树突状细胞/肿瘤相关成纤维细胞融合疫苗诱导特异性T淋巴细胞抗肿瘤作用

摘要

手术、放疗、化疗和生物治疗是目前治疗恶性肿瘤的四大主要模式。其中主动免疫治疗通过打破肿瘤组织自身介导的免疫耐受与逃避，已成为主要的抗肿瘤方法之一。以树突状细胞(dendritic cells，DCs)为核心的肿瘤免疫治疗是近年来研究热点。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境建立的基础，对肿瘤发生、发展和转移起促进作用，因此靶向肿瘤相关成纤维的免疫治疗具有良好的应用前景。本研究在前期建立的高效率的DC/肿瘤细胞杂交细胞技术的基础上，拟将DC和CAF进行融合，使融合细胞既获得肿瘤微环境的CAF相关抗原，又保留树突状细胞特性，从而能特异性的将肿瘤相关成纤维细胞的完全性抗原呈递给T淋巴细胞，从而增强特异性T细胞介导的细胞免疫应答，并进一步从体内外实验验证其抗肿瘤作用及可能机制，建立起一种新的融合疫苗，从而为肿瘤免疫治疗提供一种新的策略。　　目的:　　将在DC/肿瘤融合细胞的基础上探索出一种新的DC/CAF融合细胞疫苗，扩增出大量对肿瘤微环境已知与未知抗原特异性的T淋巴细胞，使其成为一个具有特异性针对肿瘤微环境从而抑制杀伤肿瘤细胞的种子库，同时能特异性的抑制肿瘤的生长，以此探讨出一条行之有效的肿瘤免疫治疗新策略。　　方法:　　分离培养和鉴定H22肝癌相关成纤维细胞及对照组的正常组织成纤维细胞，并初步探讨两者生物学性状的差异。运用聚乙二醇2000(PEG2000)诱导制备杂交细胞疫苗(DC/CAF)，在荧光显微镜下观察融合疫苗制备成功，流式细胞术检测融合细胞表面分子的表达情况;利用ELISA的方法检测DC/CAF融合细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的能力;利用流式细胞仪检测出各组细胞刺激的T细胞增殖能力(PI);利用ELISA的方法检测T细胞分泌细胞因子IFN-α和IFN-γ的情况;利用流式细胞术来检测T细胞对靶细胞CAF的杀伤效率;采用H22肝癌小鼠模型验证DC/CAF融合细胞诱导的T细胞在体内的抗肿瘤作用，并观察小鼠的肿瘤生长情况和小鼠的生存期;利用Ki67核增殖实验和Tunel凋亡实验观察肿瘤细胞的核增殖和细胞凋亡情况。　　结果:　　1.从小鼠H22肝癌皮下移植瘤组织和鼠尾组织中可分别成功分离纯化得到纯度较高的CAF和正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs），从形态学上观察CAF呈梭型、多边形生长，经WB、流式细胞术、免疫荧光的方法检测，与NF相比CAF能高表达成纤维活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP)和α-平滑肌蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA);　　2.在PEG2000诱导下，DC/CAF融合细胞疫苗成功制备，经荧光共聚焦镜观察，经PKH-26染色的DC细胞呈红色，用CFSE染色的CAF细胞呈绿色，DAPI染细胞核呈蓝色，融合细胞呈现黄色，融合效率约60％。　　3.流式细胞仪检测:与未成熟DC细胞相比融合细胞能高表达CD80，CD86，MHC-Ⅱ，差别有统计学意义(P＜0.0001)。　　4.ELISA的方法检测结果表明:与单独DC组(DC)、单独CAF组(CAF)和DC单纯混合CAF组(DC mixed CAF)相比，DC/CAF融合细胞组(DC/CAF Fusion)能分泌浓度较高的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12(P＜0.0001)，接近于脂多糖(LPS)阳性对照组(P＜0.05)，差别有统计学意义;　　5.增殖指数(PI):DC/CAF Fusion+T cell组PI达到4.54，且细胞分化集中在第5代;DC mixed CAF+T cell组的PI为3.77，细胞分化多集中于第3代;而DC+T cell、CAF+T cell组PI均只有1.5左右，细胞分化集中于第1、2代;与其他组T cell(PI=1.47)、DC+T cell(PI=1.5)、CAF+T cell、(PI=1.73)和DC mixed CAF+T cell(PI=3.77)相比，DC/CAF Fusion+T cell组(PI=4.54)具有更强的刺激T细胞增殖的能力，差别有统计学意义(P＜0.0001);　　6.T细胞分泌细胞因子IFN-α和IFN-γ的量:与T cell、DC+T cell、CAF+T cell和DC mixed CAF+T cell组相比，DC/CAF Fusion+T cell组分泌细胞因子IFN-α和IFN-γ的量显著上升，(P＜0.05)差别有统计学意义;　　7.流式细胞仪检测杀伤率:按照不同的效靶比来检测，T:CAF=5∶1、10∶1、20∶1，每个效靶比中DC/CAF Fusion+T cell组的杀伤率与其他组(T cell、DC+T cell、CAF+T cell、DC mixed CAF+T cell)相比均明显提高，其中当效靶比为20∶1时，DC/CAF Fusion+T cell组对靶细胞的杀伤效率达到60％;　　8.只注射PBS治疗的组作为阴性对照。结果显示:与其他组(PBS、T cell、DC+T cell、CAF+T cell、DC mixed CAF+T cell)相比，DC/CAF Fusion+T cell组的小鼠肿瘤体积均小于其他组，差别有统计学意义(P＜0.0001);而处死后取出的肿瘤称量肿瘤重量及测量肿瘤大小也小于其他对照组;观察生存期可得到，与其他组相比DC/CAF Fusion+T cell组的生存期较延长，差别有统计学意义(P＜0.05)。　　9.免疫组织化学结果显示:荷瘤小鼠经T细胞过继治疗后，与其他组(PBS、T cell、DC+T cell、CAF+T cell、DC mixed CAF+T cell)相比，DC/CAF Fusion+T cell组治疗的荷瘤小鼠的肿瘤细胞中Ki67的表达量与显著下降，差别有统计学意义(P＜0.0001)，DC/CAF Fusion+T cell组治疗的荷瘤小鼠的肿瘤细胞中凋亡细胞数量明显增多，差别有统计学意义(P＜0.001)。　　结论:　　本研究成功的分离纯化鉴定了肿瘤相关成纤维细胞，验证其表达FAP和α-SMA蛋白能力。在PEG的诱导下成功制备DC/CAF融合细胞疫苗，证实了该融合疫苗具有高表达成熟DC细胞的相关蛋白CD80、CD86及MHC-Ⅱ类分子的能力，证明融合细胞能提高TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-12p的分泌，并具有显著刺激T细胞增殖的能力，增强T细胞分泌细胞因子IFN-α和IFN-γ能力。经DC/CAF融合疫苗诱导的特异性CTL在体外特异性杀伤CAF细胞，而经DC/CAF融合细胞诱导的特异性T淋巴细胞用于过继治疗荷瘤小鼠，能有效的杀伤肿瘤相关成纤维细胞，通过抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡，抑制小鼠肿瘤的生长，延长小鼠生存时间。该研究从肿瘤微环境的中肿瘤相关成纤维细胞的角度提供了一种新的肿瘤治疗策略。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1．材料

1．1 细胞系

1．2 实验动物

1．3．主要实验试剂

1．4 基本试剂的配制

1．5．主要仪器设备

2．实验方法

2．1 原代成纤维细胞的分离

2．2 免疫荧光鉴定肿瘤相关成纤维细胞

2．3 Western Blot鉴定原代成纤维细胞

2．4 流式细胞术鉴定原代成纤维细胞

2．5 BALB／c小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)制备

2．6 融合细胞的制备及CFSE／PKH-26染色法验证DC／CAF杂交细胞疫苗

2．7 流式检测DC／CAF杂交细胞疫苗表面分子的表达

2．8 ELISA法检测DC细胞因子的分泌情况

2．9 小鼠淋巴细胞的制备

2．10 CFSE增殖实验测定体外诱导下T细胞增殖情况

2．11 CFSE／PI法检测体外诱导的T细胞对CAF特异性的杀伤作用

2．12 ELISA法检测融合细胞刺激T细胞分泌IFN-α、IFN-γ的情况

2．13 小鼠肿瘤模型建立及治疗

2．14 免疫组化Ki67化学染色步骤

2．15 TUNEL法测凋亡实验步骤

2．16 统计分析

3．结果

3．1 肿瘤相关成纤维细胞和正常成纤维细胞的成功分离纯化

3．2 肿瘤相关成纤维细胞的鉴定

3．3 树突状细胞／成纤维细胞融合疫苗制备成功

3．5 DC／CAF融合细胞使DC细胞分泌细胞因子能力增强

3．6 DC／CAF融合细胞诱导的T细胞增殖活性增强

3．7 DC／CAF融合细胞诱导的T细胞分泌细胞因子能力增强

3．8 DC／CAF融合细胞体外诱导的特异性T淋巴细胞对CAF细胞的杀伤能力增强

3．9 DC／CAF融合细胞诱导的特异性T淋巴细胞能抑制小鼠皮下移植瘤的生长，延长小鼠的生存期

3．10 DC／CAF融合细胞诱导的特异性T淋巴细胞能抑制肿瘤组织中Ki67的表达和明显促进肿瘤细胞凋亡

4．讨论

全文总结

参考文献

综述 树突状细胞／肿瘤细胞杂交细胞抗肿瘤疫苗的研究进展

中英文缩略词对照表

致谢

攻读学位期间发表的学术论文