°C水浴备用。消化肿瘤细胞并收集于离心管A，收集悬浮的树突状细胞于离心管B，室温下分别以1500rpm离心10分钟，使用磷酸缓冲液分别重悬离心管A、B中的细胞并计数。

随后，在步骤S2中，将肿瘤细胞和树突状细胞混合离心去上清。具体为按肿瘤细胞:树突状细胞=1:2-5的数量比将离心管A、B中的两种细胞加入到离心管C中，细胞总数控制在1×10⁷-5×10⁷个，涡旋混匀。随后在室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，用手指弹击离心管C使细胞分布相对均匀，再将离心管C置于40°C水浴3-5分钟。本申请中离心管A、B和C均可以采用50ml离心管。

随后，在步骤S3中，加入聚乙二醇进行融合。具体为将分子量为1500-6000的聚乙二醇置于40°C水浴2分钟，使用移液枪将200-1000μl水浴加热后的聚乙二醇加入离心管C中，在1分钟内加完，边加边旋转枪头，加完后可以用枪头将细胞搅匀，将离心管C置于40°C水浴3-5分钟。本申请优选采用的聚乙二醇的相对分子量为：1600-4000，质量浓度为50%（m/v），并优选采用300-1000μl。

随后，在步骤S4中，加入磷酸缓冲液终止融合并清洗重悬。具体为先向离心管C中加入1ml磷酸缓冲液以终止反应，要求在1分钟内加完；再向离心管C中缓慢加入30-40ml磷酸缓冲液，要求在3-5分钟内加完，加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管混匀溶液，以达到充分的终止。随后，将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，缓慢向离心管C中加入30-40ml磷酸缓冲液混匀，例如在3-5分钟内加完，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。随后将离心管C在室温下1500rpm再次离心10分钟，弃去上清，向离心管C中加入200μl-800μl磷酸缓冲液重悬细胞。

随后，在步骤S5中，加入胶原蛋白进行反应。具体为向离心管C中加入2-8μl胶原蛋白，优选为3-5μl胶原蛋白，并在37°C水浴30-50分钟。优选地，本申请中胶原蛋白的相对分子量为：1600-4000，质量浓度为50%（m/v），并优选采用I型胶原。

最后，在步骤S6中，加入磷酸缓冲液并清洗重悬。具体为向离心管C中缓慢加入30ml磷酸缓冲液混匀，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟，弃去上清，向离心管C中加入完全1640培养基重悬细胞，获得融合后的细胞。

本申请中采用的磷酸缓冲液的配制步骤为：配置0.01M PBS需要称取8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄·2H₂O、0.24g KH₂PO₄，加蒸馏水至1L，调节PH=7.2-7.4，并采用高压灭菌。

本申请中采用的完全1640培养基的配制步骤为：

1）溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡助溶解。

2）加抗生素：青霉素终浓度100U/ml，链霉素终浓度100U/ml。调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％NaHCO₃调节pH到7.2。

3）过滤除菌：采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，过滤后分装于200ml小瓶中。

4）加入小牛血清10%。

请参阅图2a-2e，为未使用胶原蛋白情况下融合细胞在共聚焦显微镜下的照片。在本发明的操作步骤中不执行步骤S5即可获得本组未使用胶原蛋白情况下获得的融合细胞。其中，树突状细胞采用小鼠树突状细胞，肿瘤细胞采用小鼠黑色素瘤细胞。具体地，图2a为未使用胶原蛋白情况下融合细胞在明场20x共聚焦显微镜下的照片；图2b为未使用胶原蛋白情况下融合细胞用DAPI染细胞核20x共聚焦显微镜下的照片；图2c为未使用胶原蛋白情况下将小鼠树突状细胞染CSFE在20x共聚焦显微镜下的照片；图2d为未使用胶原蛋白情况下将小鼠黑色素瘤细胞染PKH26在20x共聚焦显微镜下的照片；图2e为图2c与图2d合并后的照片。

请结合参阅图3a-3e，为使用胶原蛋白情况下融合细胞在共聚焦显微镜下的照片。该组照片的样品为采用前述本发明的细胞融合方法制得，其各个步骤中采用的物质及参数与图2a-2e的样品制备方法中一致，其中，树突状细胞采用小鼠树突状细胞，肿瘤细胞采用小鼠黑色素瘤细胞，区别仅在于图2a-2e的样品未添加胶原蛋白。具体地，图3a为使用胶原蛋白情况下融合细胞在明场20x共聚焦显微镜下的照片；图3b为使用胶原蛋白情况下融合细胞用DAPI染细胞核20x共聚焦显微镜下的照片；图3c为使用胶原蛋白情况下将小鼠树突状细胞染CSFE在20x共聚焦显微镜下的照片；图3d为使用胶原蛋白情况下将小鼠黑色素瘤细胞染PKH26在20x共聚焦显微镜下的照片；图3e为图3c与图3d合并后的照片。

通过将图2a-2e与图3a-3e进行比较，可以明显地看到图3a-3e中使用胶原蛋白情况下，小鼠树突状细胞和小鼠黑色素瘤细胞的融合数量增多。请参阅图4，为未使用胶原蛋白和使用胶原蛋白进行细胞融合的融合率比较。从图4中可以看到，使用胶原蛋白进行细胞融合的融合率高达80%左右，而未使用胶原蛋白进行细胞融合的融合率仅为30%左右，因此本发明通过在诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法中增加胶原蛋白可以有效地提高细胞的融合率。

本发明所采用的PEG能使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。胶原蛋白可以使融合后细胞膜紧缩，修复细胞膜，从而形成稳定的融合细胞。经荧光显微镜和共聚焦显微镜检测和细胞实验证明，该方法融合效率高，对细胞损伤小。

实施例1

选择小鼠树突状细胞和B16小鼠黑色素瘤细胞融合的过程为：

1、首先将磷酸缓冲液、胶原蛋白和完全1640培养基分别置于37°C水浴备用。

2、消化B16小鼠黑色素瘤细胞并收集于50ml离心管A，收集小鼠树突状细胞于50ml离心管B，室温下分别以1500rpm离心10分钟。

3、分别加入20ml磷酸缓冲液重悬离心管A、B中的细胞并计数。

4、按B16小鼠黑色素瘤细胞:小鼠树突状细胞=1:2的数量比将离心管A、B中的两种细胞加入到50ml离心管C中，细胞总数控制在1×10⁷-5×10⁷个，涡旋混匀。

5、在室温下1500rpm离心10分。

6、弃去上清，用手指弹击离心管C使细胞分布相对均匀，再将离心管C置于40°C水浴3分钟。

7、将分子量为1500、质量浓度为50%（m/v）的聚乙二醇置于40°C水浴2分钟；

8、使用移液枪将200μl水浴加热后的聚乙二醇加入离心管C中，在1分钟内加完，边加边旋转枪头，加完后可以用枪头将细胞搅匀，将离心管C置于40°C水浴3-5分钟。

9、向离心管C中加入1ml磷酸缓冲液以终止反应，要求在1分钟内加完；再向离心管C中缓慢加入30-40ml磷酸缓冲液，加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管混匀溶液，以达到充分的终止。

10、将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟。

11、弃去上清，缓慢向离心管C中加入30-40ml磷酸缓冲液混匀，例如在3-5分钟内加完，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。

12、将离心管C在室温下1500rpm再次离心10分钟。

13、弃去上清，向离心管C中加入350μl磷酸缓冲液重悬细胞。

14、向离心管C中加入3-5μl胶原蛋白，并在37°C水浴30-50分钟。采用的胶原蛋白的相对分子量为：1600，质量浓度为50%（m/v）。

15、向离心管C中缓慢加入30ml磷酸缓冲液混匀，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。

16、将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟。

17、弃去上清，向离心管C中加入完全1640培养基重悬细胞，获得融合后的细胞。

该实施例所得的融合细胞效率高，适用于鼠源性肿瘤疫苗的研究。

实施例2

选择人树突状细胞与A549人肺癌细胞高效融合的具体步骤为：

1、首先将磷酸缓冲液、胶原蛋白和完全1640培养基分别置于37°C水浴备用。

2、消化A549人肺癌细胞并收集于50ml离心管A，收集人树突状细胞于50ml离心管B，室温下分别以1500rpm离心10分钟。

3、分别加入10-20ml磷酸缓冲液重悬离心管A、B中的细胞并计数。

4、按A549人肺癌细胞:人树突状细胞=1:5的数量比将离心管A、B中的两种细胞加入到50ml离心管C中，细胞总数控制在1×10⁷-5×10⁷个，涡旋混匀。

5、在室温下1500rpm离心10分。

6、弃去上清，用手指弹击离心管C使细胞分布相对均匀，再将离心管C置于40°C水浴5分钟。

7、将分子量为3000、质量浓度为50%（m/v）的聚乙二醇置于40°C水浴2分钟；

8、使用移液枪将1000μl水浴加热后的聚乙二醇加入离心管C中，在1分钟内加完，边加边旋转枪头，加完后可以用枪头将细胞搅匀，将离心管C置于40°C水浴5分钟。

9、向离心管C中加入1ml磷酸缓冲液以终止反应，要求在1分钟内加完；再向离心管C中缓慢加入30ml磷酸缓冲液，加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管混匀溶液，以达到充分的终止。

10、将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟。

11、弃去上清，缓慢向离心管C中加入40ml磷酸缓冲液混匀，例如在3-5分钟内加完，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。

12、将离心管C在室温下1500rpm再次离心10分钟。

13、弃去上清，向离心管C中加入200μl磷酸缓冲液重悬细胞。

14、向离心管C中加入2-8μl胶原蛋白，并在37°C水浴30-50分钟。采用的胶原蛋白的相对分子量为：4000，质量浓度为50%（m/v）。

15、向离心管C中缓慢加入30ml磷酸缓冲液混匀，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。

16、将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟。

17、弃去上清，向离心管C中加入完全1640培养基重悬细胞，获得融合后的细胞。

该实施例所得的融合细胞效率高，适用于人肿瘤疫苗的研究。

实施例3

选择DC2.4细胞和B16小鼠黑色素瘤细效融合的具体步骤为：

1、首先将磷酸缓冲液、胶原蛋白和完全1640培养基分别置于37°C水浴备用。

2、消化B16小鼠黑色素瘤细胞并收集于50ml离心管A，收集DC2.4细胞于50ml离心管B，室温下分别以1500rpm离心10分钟。

3、分别加入10-20ml磷酸缓冲液重悬离心管A、B中的细胞并计数。

4、按B16小鼠黑色素瘤细胞:DC2.4细胞=1:2的数量比将离心管A、B中的两种细胞加入到50ml离心管C中，细胞总数控制在1×10⁷-5×10⁷个，涡旋混匀。

5、在室温下1500rpm离心10分。

6、弃去上清，用手指弹击离心管C使细胞分布相对均匀，再将离心管C置于40°C水浴3分钟。

7、将分子量为6000、质量浓度为50%（m/v）的聚乙二醇置于40°C水浴2分钟；

8、使用移液枪将600μl水浴加热后的聚乙二醇加入离心管C中，在1分钟内加完，边加边旋转枪头，加完后可以用枪头将细胞搅匀，将离心管C置于40°C水浴3分钟。

9、向离心管C中加入1ml磷酸缓冲液以终止反应，要求在1分钟内加完；再向离心管C中缓慢加入40ml磷酸缓冲液，加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管混匀溶液，以达到充分的终止。

10、将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟。

11、弃去上清，缓慢向离心管C中加入30ml磷酸缓冲液混匀，例如在3-5分钟内加完，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。

12、将离心管C在室温下1500rpm再次离心10分钟。

13、弃去上清，向离心管C中加入800μl磷酸缓冲液重悬细胞。

14、向离心管C中加入2-8μl胶原蛋白，并在37°C水浴30-50分钟。采用的胶原蛋白的相对分子量为：2000，质量浓度为50%（m/v）。

15、向离心管C中缓慢加入30ml磷酸缓冲液混匀，边加边旋转离心管。加完后盖上离心管盖子，转动离心管，以达到充分的清洗。

16、将离心管C在室温下1500rpm离心10分钟。

17、弃去上清，向离心管C中加入完全1640培养基重悬细胞，获得融合后的细胞。

该实施例所得的融合细胞效率高，适用于杂种细胞的研究。