用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的密切相关的血清型的测定法

摘要

用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的多个血清型的实时Taq-Man PCR测定法，其中检测的血清型的数目超过用于检测的比色通道的数目。将生物学样品与3个寡核苷酸引物/探针组组合，以便探针和引物与靶序列退火。每一个引物/探针组至少对于生物体的特定血清型是偏向性的。第一和第二引物/探针组彼此是简并的。第三引物/探针组相对于第一和和二引物/探针组不是简并的并且辨别第三血清型。第三引物/探针组具有以这样的波长发射信号的信号部分，所述波长与由简并引物/探针组中的探针的信号部分发射的波长相同或不同。扩增和检测靶序列(如果存在的话)。

说明书

交叉参考相关申请

本申请要求2010年2月16日提交的美国临时专利申请No. 61/304,941的提交日的权益，所述临时专利申请的公开内容通过引用整 体并入本文。

序列表

本申请包含已通过EFS-Web提交并且通过引用整体并入本文的序列 表。于2011年1月31日创建的所述ASCII拷贝被命名为，用于检测HPV 的相关血清型的序列表，其大小为7.55千字节。

发明背景

已鉴定了超过80个类型的人乳头瘤病毒(HPV)。不同类型的HPV引 起了从良性增生性疣至恶性癌症的广泛多样的生物学表型(关于综述， 参见McMurray等人,Int.J.Exp,Pathol.82(1):15-33(2001))。 HPV6和HPV11是最常见的与良性疣相关的类型，然而HPV16和HPV18 是与恶性病损最频繁相关的高风险类型。因此，临床样品中HPV的具体 类型的确定对于预测发生HPV相关疾病的风险是至关重要的。

几种基于核酸的方法已被用于鉴定和定量临床样品中的特定HPV类 型，例如通过原位杂交、Southern印迹分析、杂交捕获或聚合酶链式反 应(PCR)来检测病毒核酸。HybridII(Qiagen,Inc., Valencia,CA)测定法使用抗体捕获和非放射性信号检测，但仅检测给 定组的HPV类型中的单个靶(参见，例如，Clavel等人,British J. Cancer 80(9):1306-11(1999))。此外，由于HybridII测 定使用RNA探针的混合物(针对高风险或低风险HPV类型的探针混合物 是可获得的)，其不提供关于样品中检测到的具体HPV类型的信息，而 仅指示高风险或低风险HPV的存在的阳性或阴性。类似地，许多基于PCR 的方法通常包括扩增单个特定HPV靶序列，随后将所得的扩增子印迹至 膜上，然后用放射性标记的寡核苷酸探针进行探测。

其它方法通过使用商购可得的、能够PCR扩增存在于样品中的多个 HPV类型的共有引物来利用不同类型的特定HPV基因之间的高同源性。 随后使用类型特异性寡核苷酸探针来鉴定特定HPV类型的存在。参见， 例如，Kleter等人,Journal of Clinical Microbiology 37(8): 2508-2517(1999);Gravitt等人,Journal of Clinical Microbiology 38(1):357-361(2000)。类似地，利用简并PCR引物的测定法利用了 HPV类型之间的同源性，从而允许检测更多的HPV类型(与利用特定引物 组的方法相比较)。参见，例如，Harwood等人,Journal of Clinical  Microbiology 37(11):3545-3555(1999)。此类测定还需要另外的实 验来鉴定具体的HPV类型。

上述PCR法可与几个问题相关。例如，HPV类型之间反应效率的差 异可导致一些类型相对于其它类型的不成比例的扩增。此外，扩增的平 衡被驱向以更高的拷贝数存在于样品中的那些类型，所述类型将消耗 PCR反应组分，从而使得更不可能扩增含量较少的HPV类型。

本领域中还描述了基于5'外切核酸酶荧光PCR测定(Taq-Man PCR)， 其允许实时检测PCR产物和消除对放射性的需要。参见，例如，美国专 利No.5,538,848;Holland等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 7276-7280(1991)。该方法利用标记的探针，其包含荧光报告分子(荧 光团)和与PCR引物之间的靶DNA杂交的猝灭剂。荧光团的激发导致荧 光团释放荧光信号，该荧光信号可被猝灭剂猝灭。可利用TAQ DNA聚合 酶的5'-3'外切核酸酶活性检测扩增子，该酶在PCR引物的延伸过程中 降解遇到的双链DNA，从而从探针释放荧光团。此后，荧光信号不再被 猝灭，并且可利用自动化荧光计实时检测荧光信号的积累(其与靶DNA 的量直接相关)。

Taq-Man PCR测定法已被改造用于检测HPV类型。Swan等人(Journal  of Clinical Microbiology 35(4):886-891(1997))公开了，利用扩 增L1基因的一部分的类型特异性HPV引物和类型特异性探针的荧光探 针测定法。Swan等人的测定法在固定数目的PCR循环结束时测量(终点 读取)，而非实时测量，荧光信号。

Josefsson等人(Journal of Clinical Microbiology 37(3): 490-96(1999))报导了Taq-Man测定法，该测定法结合用不同荧光染料 标记的类型特异性探针，靶向E1基因的高度保守的部分。通过利用特 异性和简并引物的混合物来扩增多个HPV类型。Josefsson等人利用每 个测定多达3种类型特异性探针，所述探针经设计用于检测来自不同 HPV类型的E1基因的部分。与Swan等人的测定法不同，Josefsson等 人实时测量荧光的积累。

Tucker等人(Molecular Diagnosis 6(1):39-47(2001))描述了靶 向横跨E6/E7联接处的保守区域的测定法。与Josefsson测定法相同， Tucker等人利用实时检测和类型特异性荧光探针。Tucker等人还利用 多重PCR来在相同反应管中同时检测HPV靶序列和肌动蛋白或珠蛋白细 胞基因座。

HPV检测的一个具体挑战是，存在许多临床关注的HPV类型。虽然 用于HPV检测的多重测定法是已知的，但多重测定法受到用于检测的比 色通道的数目限制。这些通道是不同波长的光(或波长范围或波段)。每 一个通道检测由发射特定通道波长的光的信号部分发射的信号。所检测 的HPV类型的数目因而受到测定中不同的、可清楚检测的信号部分的数 目限制。

尽管开发了上述HPV测定法，但开发这样的多重测定法是有利的， 所述测定法具有高度灵敏性和可重现性，并且与本领域公开的方法相 比，需要减少的工时。鉴于存在多种HPV类型，检测比测定法的检测通 道更多的HPV类型是有利的。

发明概述

本发明涉及使用Taq-Man化学来同时检测比用于检测的通道更多的 类型的HPV的实时PCR扩增。换句话说，在具有N个通道的测定中，被 检测的HPV类型的数目为至少N+1。

该测定法使用引物/探针组来检测所述测定法经构造用于检测其的 每一种HPV类型。在易于通过所述测定法检测的各种血清型中，包括例 如HPV 33、39、51、56、58、59、66和68型。本领域技术人员将理解， 可将本文中描述的探针/引物组与用于其它HPV类型(例如16、18和45) 的其它引物/探针组组合。使用单个引物探针组来检测至少一个类型。 在使用Taq-Man测定法的PCR扩增的背景中，引物探针组为至少一个正 向引物、一个反向引物和一个探针。可利用一对引物探针组(其具有相 对于彼此是简并的寡核苷酸序列)来选择至少两个类型。如本文中所使 用的，“简并序列”为与不同的密切相关的类型的相同基因的相同基因 座互补并且彼此具有少数序列变异(以使它们能够辨别所述两种类型) 的两个寡核苷酸引物或探针。

在本发明的一个实施方案中，简并引物探针组用于检测HPV 39和 68型。引物/探针组靶向两种类型的E6基因上的相同基因座。靶长度为 91个核苷酸并且示例于图1中。靶仅为完整E6基因的区段。HPV 39和 68型的简并引物/探针组的靶为SEQ ID NO.36。在优选实施方案中， 两个探针的信号部分为，可作为CY5商购获得的花青染料标记物。

在该实施方案中，非简并的引物探针组辨别HPV 51型。针对51型 的引物/探针组也靶向E6基因，虽然在不同的基因座中。在优选实施方 案中，用于该引物探针组的该探针的信号部分为FAM，其在下文中被特 异性鉴定。

在本发明的第二实施方案中，简并引物/探针组用于检测HPV 33和 58型。所述引物/探针组靶向两种类型的E6基因上的相同基因座。靶长 度为138个核苷酸并且示例于图2中。靶仅为完整E6基因的区段。针 对HPV 33和58型的简并引物/探针组的靶为SEQ ID NO.37。在优选实 施方案中，用于两种探针的信号部分为FAM。

在该实施方案中，非简并的引物探针组辨别HPV 59型。针对59型 的引物/探针组也靶向E6基因，但不必是相同的基因座。在优选实施方 案中，用于该引物探针组的该探针的信号部分为CY5，其在下文中被特 异性鉴定。

在本发明的第三实施方案中，简并引物/探针组用于检测HPV 56和 66型。所述引物/探针组靶向两种类型的E6基因上的相同基因座。靶长 度为79个核苷酸并且示例于图3中。靶仅为完整E6基因的区段。针对 HPV 56和66型的简并引物/探针组的靶为SEQ ID NO.38。在优选实施 方案中，两种探针的信号部分为CY5。

在该实施方案中，非简并的引物探针组辨别HPV 59型。针对59型 的引物/探针组靶向E6基因。在优选实施方案中，用于该引物探针组的 该探针的信号部分为CY5，其在下文中被特异性鉴定。在该实施方案中， 用于HPV 59型的相同信号部分也用于HPV 56_66型。由于相同的染料 位于相同的通道上，因此在该实施方案中，不能光学辨别HPV 59型与 56_66型。

该实施方案涉及多重测定，其还利用针对另一种HPV血清型的另一 个引物/探针组(简并的或有辨别力的)(例如，针对HPV血清型33和58 的简并引物/探针组)。用于该其它HPV血清型的信号部分不是CY5，并 且以这样的波长发射，所述波长可检测地不同于Cy5的发射波长(例如 FAM)。

在其它实施方案中，用于HPV 59型探针的信号部分为FAM，其在光 学上可与用于针对HPV血清型56和66的简并引物/探针组的CY5信号 部分区分开。

可选择的实施方案涉及测定法或探针组或试剂盒，其具有本文中描 述的引物/探针组和简并引物/探针组的任何和所有组合。具体地，可将 针对HPV血清型HPV 51或HPV 59的任何引物/探针组与针对HPV血清 型HPV 39_68、HPV 33_58和HPV 56_66的任何简并引物/探针组组合。 特别涉及的是测定法或探针组或试剂盒，其将针对HPV 51的引物/探针 组与针对HPV 39_68、HPV 33_58和HPV 56_66中的一个或多个的简并 引物探针组组合。测定法或探针组或试剂盒，其将针对HPV 59的引物/ 探针组与针对HPV 39_68、HPV 33_58和HPV 56_66中的一个或多个的 简并引物探针组组合。涉及这样的实施方案，其中用于探针的信号部分 为相同的或不同的染料。由于涉及多重测定法，因此可将引物/探针组 与经构造用于检测其它血清型的HPV的存在或不存在的其它引物/探针 组组合。在其中用于简并引物/探针组的检测探针的信号部分与用于针 对HPV血清型51或59的引物/探针组的信号部分相同的实施方案中， 预期多重测定法可包括针对HPV的第4血清型(例如HPV 31、HPV 52、 HPV 45等)的第四引物/探针组，并且预期第四引物/探针组具有与用于 简并引物/探针组和HPV 51或59引物/探针组的检测子探针的信号部分 不同的信号部分。此外，本文中还涉及多重测定法，其中在一个测定中 组合两个简并引物/探针组。例如，在一个微孔中，可将用于检测HPV 血清型33和58的存在的第一简并引物/探针组与用于检测HPV血清型 56和66的存在或不存在的第二简并引物/探针组组合。在这些实施方案 中，第一简并引物探针组的探针具有以这样的波长发射的信号部分，所 述波长与用于第二简并引物/探针组的信号部分的发射波长可检测地不 同。在该实例中，用于HPV血清型33和58的信号部分可以为FAM并且 用于HPV血清型56和66探针的信号部分可以为CY5。

除了上述信号部分外，探针还具有非荧光暗猝灭剂。适当的暗猝灭 剂的一个实例为BHQ^TM 1(Biosearch Technologies)，其适合于与FAM 荧光团一起使用。适当的猝灭剂的另一个实例为BHQ^TM 2(Biosearch  Technologies)，其适合于与CY5荧光团一起使用。信号部分的其它实 例对于本领域技术人员来说是公知的并且在本文中未进行详细描述。

如本文中所使用的，术语“引物”是指，当置于其中催化与核酸链 互补的引物延伸产物的合成的条件下时，能够用作沿着互补链的合成的 起始点的寡核苷酸。这样的条件包括，在适当的温度下在适当的缓冲液 (“缓冲液”包括作为辅因子，或影响离子强度、pH等的组分)中存在4 种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂例如DNA聚合酶或逆转录 酶。如本文中所使用的，寡核苷酸引物可天然存在于例如纯化的限制酶 消化产物中，或可合成产生。引物优选为单链，以获得最大扩增效率。

如本文中所使用的，“引物对”是指能够在核酸聚合酶存在的情况 下参与核酸区段的PCR扩增以产生PCR扩增子的两条引物(正向引物和 反向引物)。引物对包含的引物可以特异于相同的HPV基因，从而产生 由来源于单个HPV基因的核苷酸序列组成的扩增子。或者，引物对包含 的引物可以特异于在HPV基因组内彼此十分靠近的不同HPV基因，从而 产生由来源于超过一个基因的核苷酸序列组成的扩增子。

如本文中所使用的，对于本发明的荧光团，“不同的成像光谱”意 指，每一个荧光团在特定测定中相对于使用的所有其它荧光团以不同的 发射峰(emission maxima)发射能量。具有独特发射峰的荧光团的使用 允许同时检测，由特定测定中使用的多个荧光团中的每一个发射的荧光 能量。

如本文中所使用的，对于本发明的寡核苷酸引物和探针，术语“有 辨别力的”意指，所述引物和探针对于单个HPV类型是特异性的。其包 括特异于单个HPV类型但与其它HPV类型共有一些同源性的HPV引物和 探针。本发明的“有辨别力的”引物和探针包括，在至少一个或更多个 核苷酸上与其它HPV类型不存在3'同源性的那些寡核苷酸。在特定位置 上对于特定HPV类型是独特的并且用于在比对中区分所述HPV类型与其 它类型的此类残基称为“辨别碱基(discriminatory base)”。对于寡 核苷酸，术语“有辨别力的”不包括特异于超过一种HPV类型的引物和 探针，即，与超过一种HPV类型共有完全同源性的引物和探针。在这一 点上，本文中公开的简并引物/探针组不能区分针对其构造所述简并引 物/探针组的HPV类型。例如，对于靶向HPV 39和68型的简并引物/探 针组，针对HPV 39型的引物/探针组对于HPV 39型具有偏向性(相对于 HPV 68型)，但不能区分HPV 39型与HPV 68型。因为简并引物/探针组 不能区分HPV类型，因此探针优选具有相同的信号部分。由于测定法经 构造用于确定这些HPV类型在聚集体中的存在或不存在，因此对于该目 的，不必使用两个光学通道。此外，当将简并引物/探针组在单个微孔 中与其它引物/探针组组合用于多重测定时，用于其它引物/探针组(有 辨别力的或没有辨别力的)的信号部分可以相同或不同。用于测定的信 号部分在很大程度上是设计选择的问题。当必需了解是否存在特定HPV 类型时，本领域技术人员将在相同微孔中使用相同的用于引物/探针组 的信号部分。当了解这些类型中只要有一个类型存在就足够时，可在针 对不同HPV血清型的引物/探针组上使用相同的信号部分。

如本文中所使用的，“扩增子”是指，PCR反应的特定产物，其在 核酸聚合酶和特定引物对存在的情况下通过PCR扩增包含核酸的样品而 产生。扩增子可由来源于单个HPV类型的单个基因的核苷酸序列组成或 扩增子可由来源于单个HPV类型的超过一个基因的核苷酸序列组成。

如本文中所使用的，“引物/探针组”是指，一组与单个HPV类型 的特定核苷酸序列杂交的寡核苷酸探针和成对寡核苷酸引物。所述寡核 苷酸组由下列组成：(a)与HPV类型的核酸序列的第一位置杂交的正向 辨别引物；(b)与在所述第一位置下游的所述HPV类型的核酸序列的第 二位置杂交的反向辨别引物和(c)用荧光团和猝灭剂标记的荧光探针， 其与所述引物之间的所述HPV类型的核酸序列的位置杂交。换句话说， 寡核苷酸组由一组能够起始特异于单个HPV类型的扩增子的合成的特异 性PCR引物和与所述扩增子杂交的荧光探针组成。

如本文中所使用的，“多个”意指两个或更多个。

如本文中所使用的，对于寡核苷酸组、寡核苷酸引物或寡核苷酸探 针，“特异性杂交”意指，所述寡核苷酸组、引物或探针与单个HPV类 型的核酸序列杂交。

如本文中所使用的，“基因”意指，参与产生多肽链的核酸区段。 其包括翻译序列(编码区)以及5'和3'非翻译序列(非编码区)，以及单 独的编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。为了描述本发明的实 施方案，HPV基因组具有多个基因：例如，L1、L2和E1、E2、E4-E7。

如本文中所使用的，“基因座”是指，染色体上性状基因存在的位 置。术语基因座包括特定基因的等位基因的任一个。其还包括来自不同 HPV类型的同源基因。例如，检测HPV16和HPV6中的L1基因的PCR测 定法是单基因座测定法，尽管检测来自不同HPV类型的序列。相反地， 例如，检测单个HPV类型的L1基因和E1基因的测定法是多基因座测定 法，即使检测单个HPV类型。

如本文中所使用的，“HPV”意指人乳头瘤病毒。“HPV”为用于指 任何类型的HPV(无论是目前已知的还是以后描述的)的一般术语。

如本文中所使用的，“荧光团”是指在用激光、钨、水银或氙气灯 或发光二极管激发后以具有确定的光谱的光的形式释放能量的荧光报 告分子。通过荧光共振能量转移(FRET)的方法，从荧光团发射的光可激 发其激发光谱与所述荧光团的发射光谱重叠的第二分子。荧光团的发射 能量至另一个分子的转移猝灭了所述荧光团的发射。第二分子称为猝灭 剂分子。术语“荧光团”在本文中可与术语“荧光报告分子”互换使用。

如本文中所使用的，“猝灭剂”或“猝灭剂分子”是指，当与包含 荧光团的荧光探针连接时能够接收由荧光团发射的能量，从而猝灭荧光 团的发射的分子。猝灭剂可以是以光的形式释放接收的能量的荧光猝灭 剂，或以热的形式释放接收的能量的非荧光猝灭剂，并且可沿着探针的 长度在任何位置连接。

如本文中所使用的，“暗猝灭剂”是指非荧光猝灭剂。

如本文中所使用的，“探针”是指，因探针的至少一个序列与靶区 域或待检测的区域中的序列的互补性而能够与靶核酸中的序列形成双 链体结构的寡核苷酸。术语“探针”包括连接或未连接荧光团和猝灭剂 分子的上述寡核苷酸。术语“荧光探针”是指包含荧光团和猝灭剂分子 的探针。

如本文中所使用的，“FAM”是指荧光团6-羧基-荧光素。

本发明的其它实施方案使用结合HPV的E6/E7基因区域的不同的寡 核苷酸序列。本文中描述的寡核苷酸具有能够结合靶核酸序列(及其互 补链)的序列。还可单独地或组合地使用本文中描述的寡核苷酸，以通 过扩增HPV E6/E7基因的核酸序列来帮助检测。在一个实施方案中，探 针经设计用于对基因的靶部分进行实时PCR测定。下文中描 述了用于实时PCR测定的3个简并探针组的实例(根据其寡核 苷酸序列进行描述)。

特别地，在其中第一简并引物/探针组是针对HPV 39和68型的第 一实施方案中，偏向于HPV 39型的引物/探针组为SEQ ID NOS:1、3 和5。偏向于HPV 68型的引物/探针组为SEQ I D NO.2、4和6。SEQ ID NOS 1和2都是Taq-Man正向引物并且彼此是简并的。SEQ ID NOS 3和 4都是Taq-Man反向引物并且彼此是简并的。SEQ ID NOS 5和6都是 Taq-Man探针并且彼此是简并的。针对HPV 33和58型的简并引物/探针 组为SEQ ID NO.7-16，其包括两组备选的反向引物序列，SEQ ID NO.13 和14是优选的。针对HPV 56和66型的简并引物/探针组为SEQ ID NO. 17-23。选择或辨别HPV血清型51的引物/探针序列为SEQ ID NO.24-29。 选择或辨别HPV 59型的引物/探针序列为SEQ ID NO.30-35。下面表1 中列举了上述所有序列。在下面的表中，"D"为检测子，"FP"为正向引 物，"RP"为反向引物。

表1

上表中所述的引物/探针组的靶区域的位置描述于下列表1A中:

表1A:靶区域的位置

  基因型  GenBank登录号   靶区域坐标

  39   M62849   287-377   68   EU918769   181-271   33   M12732   152-288   58   D90400   153-289   56   X74483   747-825   66   EF177190   747-825

虽然在简并引物/探针组的靶区域之间存在序列同源性，但这些区 域的坐标是基因型依赖性的。

在其它实施方案中，所述方法包括，使用至少一个选择两个不同的 但密切相关的HPV类型的简并引物/探针组和辨别第三HPV类型的引物/ 探针组处理样品，其中用于简并探针的信号部分发射相同波长的信号并 且优选，对于两个简并探针是相同的信号部分。辨别第三HPV类型的引 物/探针组的信号部分以这样的波长发射信号，所述波长与用于简并探 针的信号部分发射的波长不同，从而可分别地检测。这些引物/探针组 用于核酸扩增反应中，以检测扩增的核酸产物的存在或不存在。

在另一个实施方案中，提供了用于检测HPV的试剂盒。试剂盒包括 至少一个选择两个不同的但密切相关的HPV类型的简并引物/探针组和 辨别第三HPV类型的引物/探针组，其中用于简并探针的信号部分发射 相同波长的信号并且优选，对于两个简并探针是相同的信号部分。辨别 第三HPV类型的引物/探针组的信号部分以这样的波长发射信号，所述 波长与用于简并探针的信号部分发射的波长不同，从而可分别地检测。 可将能够扩增靶序列的引物/探针组用于检测该生物体。提供了试剂盒， 其具有用于进行扩增测定的一种或多种寡核苷酸和缓冲试剂。

在试剂盒的另一个方面，可提供用于Taq-Man PCR的寡核苷酸和试 剂。在该方面，提供了3种寡核苷酸。所述3种寡核苷酸中的2种为扩 增引物，第三寡核苷酸被构造为检测子。

附图概述

图1举例说明了HPV 68型的E6基因靶区域，且示意性地描述了该 靶序列在下列的各种突变之间的简并性：HPV 68型、HPV 39型和HPV 39 型的突变，以及针对HPV 39和68型的简并引物/探针组;

图2A-B举例说明了HPV 33型的E6基因靶区域，且示意性地描述 了该靶序列在下列的各种突变之间的简并性：HPV 33型、HPV 58型和 HPV 33型的突变，以及针对HPV 33和58型的简并引物/探针组;和

图3举例说明了HPV 66型的E7基因靶，且示意性地描述了该靶序 列在下列的各种突变之间的简并性：HPV 66型、HPV 56型和HPV 56型 的突变，以及针对HPV 56和66型的简并引物/探针组。

发明详述

本文中描述的寡核苷酸探针和探针组被专门设计用于选择或辨别 HPV类型。特别地，将对于两个密切相关的HPV类型之一具有一定选择 性的简并引物/探针组与辨别第三HPV类型(其与所述密切相关的HPV类 型不同)的至少一个其它的引物/探针组组合。

当特定HPV类型存在于样品中时，引物/探针组提供了可检测的信 号。

在优选实施方案中，使用PCR(例如Taq-Man PCR)检测方法，虽然 也可使用其它方法(例如TMA和LCR)。此外，公开了试剂盒，其用于检 测比用于检测的通道更多的HPV类型。

参考图1，根据它们与E6基因的示例性靶区域的比对，描述了特异 于HPV类型的简并引物/探针组。图1举例说明了正向引物区域10、 Taq-Man检测区域20和反向引物区域30。图1还举例说明了与它们在 靶序列40上的相应区域相关的简并正向引物11、12，简并反向引物31、 32以及简并探针21和22。仅将靶序列40中与正向引物区域、反向引 物区域和检测子区域相关的变异在框60、70和80中进行举例说明。标 出了这些区域之间的序列简并性，并且由此可观察到，这些区域是较不 想要的(由于增加的序列变异)。

例如，在框60中指出，在由框60界定的靶序列40的部分与HPV 39 型靶的相同E6部分之间存在单核苷酸多态性(T,C)。框60、70和80 举例说明与HPV 68型和39型的不同株系的靶相关的核苷酸多态性。这 些不同的株系以及核苷酸多态性(相对于靶)的数目和位置报告于表2 中。

表2:图1中示例的相对于靶的多态性

针对HPV 39的正向引物11具有单核苷酸多态性，从而相对于针对 HPV 68的正向引物12是简并的。正向引物11为SEQ ID NO.1并且正 向引物12为SEQ ID NO.2。可容易地观察到这两个序列之间的简并性:

CCACTAGCTGCATGCCAATC

CCATTAGCTGCATGCCAATC

各自的简并性通过下划线标示。

简并性使得正向引物偏向于结合HPV 39型并且正向引物12偏向于 结合HPV 68型。简并引物/探针组偏向于结合一个HPV类型的靶(相对 于另一个类型)，但不区分它们。根据附图，描述了与靶相关的引物/探 针组。框60、70和80包含关于HPV 39和68型之间在由框60、70和 80界定的靶区域40中的简并性的信息。这是定位参考而非杂交参考。 特别地，反向引物31和32(SEQ ID NO.3和4)具有这样的序列，其为 它们在靶40上的相应位置中的序列的反向互补序列。类似地，检测子 探针21和22(SEQ ID NO.5和6)为它们在靶40上的相应位置中的序 列的反向互补序列。正向引物11和12(SEQ ID NO.1和2)与它们在靶 40上的相应位置中的序列同源。

图2A-B与图1类似，但是针对选择HPV 33和58型的简并引物/探 针组。框160、170和180举例说明了与HPV 33和58型的不同株系的 靶相关的核苷酸多态性。这些不同的株系以及核苷酸多态性(相对于靶) 的数目和位置报告于表3中。多态性的位置示于图2中。

表3:图2A-B中示例的相对于靶的多态性

  类型/株系   多态性的数目   33型   33_A9_High_10586EF422125.seq   3[C(30);A(62);C(63)]   33_A9_High_10586EF422126.seq   3[C(62);C(63);T(52)]   33_A9_High_10586EF566920.seq   3[C(62);C(63);A(99)]   33_A9_High_10586EF566921.seq   2[C(62);C(63)]   33_A9_High_10586EF918766.seq   4[G(58);C(62);C(63);G(122)]   33_A9_High_10586GO374550.seq   1[A(62)]   33_A9_High_10586GO374551.seq   2[G(54);A(62)]   33_A9_High_10586GO374552.seq   2[T(10);A(62)]   33_A9_High_10586M12732.seq   2[A(62);C(63)]   BD670grp33900bp.seq   1[A(62)]   BD783-33900bp.seq   3[C(62);C(63);C(92)]   BD783-33clone 900bp.seq   2[C(62);C(63)]   TI093-33900bp.seq   2[G(54);A(62)]   58型   HPV_58D60400.seq   23[关于位置，参见图2A-B]   T-275-58900bp.seq   22[关于位置，参见图2A-B]   T-276-58900bp.seq   24[关于位置，参见图2A-B]   T-817-58clone 900bp.seq   23[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598AF478160   23[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598AF478167   22[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598AF234531   23[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598AF478157   23[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598EU080239   25[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598FJ407192   24[关于位置，参见图2A-B]

  58_A9High E610598GO248229   23[关于位置，参见图2A-B]   58_A9High E610598GO248253   22[关于位置，参见图2A-B]

图2A-B举例说明正向引物区域110、Taq-Man检测区域120和反向 引物区域130。图2A-B还举例说明了与它们在靶序列140上的相应区域 相关的简并正向引物111、112、简并反向引物131、132和简并探针121 和122。在框160(图2A)、170和180(图2B)中仅举例说明靶序列140 中与正向引物区域、反向引物区域和检测子区域相关的变异。

例如，在框160中指出，在由框60界定的靶序列140的部分与HPV 33型靶的相同E6部分之间存在单核苷酸多态性(T、G、G)。然而，针对 HPV 58的正向引物112具有3个核苷酸多态性，从而相对于针对HPV 33 的正向引物111是简并的。正向引物111为SEQ ID NO.7，正向引物 112为SEQ ID NO.8。可容易地观察到这两个序列之间的简并性:

TGTGCCAAGCATTGGAGACA

TGTGTCAGGCGTTGGAGACA

各自的简并性通过下划线标示。

简并性使得正向引物111偏向于结合HPV 33型并且正向引物112 偏向于结合HPV 58型。简并引物/探针组偏向于结合一个HPV类型的靶 (相对于另一个类型)，但不区分它们。根据附图，描述了与靶相关的引 物/探针组。框160、170和180包含关于HPV 33和58型之间在由框160、 170和180界定的靶区域140中的简并性的信息。这是定位参考而非杂 交参考。特别地，反向引物131和132(例如SEQ ID NO.13和14)具 有这样的序列，其为它们在靶140上的相应位置中的序列的反向互补序 列。类似地，反向探针121和122(SEQ ID NO.15和16)为它们在靶 140上的相应位置中的序列的反向互补序列。正向引物111和112(SEQ  ID NO.7和8)与它们在靶140上的相应位置中的序列同源。

图3与图1和2类似，但是针对选择HPV 56和66型的简并引物/ 探针组。图3举例说明了正向引物区域210、Taq-Man检测区域220和 反向引物区域230。框260、270和280举例说明了与HPV 66和56型的 不同株系的靶相关的核苷酸多态性。这些不同的株系以及核苷酸多态性 (相对于靶)的数目和位置报告于表2中。

表4:图3中举例说明的相对于靶的多态性

图3还举例说明与它们在靶序列240上的相应区域相关的简并正向 引物211、212、简并反向引物231、232和简并探针221和222。在框 260、270和280中仅举例说明靶序列240中与正向引物区域、反向引物 区域和检测子区域相关的变异。

例如，在框260中指出，HPV 66靶与HPV 56靶之间在由框260界 定的靶序列240的部分之间存在两个单核苷酸多态性(T、C)。然而，针 对HPV 56的正向引物2112具有单核苷酸多态性，从而相对于针对HPV 66 的正向引物211是简并的。正向引物211为SEQ ID NO.17，正向引物 212为SEQ ID NO.18。可容易地观察到这两个序列之间的简并性:

ACCTAATACACGTACCTTGTT

ACCTAATTCACGTACCTTGTT

各自的简并性通过下划线标示。

简并性使得正向引物211偏向于结合HPV 56型并且正向引物212 偏向于结合HPV 66型。简并引物/探针组偏向于结合一个HPV类型的靶 (相对于另一个类型)，但不区分它们。根据附图，描述了与靶相关的引 物/探针组。框260、270和280包含关于HPV 56和66型之间在由框260、 270和280界定的靶区域240中的简并性的信息。这是定位参考而非杂 交参考。特别地，反向引物231和232(SEQ ID NO.19和20)具有这样 的序列，其为它们在靶240上的相应位置中的序列的反向互补序列。类 似地，探针221和222(SEQ ID NO.22和23)为它们在靶240上的相应 位置中的序列的反向互补序列。正向引物211和212(SEQ ID NO.17 和18)与它们在靶140上的相应位置中的序列同源。虽然未具体地进行 讨论，但可容易地观察到简并引物探针组中的反向引物和探针之间的简 并性。

除了本文中描述的简并引物/探针组的实例外，本领域技术人员基 于本文中的描述和附图，能够鉴定可针对其设计简并引物/探针组的密 切相关的血清型的其它靶区域。如可通过图容易地观察到的，期望的靶 区域在各个血清型之间具有很少的多态性。可按照本文中描述的方式， 在简并引物/探针组的设计中解决这些存在的多态性。

如下文所述，引物和探针可结合靶序列，即使它们与这些区域具有 低于100%的互补性。需要的互补性程度取决于多个因素，包括结合条件 的严紧性。取决于使用的严紧性条件，可修饰引物和探针以在它们的序 列中包含不同的碱基并且仍然充分互补以结合核酸的靶区域。如本文中 所使用的，充分互补包括70%或更高的互补性。在优选实施方案中，引 物/探针对它们的靶序列的互补性在引物/探针的结合部分的长度范围 内为至少80%。更优选地，引物和探针对其靶序列的互补性为90%或更 高。

换言之，本发明涉及与本文中通过SEQ ID明确确定的引物和探针 具有至少70%同源性的引物和探针。在优选实施方案中，涉及与本文中 通过SEQ ID明确确定的引物和探针具有至少80%同源性的引物和探针。 更优选地，涉及与本文中通过SEQ ID明确确定的引物和探针具有至少 90%同源性的引物和探针。

虽然本文中描述的寡核苷酸必须是充分互补的，以结合它们所辨别 的HPV靶的各自的部分，但在某些点上应承认，寡核苷酸的序列与其靶 的互补性变小并且可能结合其它核酸序列。因此，期望寡核苷酸探针与 其各自的靶基因的部分保持充足地互补，并且不丧失对其各自的靶结合 位点的选择性。

寡核苷酸扩增引物内的靶结合序列通常可位于其3'末端。靶结合序 列在长度上可为约10-25个核苷酸并且可赋予扩增引物杂交特异性。因 此，应理解，本领域技术人员可改变靶结合序列以有效地改变扩增引物 的杂交特异性和指导对可选择的序列的杂交。

本领域技术人员理解，可将扩增测定中使用的寡核苷酸修饰至一定 程度而不丧失针对靶序列的功用或特异性。例如，如本领域中已知的， 互补和部分互补的核酸序列的杂交可通过调整杂交条件以增强或减弱 严紧性(即，调整杂交温度或缓冲液的盐浓度)来获得。公开的序列的此 类较小的修饰以及维持靶-特异性的杂交条件的任何必需的调整只需要 常规实验即可进行，并且在本领域技术人员的能力范围内。

作为设计用作引物的寡核苷酸的一般指导，序列同源性每减少1%， T_m则下降约1℃-1.5℃。温度范围可在约60℃与70℃之间变化，但可设 计引物以在60℃±4℃下表现最佳，并且可设计探针以在70℃±4℃下 表现最佳。当设计扩增引物时，其它考虑因素可以是鸟嘌呤和胞嘧啶的 含量。通常，引物的GC含量可以为约60-70%，但也可以更低，并且可 由本领域技术人员适当地调整。退火互补和部分互补的核酸序列可通过 改变退火条件以增强或减弱严紧性(即，调整退火温度或缓冲液的盐浓 度)来获得。变动例如针对公开的序列的变动以及维持基因特异性的退 火条件的任何必要的调整仅需要常规实验即可进行，并且在本领域技术 人员的能力范围内。

利用本文中描述的引物的扩增反应可掺入胸腺嘧啶，如由Walker, 等人(同上)所教导的，或它们可完全或部分地在反应中用2'-脱氧尿苷 5'-三磷酸替代TTP以减少随后的扩增反应的交叉污染，例如，如EP 0 624643中所教导的。dU(尿苷)被掺入扩增产物并且可通过利用尿嘧啶 DNA糖基化酶(UDG)的处理切除。这些无碱基位点使得扩增产物在随后的 扩增反应中不能被扩增。UDG可在进行随后的扩增之前用尿嘧啶DNA糖 基化酶抑制剂(Ug i)灭活，以防止新形成的扩增产物中的dU被切除。

预期用于本发明的PCR DNA聚合酶具有5'-3'外切核酸酶活性(例 如，来自Promega的测序级Taq或来自New England BioLabs的Deep Vent_R^TM(exo-)DNA)。探针与PCR扩增引物下游的靶杂交。随着下游内 切核酸酶合成从其间置有探针的引物进行，探针被置换。由于热循环是 PCR扩增的特征，因此优选在引物退火和延伸的终循环后在低温下添加 限制性内切核酸酶，以进行扩增的终点检测。然而，在PCR反应的整个 高温期保持活性的嗜热限制性内切核酸酶可在扩增过程中存在以提供 实时测定。二级结构的线性化和染料对的分离减少了荧光猝灭，荧光参 数例如强度的变化用作靶扩增的指示。

可在反应中在选择的终点上检测因检测子寡核苷酸的展开或线性 化而引起的荧光变化。然而，因为线性化的二级结构与杂交或引物延伸 同时产生，因此也可随着反应进行(即“实时”)，监测荧光的变化。该 均相的实时测定形式可用于提供关于存在的靶的初始量的半定量或定 量信息。当存在更多的靶序列的初始拷贝时，供体荧光更快速地达到所 选择的阈值(即，更短的达到阳性的时间)。受体荧光的减少类似地显示 更短的达到阳性的时间，检测为达到所选择的最小值所需的时间。此外， 在反应过程中荧光参数的变化速度在包含更高初始量的靶的样品中比 在包含更低初始量的靶的样品中更快(即，增加的荧光曲线的斜率)。本 领域中已知的这些或其它测量值可产生为靶存在的指标或产生为靶扩 增的指标。靶的初始量通常通过将实验结果与已知量的靶的结果相比较 来测定。

可在溶液中或固相上进行根据本发明方法的测定(用于检测选择的 靶序列的存在)。通常在溶液中进行其中检测子寡核苷酸用作引物的实 时或终点均相测定。使用本发明的检测子寡核苷酸的杂交测定也可在溶 液中进行(例如，如均相实时测定)，但也特别适合用于实时或终点检测 靶的固相测定。在固相测定中，可使用本领域已知的方法通过内部或末 端标记物将检测子寡核苷酸固定在固相(例如，珠粒、膜或反应容器)上。 例如，可将生物素标记的检测子寡核苷酸固定在抗生物素蛋白修饰的固 相上，其中当在适当的杂交条件下暴露于靶时，其将产生荧光的变化。 以该方式捕获靶有助于将靶与样品分离并且允许除去样品中可干扰信 号的检测或测定的其它方面的物质。

为了商业便利，可以以试剂盒的形式包装用于特异性检测和鉴定 HPV核酸的寡核苷酸。通常，此类试剂盒包括至少一种本文中描述的寡 核苷酸。还可将用于进行核酸扩增反应的试剂与HPV特异性寡核苷酸包 括在一起。例如，可包括缓冲剂、其它寡核苷酸、核苷酸三磷酸、酶等。 可将试剂盒的组分一起包装在共同的容器中。任选地，可包括举例说明 用于进行本发明方法的特定实施方案的一个描述的实施方案的说明书。 还可在试剂盒中包括其它任选的组分，例如用标记物标记的适合用作测 定探针的寡核苷酸和/或用于检测所述标记物的试剂或工具。

此外，试剂盒可包括以干燥或液体形式存在的寡核苷酸和试剂。试 剂盒的组分，当以干燥形式存在时，可以是更稳定的和易于操作的。可 将试剂盒的干燥组分添加或预处理至固相例如微量滴定板、微阵列或其 它适当的容器，其中仅需添加样品和缓冲剂。该形式有利于同时测定多 个样品并且可用于高通量方法。可使用BD ProbeTec^TM和Viper^TM XTR 仪器。

下列实施例举例说明本文中描述的本发明的具体实施方案。如对于 本领域技术人员来说是显然的，各种变化和变动是可能的，并且预期在 所描述的本发明的范围内。

在下文中使用表1中的引物/探针组作为实例，进一步描述了用于 检测HPV的Taq-Man PCR系统。上文表1中描述的引物/探针的引物组 经设计用于对HPV 39型和68型和51型进行Taq-Man PCR。具体而言， 在其中第一简并引物/探针组用于HPV 39和68型的第一实施方案中， 偏向于HPV 39型的引物/探针组为SEQ ID NOS:1、3和5。偏向于HPV 68型的引物/探针组为SEQ ID NO.2、4和6。

Taq-Man实时PCR是一种定量PCR。Taq-Man使用荧光探针，其为 20-26个核苷酸的单链寡核苷酸并且经设计用于仅结合两个PCR引物之 间的DNA序列。在Taq-Man中，将报告分子染料和猝灭剂染料连接至探 针。通过改变温度以使DNA变性和再退火来使探针对DNA退火。Taq聚 合酶将核苷酸添加至靶DNA并且所述聚合酶从模板DNA除去Taq-Man探 针。当报告分子染料与猝灭剂染料分离时，报告分子染料发射可检测的 能量。利用计算机定量能量，其提供指示靶被检测到的信号。在Taq-Man PCR中，仅特定的PCR产物可产生荧光信号。

在本文的实施例中，涉及热循环。在于95℃下进行15分钟的初始 变性步骤后，将用于检测靶的存在或不存在的引物/探针组与样品的PCR 混合物经历40个如下的热循环：在55℃下进行1分钟，然后在95℃下 进行30秒。

为了实施Taq-Man PCR，使用具有50-150个碱基对的优选产物大小 的两个PCR引物和具有共价地连接于其5'和3'末端的荧光报告分子或 荧光团(例如6-羧基荧光素(FAM)和四氯荧光素(TET))和猝灭剂例如四 甲基罗丹明(TAMRA)或暗猝灭剂(例如先前描述的)的探针。适当的荧光 报告分子和荧光团是公知的并且未在本文中进行详细描述。

表5:用于HPV 39、68和51型的Taq-Man测定的Taq-Man PCR探 针组的实例

探针经设计用于对表中指出的HPV E6/E7基因中的ORF位置退火。 在这一点上，对于HPV 59，针对E6和E7基因的引物探针/组的ORF位 置列于下表中。

表6:E6/E7上针对HPV 59型的引物/探针组的ORF位置

除了引物和探针外，Taq-Man PCR需要用于常规PCR的试剂(例如聚 合酶、游离核苷酸)以及用于分析数据的实时PCR机器。试剂和设备对 于本领域技术人员来说是公知的并且未在本文中进行详细的描述。

虽然已在本文中参照具体定实施方案描述了本发明，但应理解，这 些实施方案仅仅是对本文中描述的发明的原理和应用的示例。因此应理 解，可对示例性实施方案进行许多变动并且可设计其它配置，而不背离 如所附权利要求界定的本文中描述的发明的精神和范围。