从去分化的、非诱发的刺阿甘树细胞的体外培养物产生的制剂、其用于治疗皮肤老化、炎症和疤痕的用途及其生产

摘要

本发明涉及从去分化的、非诱发的刺阿甘树细胞的体外培养物产生的制剂，以及其用于治疗皮肤老化、炎症和瘢痕的用途。

说明书

技术领域

本发明的目的在于源自去分化、非诱发的阿甘树细胞体外培养物 的制剂、含有所述制剂的化妆品或皮肤病学组合物、及其用于治疗皮 肤老化、炎症和愈合的用途。

背景技术

阿甘树是一种属于植物山榄科的树，其学名为刺阿甘树（Argania  spinosa(L.)Scelles）。

它的习性与橄榄树相似；其具有短且扭曲的树干。木材非常坚硬 致密。枝非常多刺，且它们有小的、披针形的、互生的、短（约2厘 米长）且窄的叶，叶往往汇集成簇。叶是常绿的，但遇严重干旱时， 叶死亡并脱落。花是雌雄同株的且为五聚体。它们集中在团伞花序中， 并在五月和六月开花。它们是黄绿色的。

阿甘树从5龄开始能结出果实。果实为黄色，椭圆形无柄浆果， 约4-5厘米长。它由围绕着坚果的浆组成，坚果含有2至3个粘在一 起的扁平种子，各种子包裹着富含油的仁。

阿甘树是摩洛哥特有的并主要位于索维拉和阿加迪尔之间的摩洛 哥西南部。阿甘树林覆盖约830000ha。

由于阿甘树特别坚硬的木质，摩洛哥人们最先将其用作燃料供应。 其它主要传统用途是手工初步提取的油，但现在使用压榨来提取。这 种油的首要用途是作为食物；另一个重要的应用目前是用于化妆品。 源自油的生产的浆和残余的粕通常用于动物饲料。

许多美容产品是从阿甘树开发的。已经有若干针对源自种子的油 的发明专利，例如通过溶剂获得的油（专利Fr 2 553 788）、富含非皂 化物的阿甘树油（专利Fr 2 724 663）。

除油以外的物质也授予了专利，例如源自油提取之后获得的种子 粕的肽；来自油和粕的肽的组合物用于治疗皮肤老化有关的问题（专 利Fr 2 756 183）。也有来自阿甘树的叶、粕的蛋白质和皂甙的发明专 利=来自叶的提取物（专利EP 1 213 025）、粕蛋白质（专利EP 1 213 024）、粕皂甙（专利EP 1 430 900）。最近，专利申请EP 1 968 536 经保藏公开了来自阿甘树果实的浆的提取物在抗老化化妆品中的用 途。

因此，整个阿甘树的组合物对于皮肤病学和/或美容用途是令人感 兴趣的。

阿甘树是一种重要的资源植物，因为首先生态学上地，它是一个 “生态系统”植物。它完全适应干旱地区，它保护土壤免于水蚀和风 蚀，从而防止沙漠逼近摩洛哥内。而且还因为在经济上，它是一种具 有多种用途的树。

它是摩洛哥的主导作物。因此，阿甘树林受1925年颁布的诏令 （dahir）（法令）的保护，写道国家对于阿甘树林享有最高权利，但 当地群众享有用益权（阿甘树下的果实、枯木、作物）。UNESCO最 近将阿甘树林列为生物圈储备。

这就是为什么其木材或叶用于化妆品用途的利用可对此受保护的 植物产生严重的后果。

从植物获得兴趣分子的另一种手段是制备全能去分化的细胞培养 物。使用去分化的植物细胞还可以避免一些化妆品产品开发过程中遇 到的工业化问题。采用细胞培养物，不存在不同植物批次或收割之间 兴趣物质浓度上的差异。它也是一种非破坏性的技术，相对容易且价 格低廉地建立。最后，由于细胞在培养基中且活性化合物在培养基中 或在细胞内液体中，这排除了对提取的需求。因此简单的研磨就可以 获得这些化合物。

专利申请WO03077881公开了用于局部应用的含有至少一种体外 培养物中去分化的且诱发的植物细胞匀浆物来合成至少一种植物抗毒 素的组合物。植物材料优选来自藤。

发明内容

因此，本文件公开了可以去分化并诱发的植物细胞的化妆品应用， 诱发产生足够量的次级代谢物使得能够具有局部用途中的生物活性。

令人惊奇和意外的是，申请人已证明源自去分化但非诱发的阿甘 树细胞的体外培养物在抗老化、炎症和愈合领域具有良好的化妆品和/ 或皮肤病学活性。

得到的结果表明，在阿甘树的特定情况下，阿甘树细胞培养物的 另一种应用（在这种情况下非诱发细胞）可能在上面提到的内容范围 内。

此外，按照本发明所公开的而获得制剂可以消除对诱发步骤的需 求，诱发步骤在工业上是困难且昂贵的步骤；由于细胞生长缓慢，诱 发导致更低的生物质产量。

申请WO03077881提到了进行这种诱发的各种方式，例如UV辐 射3天；二氧化碳持续24小时至2天；UV辐射和二氧化碳5天。

在本发明的框架内进行的方法，由来自源自阿甘树的植物材料的 细胞去分化然后在悬液中细胞培养组成，其可以快速地产生精细的、 丰富的、均匀的和无菌的这种植物的生物质。细胞培养使得有可能将 这种植物的生物合成途径直接应用到细胞规模。

因此，本发明目的在于源自去分化的非诱发阿甘树细胞体外培养 物的制剂、包括所述制剂的化妆品或皮肤病学组合物及其在美容和/或 皮肤病学中的用途，优选用于治疗皮肤老化、炎症和愈合。

更通常地，植物组织在悬液中的体外培养物提供一种生产直接源 自一级或次级细胞代谢的活性有机化合物的手段。

植物细胞在悬液中处于去分化状态，与用于动物细胞培养物的干 细胞的状态相似。因此，这些植物细胞理论上能够产生整个植物中观 察到的所有代谢物。去分化导致生物合成途径的遗传或表观遗传干扰， 从而整个植物和获得的细胞株之间的化学谱是定性和定量上的差异。 因此，理论上，在整个植物中没有观察到的反应中间体可能会出现在 细胞悬液中。这提供了一个新的机会，从而可以获得“休眠的”化学 生物多样性。

在本领域的当前状态中，通常细胞培养物的诱发（化学、物理、 生物的）可以刺激并产生更多的次级代谢物。在根据本发明的我们的 方法中，我们将显示，不像大多数情况，令人惊讶的是，诱发不是必 要的，而是不利于生物质的生长和所需的生物活性。

本发明的目的之一涉及源自去分化的非诱发的阿甘树细胞的体外 培养物的制剂。

“去分化的植物细胞”是指没有任何特定的特化性质的任何植物 细胞，换言之，在与自然状态下植物分生组织相似的生理状态中。这 些细胞能够自己生存而不依赖于其它细胞。

去分化的刺阿甘树（Argania spinosa）细胞获自从树或幼芽摘取的 活植物材料，其由叶、叶柄、茎、树皮、根、果实、种子、花和花器 官或花蕾组成，尤其来自叶。

用于获得去分化的细胞培养物的方法，是通过本领域技术人员已 知的任何方法获得的，例如参阅Murashige,T.,Skoog,F.1962.A revised  medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol.Plant 15:473-496。/Plant Culture Media,Vol-1Formulations and  Uses E.F.George,D.J.M.Puttock，和H.J.George(1987)Exegetics Ltd. Edington，Westbury，Wilts，BA134QG英国。

根据本发明的制剂可通过按顺序进行以下步骤获得：

a）植物材料的灭菌，

b）细胞的去分化，

c）置于有培养基而没有诱导子的细胞悬液中，

d）用没有诱导子的培养基进行的生物质增殖和生产培养物，以及

获得制剂。

如果目的是生产少量的生物质，制剂可在锥形烧瓶中制备，或者 用于更大的量，制剂可在生物反应器中制备。例如，收集于带有500ml 细胞悬液的锥形瓶的平均量是100g干燥的生物质（即200g生物质/每 L细胞悬液），而收集于10L生物反应器的平均干燥的物质是3000克 （300g/L生物质）。

生物反应器中植物细胞培养遇到的三种主要模式：

1.不连续的或分批培养，

2.补给/收集或流加培养，以及

3.连续培养。

a.植物材料灭菌步骤：

采取刺阿甘树（Argania spinosa）外植体，且更特别地叶的外植体， 用钠或钙的次氯酸盐溶液或者氯化汞溶液在环境温度下除污几分钟。 用无菌蒸馏水漂洗组织，然后在除污的最后用无菌蒸馏水洗涤至少一 次。

b.细胞去分化的步骤

除污后的外植体放置在层流罩下接触Murashige＆Skoog琼脂营养 培养基，已向其中添加有蔗糖和生长因子（或激素）。这些生长激素将 控制外植体的细胞机制从而引起细胞分裂以及引起细胞簇或去分化的 愈伤组织（愈伤组织再生）。每3-4周将得到的愈伤组织转移到新的去 分化营养培养基中。这种培养基的一些富含琼脂的成分可被愈伤组织 代谢或由空气的作用降解。

在一般情况下，基于植物生长素（2-4二氯-苯氧基乙酸）和细胞 分裂素（激动素）的激素组合物被成功地测试以获得快速和充分的松 散型愈伤组织（愈伤组织再生）形式的组织去分化，以及有助于转移 到液体培养基中。无菌叶外植体可以保存在近轴面，接触由Murashige 和Skoog培养基组成的琼脂培养基（Murashige,T.,Skoog,F.1962.A  revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue  cultures.Physiol.Plant 15:473-496），其具有30g/L的蔗糖、8g/L琼脂、 0.5mg/L激动素和0.75mg/L 2-4二氯-苯氧基乙酸（24D）添加剂，并 在121℃（1bar）20分钟的高压灭菌之前调节至pH6。含有外植体的 平皿置于28℃下在黑暗中孵育。2周后出现第一个愈伤组织。每3-4 周，通过用解剖刀划分愈伤组织以保持在2至3cm的尺寸，将得到的 愈伤组织转移到新的培养基。这些转移物保持2至6个月直到获得松 散型愈伤组织。

c.在没有诱导子的培养基中产生细胞悬液的步骤

用于将愈伤组织连续转移到琼脂培养基上的细胞去分化导致松散 型愈伤组织的形成。这种细胞间的粘附力下降是去分化的后果，去分 化取决于植物可在两至六个月之间发生。这种状态有利于转移至液体 培养基中，因为它保证愈伤组织在细胞悬液中的分散，同时最大限度 地减少诱导的机械应力。因此，松散型愈伤组织的集（按体积10-20％） 引入到使用没有胶凝剂的与琼脂去分化培养基相同的制剂制备而成的 液体营养培养基中。

因此，松散型愈伤组织在液体培养基中通过2至3天的振动台作 用被分散，得到的细胞悬液完全没有未分散的愈伤组织部分，从而形 成均匀的细胞悬液。这种悬液保持培养以获得足够致密的细胞群。在 此阶段，悬液经过（亚培养）或稀释于新的营养培养基中，并以同样 的方式开始培养。

通过在含有200ml培养基的500ml锥形瓶中保藏20至40g松散 型愈伤组织开始初始的细胞悬液。因此，松散型愈伤组织在液体培养 基中通过2至3天在黑暗中在29℃下，在115rpm下的振动台作用被 分散。然后使用移液器收集细胞漂浮物，留下未分散的残留愈伤组织 簇。细胞漂浮物从而形成均匀的细胞悬液。这种悬液保持培养以获得 “足够”致密的细胞群。得到的细胞悬液培养15天，然后通过在新的培 养基中稀释至1:5，持续相同的时间进行增殖。已作出对培养基组合物 （营养、生长因子等）的调整，从而最大限度地提高生物质产率。其 结果是针对液体细胞悬液而优化的ARGMS生物质增殖培养基（见表 1）。这种培养基是Murashige&Skoog培养基针对愈伤组织再生的改良 版本。通过加入KOH将这种培养基调整至pH 6，随后是在121℃下（p =1bar）高压灭菌20分钟或者以0.2μm过滤灭菌。

表1：ARGMS培养基是用于在锥形瓶中或生物反应器中于最佳条 件下在悬液中培养阿甘树细胞的Murashige & Skoog（ARGMS）培养 基的改良版本

d.用没有诱导子的培养基进行的生物质增殖和生产培养物

采取若干这样的亚培养之后，当获得的细胞密度在一段时期内恒 定时，细胞悬液是稳定的。然后为了最大限度地提高生物质产率，对 培养基组合物（营养、生长因子等）的调整是可能的。在本发明的一 个特定的实施方式中，用作生物质生产装置的优化培养基是表1中所 述的培养基。

细胞悬液经过滤使其从细胞外的培养基或培养漂浮物中分离出 来，所收集的生物质放回蒸馏水中的悬液中，在0℃下研磨。获得的匀 浆进行冷冻干燥或者在冷冻干燥之前为了使其澄清进行离心。

在“最佳”条件下如此产生的细胞培养物是稳定的，且保持在锥形 瓶（增殖培养）中，每15天按1:5稀释细胞悬液。这相当于接种约60g/L 鲜生物质的细胞培养物，15天的培养后其产生约300g/L细胞悬液，或 根据需要接种在生物反应器中。

在锥形瓶或在生物反应器中获得的制剂可由如下组成：

-细胞悬液（出于本发明的目的，“细胞悬液”是指在其培养基中的 细胞（即生物质））；

-生物质（出于本发明的目的，“生物质”是指从培养基中分离的细 胞簇，即经过滤之后的细胞悬液）；

-放回（或不放回）蒸馏水中的悬浮中的研磨生物质；

-通过离心或过滤的研磨生物质的澄清液或漂浮物；

-培养漂浮物（出于本发明的目的“培养漂浮物”是指，在其中所保 持的细胞在培养期间所居留的培养基，或细胞外的培养基）。

无论关注的是否是研磨生物质的细胞悬液、生物质或漂浮物，它 们可以冷冻形式或通过加入保存物质保持不变，保存物质比如苯氧基 -2-乙醇、苄基醇或在关于化妆品产品的EU指令附录VI中题为“化妆 品中可存在的保存剂列表”中出现的任何其它保存产品。它们也可以在 化妆品可接受的介质上按照从10％到60％不等的比例进行稀释，比如 二醇（丙二醇、丁二醇、聚乙二醇等）。细胞悬液或生物质也可经研磨， 然后作为这样冷冻的或通过加入保存物质或如上所述的介质而保存。

研磨与否，细胞悬液、生物质或生物质漂浮物也可通过冷冻干燥 或雾化进行干燥，并就这样保持或干燥于麦芽糖糊精、乳糖或二氧化 硅型介基或任何其它化妆品可接受的介质上。

最后，可通过亲和层析采用有用的化合物富集细胞悬液：吸收于 树脂上（型聚苯乙烯共聚物等）并用合适的溶剂 如乙醇洗脱。

按照本发明的方法获得的鲜生物质代表约100至500g每升的悬 液，并且更优选于最佳收集时间（即平均约15天）在200和350g每 升悬液之间。

下表表示得到的产量（产量表示为获得的产物克/细胞悬液L）：

本发明还涉及包括，如上所述的，源自非诱发去分化阿甘树细胞 培养物的制剂作为活性成分的化妆品或皮肤病学组合物。

优选地，所述制剂的量是组合物总量的0.1和10％之间。甚至更 优选地，所述提取物的量是0.2％和5％之间。

根据本发明的化妆品组合物可有利地为通常用于局部或口服应 用，优选局部应用的化妆品中的任何盖仑形式。对于通过局部途径的 施用，盖仑形式可以是霜剂、凝胶剂、软膏或喷雾剂。口服配方选自 用于可饮用的悬液的片剂、胶囊剂和粉剂。

根据本发明的化妆品组合物还包括通常美容上兼容的赋形剂。

通常和化妆品组合物兼容的赋形剂可以是本领域技术人员已知的 任何赋形剂，从而获得如上述那些形式的用于局部应用的化妆品组合 物。

根据本发明的化妆品和/或皮肤病学组合物可尤其含有添加剂和制 剂助剂（aid），如乳化剂、清洁剂、发泡型表面活性剂等，配位剂、增 稠剂、胶凝剂、稳定剂、包括抗微生物剂和抗氧化剂的保存剂、调节 剂、酸化剂、碱化剂、软化剂、溶剂、着色剂和芳香剂。

本发明人还表明源自去分化非诱发阿甘树细胞的制剂可具有如下 活性：

-抗氧化、抗自由基活性以限制与内在和外在老化有关的氧化过程 以及炎症过程。

-通过抑制金属蛋白酶降解胶原蛋白，对细胞外基质的活性改善成 熟皮肤的机械性能（坚实度、弹性、紧张性）。

最后，本发明涉及此处公开的用于治疗皮肤老化、炎症和愈合的 组合物。

具体实施方式

如下实施例作为非限制性的实例给出。

用于制造根据本发明的制剂的实施例。

实施例1：鲜的生物质/锥形瓶中制备的方法

优选3至4个月龄的阿甘树叶通过按顺序的若干次沐浴进行灭菌： 70％乙醇1分钟，2％次氯酸钠3分钟，然后用两个连续的软化水浴持 续8分钟和10分钟进行漂洗。

无菌的叶外植体在保存在近轴面，接触由Murashige和Skoog培养 基组成的琼脂培养基（Murashige,T.,Skoog,F.1962.A revised medium  for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant 15:473-496），其具有30g/L的蔗糖、8g/L琼脂、补充有0.5mg/L激动 素和0.75mg/L 2-4二氯-苯氧基乙酸（2.4-D），并在121℃高压灭菌（1 bar）20分钟之前调节至pH 6。含有外植体的平皿留在28℃下在黑暗 中孵育，并增殖直到获得松散型且稳定的愈伤组织。

通过在含有200ml高压灭菌的培养基的500ml锥形瓶中保藏约40 g松散型愈伤组织产生初始的细胞悬液，其组合物描述于上述表1中。

将培养物留在振动台上于115RPM下在黑暗中于29℃下持续1 周。然后使用移液器收集细胞漂浮物，留下残留的愈伤组织簇。得到 的细胞悬液培养15天，然后通过在新的培养基中按1:5稀释，持续相 同的时间进行增殖。

然后在真空下过滤悬液，回收生物质。获得的鲜生物质产量是 168g/L。

生物质被保持在-20℃。

实施例2：干生物质

实施例2a：干生物质/按分批培养在生物反应器中进行的过程

按实施例1所述获得的四个500ml细胞悬液锥形瓶在接种装置中 放在一起并形成一个2L的接种物，其无菌地倒入一个10L生物反应器 中。此生物反应器装有8L最佳培养基（见表1）,补充有30mg/L预先 灭菌的消泡剂，然后冷却，并通过生物反应器壳体中封闭回路中恒温 控制的水循环保持在29.5℃。

通过饱和校准氧探头，并实时将数据输入计算机化的pO2调节装 置。这种装置通过向通气系统注射无菌纯氧将pO2保持在80％。此生 物反应器还在流出气体（头部空间）处配备了CO2在线测量装置，其 同时将数据输入到计算机化的pCO2调节装置，将pCO2保持在6％。 这是通过将无菌的混合有氧气的环境空气注入通气装置进行的。生物 反应器还配备了转速为75RPM的桨型搅拌系统，来搅拌细胞悬液并防 止它沉降。自动装置被安装在生物反应器的输出端以使得能够进行生 物质的无菌采样和监测。

在这些恒定温度和溶解气体的条件下将分批培养保持15至17天， 直到达到280至320g/L的鲜生物质的细胞密度。完成分批培养后，清 空生物反应器，通过用布氏漏斗在过滤器上过滤收集生物质。

使用“超声清洗机”冷研磨溶解于相同蒸馏水体积中的收集的鲜生 物质，然后冷冻干燥。

实施例2b：干生物质/按流加培养10.0.0.1在生物反应器中进行的 过程

按实施例2a所述将四个500ml细胞悬液锥形瓶用作接种物。按实 施例2a中所示的，准备生物反应器。按实施例2a中所示的，准备溶 解的气体、温度和搅拌调节系统。

在这些恒定温度和溶解气体的条件下将初始培养保持15至17天， 直到到达280至320g/L的鲜生物质的细胞密度。初始培养完成后，取 出10L生物反应器中80％的内容物。然后收集8L细胞悬液。通过用 布氏漏斗在过滤器上过滤收集此悬液中的生物质。收集到2240g到 2560g鲜生物质。当冷却时，使用超声清洗机研磨溶解于相同蒸馏水体 积中的收集的鲜生物质，然后冷冻干燥。得到100至130g冷冻干燥的 生物质。

在80％的部分收集进行的同时，8L预先高压灭菌并冷却的 ARGMS培养基倒入生物反应器，然后含有2L的细胞悬液，从而恢复 到10L的培养体积。在这些恒定温度和溶解气体的条件下将流加培养 保持5至7天，直到达到280至320g/L的鲜生物质的细胞密度。这种 培养比初始培养更快（更高的产率），因为生物质是在持续的生理细胞 分裂状态，从而倒入新的营养培养基的特征在于少于24小时的潜伏期 并且生物质立即扩增。在这种流加培养结束时，10L生物反应器的80 ％被除去。然后收集8L的细胞悬液。通过用布氏漏斗在过滤器上过滤 收集这种悬液的生物质。然后和之前一样重新开始培养。

实施例2c：干生物质/按连续培养在生物反应器中进行的过程

按实施例2a所述将四个500ml细胞悬液锥形瓶用作接种物。按实 施例2a中所示的，准备生物反应器。按实施例2a中所示的，准备溶 解的气体、温度和搅拌调节系统。

在这些恒定温度和溶解气体的条件下将初始培养保持10天，直到 到达150g/L的细胞密度和0.2d^-1的瞬时鲜生物质生长率。在此阶段， 每隔1小时20分钟，将10L生物反应器中1.2％的内容物去除。通过 向生物反应器中倒入相同体积的新ARGMS培养基，这些样品自动进 行补偿。这种方法将细胞保持在一个恒定的生理状态和细胞密度。

然后收集100到120ml的细胞悬液。通过用布氏漏斗在过滤器上 过滤收集此悬液中的生物质。每个样本收集15g至18g的鲜生物质。 使用超声清洗机冷研磨溶解于相同蒸馏水体积中的收集的鲜生物质， 然后冷冻干燥。获得的结果是，对于每次提取0.71到0.85g冻结干燥 的生物质。因此，维持至少60天培养。没有时间限制的使其维持这在 理论上是可能的。

连续培养较之前模式的优点是，不需要再次准备生物反应器，其 需要清洁和灭菌，并且没有细胞潜伏期。自动提取出1至1.5％的细胞 悬液，随后通过用新的培养基补充到生物反应器中，引起生物反应器 中进展当中的培养基组合物最小程度的变化。因此，细胞群对潜伏期 不做任何代谢调整，而这导致在其它培养模式中观察到的生物质体积 产率上的损失。

实施例3：鲜生物质漂浮物，所述生物质如实施例2a中描述获得

如实施例2a中描述得到的20g鲜研磨生物质在10000g离心15分 钟，收集漂浮物。然后冷冻干燥。

平均产量是每克鲜生物质30mg冻干干燥的漂浮物。

化妆品组合物的实施例：

实施例4：H/E配方

 成分   %  鲜生物质(实施例1)   5

  甘氨酸  10.0   Na2EDTA  0.1   黄原胶  0.3   C12-C15烷基苯甲酸酯  10.0   棕榈酸辛酯  5.0   保存剂  qs   硬脂酸醇  2.5   单硬脂酸甘油酯  2.5   十六烷基磷酸钾  1.8   软化水  QSP 100

实施例5：E/H配方

  成分  %   漂浮物（实施例3）  0.5   甘氨酸  4.0   Na2EDTA  0.1   MgSO₄ 1.0   黄原胶  0.1   C12-C15烷基苯甲酸酯  12.5   异十六烷  3.5   环甲硅脂  3.0   保存剂  qs   聚甘油和山梨醇酯  4.0   肉豆蔻-3肉豆蔻酸酯  2.0   软化水  QSP 100

实施例6：抗氧化活性的评价

化学发光

这种方法通过光化学信号生成自由基（超氧自由基O₂°-）。氧化的 强度高于正常条件下获得的1000倍。通过化学发光进行检测并用于评 价脂溶或水溶性抗氧化剂的提取物或分子。结果表示为等量的维生素C 或Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸）。灵敏度是1纳摩尔数 量级。

结果的分析依赖于两个标准，即曲线的形状（积分）以及由软件 以纳摩尔给出的数值。（Igor Popov和Gudrun Lewin.Methods in  enzymology[44]vol 300.437-456；Maibach I Howard和coll.Journal of  Cosmetic Dermatology Vol 7(2)96-100(2008)）。

结果将被表示为，获得相当于1μg标准（trolox（无对应译文）） 检测到的活性的活性所必要的样品的μg（ACL试剂盒）。

结果：

通过化学发光，本测试中研究的抗氧化活性代表特异性捕获超氧 阴离子的能力。

表2：以trolox当量表示的抗氧化能力的评价与定量

根据实施例2a制备的冷冻干燥的生物质以及根据实施例3制备的 研磨冷冻干燥生物质的漂浮物具有整体上来看等价的抗自由基捕获活 性。

278μg冷冻干燥的生物质对于得到相当于1μg trolox检测到的活性 的活性是必要的：相当于辅酶Q10（参考抗氧化分子）的活性。

171μg研磨冷冻干燥的生物质漂浮物对于得到相当于1μg trolox检 测到的活性的活性是必要的。

自由基，作为外部侵袭（冷、污染、烟草、UV）的结果其产生增 加，可以导致对皮肤细胞DNA、以及细胞和线粒体膜DNA的破坏。 这些自由基在炎症过程中也发挥非常重要的作用。正是这些活性代谢 物是细胞氧化应激信号的第二信使，因此是炎症的早期介质（A.Van  Der Vliet和coll,Chem Biol Interaction 85:95-116 1992）。

实施例2a和3中描述的制剂的抗自由基活性有助于抵抗内在和外 在皮肤老化和炎症。

实施例7：金属蛋白酶活性对胶原蛋白形成细胞外基质的抑制的评 价

细胞外基质（MEC）是对组织具有结构和调节作用的动态结构。 其赋予皮肤紧张（turgescence）和机械性质。在表皮，其占据了细胞间 隙，并为表皮结构提供支持。它也控制表皮细胞间的交流并在细胞活 性中发挥作用。它是由纤维，特别是胶原蛋白和基本物质（水、盐、 糖蛋白、葡糖胺聚糖）组成。胶原蛋白是纤维状蛋白质，由三个可以 是相同的或不同的多肽链通过共价键氢键连接形成。胶原蛋白形成纤 维网状结构的主要成分，并为皮肤提供抗性和弹性发挥机械作用。

当细胞衰老时，MEC的大部分成分被称为基质金属蛋白酶（MMP） 的富锌内肽酶型酶所降解（Hideaki Nagase§和J.Frederick Woessner.J  Biol Chem,Vol.274,Issue 31,21491-21494,July 30,1999）。它们是膜 型的或分泌型的。所有MMP有很强的序列和结构上的同源性，但对底 物的特异性不同。MMP1或“间质胶原酶”主要降解I型胶原蛋白（正常 皮肤真皮中80％的内容）并且也降解II VII VIII和X型胶原蛋白。

在人重组酶的模型上使用特异性的肽底物Mca–Lys-Pro-Leu-Gly- Leu-DPA-Ala-Arg-NH2，我们通过荧光定量分析了提取物对直接酶活性 的作用（David Leppertd和coll,Analytical Biochemistry 328(2004) 166–17）。

用不同制剂预孵育激活的酶，然后置于存在的底物中。酶切割肽， 将Mca荧光团（7甲氧基香豆素-4-基）乙酰基）从猝灭剂Dpa（N-3- （2,4-二硝基苯基）-L-2,3二氨基丙酰）分开。然后，当在320nm激 发下，肽发出具有405nm波长的荧光。因此，测量MMP-1的酶活性， 其正比于所发出的荧光。

在tubo测试中使用其，我们能够检测潜在的MMP1活性抑制剂， 一种在起始胶原蛋白降解中具有至关重要作用的酶。我们测量MMP1 活性抑制的百分比。

与抑制剂或产物有关的酶抑制百分比的计算：

%抑制=100×(最大净酶活性抑制剂存在时净酶活性)/最大净酶活 性

结果：

根据实施例3制备的漂浮物显著抑制MMP1活性，并依赖从60 至500μg/ml的剂量。

表3：冷冻干燥研磨生物质的漂浮物（根据实施例3制备的），以 百分比（%）表示的MMP1抑制的结果

  平均抑制%   以μg/ml计的浓度   100   500   58   300   41   150   20   60

测试根据实施例2a制备的从60至1000μg/ml的冷冻干燥生物质。 由于生物质的物理化学干扰作为一个整体，我们无法测量抑制活性。 然而，测试了一个非常相似的提取物，并从60μg/ml至1000μg/ml显示 显著的抑制。

当衰老发生时，根据实施例3制备的提取物可以抵抗MMP增加的 活性，以及可以有助于维持胶原蛋白的机械作用，从而为皮肤提供抗 性和弹性。

实施例8：测量TGF-β1在HaCaT角化细胞中的合成

TGF-β1（转化生长因子-β1）属于不同细胞类型分泌的TGF-β超家 族，在控制细胞生长和调节多种细胞反应和生物过程中发挥了重要作 用。在这个超家族中的细胞因子的主要活性是它们调节大多数细胞的 增殖，它们刺激成纤维细胞增殖和增加细胞外基质的形成（Lawrence, 1996）。TGF-β1尤其是通过诱导细胞骨架（肌动蛋白）的重组和促进 上皮细胞迁移（Boland等人，1996）还参与损伤修复、愈合过程（Cullen 等人，1997）。在皮肤组织最具代表性的细胞群是角化细胞群。它构 成可控制和影响皮肤细胞（即成纤维细胞）行为的生长因子的重要来 源（Ghahary等人，2001）。

设备和方法

非诱发生物质的生产：根据实施例2a

诱发生物质的制备

制备Murashige＆Skoog培养基，没有生长因子（激动素和24D）。 通过加入KOH调节这种培养基至pH 6，随后在121℃（p=1bar）20 分钟高压灭菌。然后使用源自增殖培养物的细胞悬液以1:5的体积接种 培养基。通过向激动素DMSO中无菌添加浓缩的6-苄氨基嘌呤（BAP 或（N-（苯甲基）-7H-嘌呤-6-胺）和诱导剂（乙酰基水杨酸和甲基茉 莉酮酸酯）溶液，随后立即产生诱发条件。其结果是EMS诱发培养基 （见表4）。诱发培养然后在振动台上在黑暗中于115RPM下于29℃ 持续15天。然后收集鲜生物质，在研磨并离心之前，在布氏漏斗上干 燥，通过冷冻干燥稳定漂浮物。

表4.EMS培养基，即用于在锥形瓶中阿甘树细胞于悬液中在诱发 条件下培养的Murashige&Skoog修饰的培养基

用不同提取物对HaCaT角化细胞处理5h，然后细胞接种于DMEM 在37℃下孵育24小时。用ELISA试剂盒将TGF-β1按计量加入到培养 物漂浮物中。

根据实施例2a制备的非诱发阿甘树生物质和诱发后得到的阿甘树 生物质对在人HaCaT角化细胞中TGF-β1合成的作用显示于附图1中。 它们表明在HaCaT角化细胞中，根据实施例2a制备的非诱发阿甘树生 物质（50μg/mL）刺激48％的TGF-β1合成，而诱发的阿甘树生物质抑 制26％的TGF-β1合成。

实施例9：人角化细胞增殖和细胞迁移的测量

实施例9.a：人角化细胞的细胞增殖的测量

损伤的愈合是一个复杂的动态的生物学过程，在正常的组织修复 中涉及许多局部和系统因子的相互作用。愈合进展包括四个相互依存 的阶段：止血、炎症、增殖和重塑。增殖意味着三个清晰可见的过程， 即颗粒化、收缩和上皮新生。

颗粒化过程中，观察到将会参与其余修复过程的细胞增殖，伴有 这些细胞向损伤床的迁移。这些细胞包括巨噬细胞、成纤维细胞和内 皮细胞。巨噬细胞不断释放趋化因子和生长因子。成纤维细胞构建损 伤基底处细胞生长所必需的新细胞基质。这种支架促进细胞迁移。

损伤的收缩是一种用于减少损伤大小的机制，成纤维细胞在这种 收缩中起着主导作用。

表皮再生由上皮新生组成，其覆盖损伤而形成对外部环境的有效 阻挡，能够被着色并恢复其感官和免疫功能。因此，这不仅意味着角 化细胞的细胞迁移和增殖过程，还意味着这种新生上皮细胞的分化以 及恢复重新连接真皮和表皮的基底膜。当基底细胞向损伤的中心迁移 时，使得损伤两侧能够结合起来，发生一波细胞有丝分裂以填补迁移 留下的空间以及在三维再生中为上皮组织提供细胞。

角化细胞、成纤维细胞和内皮细胞的增殖步骤可视为确认活性成 分的愈合活性的功能现象之一。成纤维细胞或内皮细胞的增殖增加将 参与真皮的愈合，同时角化细胞增殖的增加将参与上皮新生。

设备和方法：细胞增殖

所用的技术测量核苷酸，5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）（一种胸苷类 似物），在S期细胞的DNA中的掺加。

从手术后丢弃的皮肤中分离的角化细胞在完全KSFM中培养（BPE 25μg/ml；EGF 1.5mg/ml）。在待评价的分子存在时，在5％CO2氛围 中在37℃下孵育细胞48小时。

通过偶联至过氧化物酶的抗-BrdU抗体的系统进行评价与细胞增 殖率成正比的BrdU掺加。过氧化物酶底物的加入显示有色的反应 （Biotrak Elisa系统）。在450nm处测量相应的吸光度（OD（对应法 文缩写为DO））。因此，这种数据正比于细胞增殖率。

然后使用下面的公式确定增殖百分比：

%增殖=（OD(处理的)-OD(t对照_最小)）×100/（OD(t对照_最大)-OD(t对照_最小)）

注：

对照_最小=用最少的培养基孵育的细胞

对照_最大=用完全培养基孵育的细胞

因此，对照_最小对应着0％增殖，对照_最大对应着100％增殖。

关于细胞增殖的结果显示于图2中，表明根据实施例2a制备的阿 甘树生物质对人角化细胞增殖的作用。

它们显示，根据实施例2a制备的阿甘树生物质在0.1μg/ml时，刺 激25％的人角化细胞增殖。当在0.01μg/ml测试时没有测量到作用。

实施例9.b：人角化细胞细胞迁移的测量

设备和方法：HaCaT角化细胞的细胞迁移

用于研究细胞迁移的规程是基于96孔试剂盒的使用。本试验的原 则由研究细胞向孔中心（96孔板）的迁移组成。要做到这一点，各孔 的中心放置一个塞子，从而建立一个2mm直径的检测区域。然后围绕 着这个塞子接种HaCaT细胞。一旦细胞在围绕着塞子的表面结合良好， 就撤出塞子，细胞因此可迁移到检测区。没有塞子且具有活性成分的 板在DMEM 0％SVF中在37℃下孵育24小时。然后分析位于塞子所 在区域中的细胞数量，以评价细胞的迁移。用Hoechst 33342标记细胞， 并使用cache来观察和计数仅位于此区域的细胞。针对每个条件得到8 孔的平均值。

结果表示为

-荧光强度（IF-正比于已迁移的细胞的数量）

-相对于对照0％SVF的活性百分比：

（IF_处理的-IF_0%迁移的）×100/（IF_t对照0%SVF-IF_0%迁移的）

注：

IF（0％迁移的）对应着有塞子的孔的IF（荧光强度），因此对应 着背景噪声。

图3显示细胞迁移的结果，并说明根据实施例2a制备的阿甘树生 物质对HaCaT角化细胞迁移的作用。

它们显示，根据实施例2a制备的阿甘树生物质，在0.01或 0.03μg/ml时，分别刺激79％和73％的HaCaT角化细胞迁移。