一种通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置

摘要

一种通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置，其主要包括主壳体、驱动模块、控制模块、动力轴、转子、传动机构、离心管支架、离心管和研磨珠；固定在主壳体上的驱动模块在控制模块的支配下为整个破碎装置提供动力源，并通过动力轴将运动和转矩传递给转子，迫使转子高速旋转；传动机构的起始端通过高副与旋转的转子相连，并将转子的高速旋转运动转化成传动机构末端的高频往复直线运动；离心管支架固定于传动机构的末端并随传动机构的末端作高频往复直线运动；装有研磨珠和细胞悬浮液的离心管置于离心管支架中并固定，离心管随离心管支架一起作高频往复直线运动，进而导致研磨珠高频颤振，与细胞相互猛烈剪切、撞击，致使细胞破碎，释放出胞内活性物质。

说明书

技术领域

本发明属于生物样本制备技术领域，适用于基因工程和细胞工程中的细胞破碎，具体是 利用高频颤振研磨珠快速破碎细胞，以获取胞内活性物质，如DNA、RNA、酶、抗生素等。

背景技术

在基因工程和细胞工程技术领域，经常需要获取细胞内的DNA、RNA、酶等活性物质，即 样本制备。样本制备的首要步骤是将细胞外围结构(细胞壁和细胞膜)破碎，使欲提取的活 性物质从细胞内释放出来。由此可见，细胞破碎的程度和效率直接影响着样本制备的优劣， 甚至决定着样本制备的成败，其重要性不言而喻。

细胞破碎的传统方法主要有酶溶破碎法、化学试剂破碎法、超声空化破碎法和珠磨破碎 法等。

酶溶破碎法是先利用溶解细胞壁的酶处理细胞，细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击 等方法破坏细胞膜，以使细胞内的活性物质得以释放。酶溶破碎法的显著特点是专一性强， 即必须根据细胞的结构和化学组成来选择特定的酶，这意味着酶溶破碎法的通用性很差。而 且，溶酶的价格较高，在很大程度上增加了样本制备的成本。

化学试剂破碎法是利用某些化学试剂(如有机溶剂、表面活性剂、金属螯合剂等)，改变 细胞壁和细胞膜的通透性，从而使胞内一些小分子活性物质渗透出来。这种方法对细胞壁和 细胞膜的破坏程度不高，只能获取一些小分子酶蛋白和多肽，而DNA、RNA等大分子活性物质 仍滞留在细胞内。通过化学试剂破碎细胞不仅耗时长、效率低，而且化学试剂的加入会给后 续产物的分离、纯化带来困难，并影响最终产物的纯度。此外，有些化学试剂对人体有毒， 危害操作人员的身体健康。

超声空化破碎法是利用超声波处理细胞悬浮液，引发超声空化效应，悬浮液局部产生的 强烈冲击波和剪切力使细胞破碎，进而释放出活性物质。超声空化破碎法是一种强烈的破碎 方式，适用于多种类型细胞的破碎。但是这种方法的能量利用率极低，破碎过程中会产生大 量的热量，会导致部分敏感物质变性失活，因而其对冷却有相当苛刻的要求。另外，这种方 法需要超声波发生器、探头、液槽和控制系统，结构复杂，成本较高，一般只在实验室小规 模细胞破碎中使用。

珠磨破碎法是一种常用的细胞破碎方法，通过将研磨珠和细胞悬浮液一起快速搅拌，使 得研磨珠与细胞之间互相剪切、碰撞，进而将细胞破碎，释放出胞内活性物质。这是目前比 较成熟的技术，美国Next Advance公司的Bullet Blender就是一款基于珠磨破碎理论的细 胞破碎仪，它采用高速旋转的转头直接击打装有研磨珠和待破碎细胞悬浮液的离心管。在转 头击打的瞬间，离心管内的研磨珠将会剧烈的振动，与细胞相互剪切、撞击后，使细胞破碎， 释放出核酸、蛋白质、亚细胞结构等活性物质。该破碎仪虽然能方便快速地破碎大多数种类 的细胞，但是它仍有很多缺陷和不足：

首先，采用高速旋转的转头直接击打离心管，不仅会使离心管外壁受到严重的磨损，而 且离心管受到瞬时冲击时可能会发生破裂或折断。特别是在破碎一些具有坚硬外壁的微生物 (如革兰氏阳性菌、酵母菌、细菌芽孢等)时，转头在更高的速度下运转，这对离心管的瞬 间冲击更为剧烈，很有可能会造成离心管的破裂或折断。

其次，离心管内不同区域的研磨珠振动的剧烈程度不同，导致细胞破碎的程度不同。靠 近击打部位的研磨珠振动较为剧烈，因而该区域的细胞破碎程度较高；相比之下，由于液体 的缓冲减振作用，远离击打部位的研磨珠振动较弱，因为该区域的细胞破碎可能不充分。

再次，高速旋转的转头击打离心管的瞬间，击打部位会产生很多的热量，这部分热量通 过离心管传给细胞悬浮液，会使靠近击打区的液体温度升高，进而可能导致释放出来的亚细 胞结构、DNA、RNA和酶等变性失活。

最后，高速转头直接击打离心管，会产生相当刺耳的噪声。同时由于离心管是固定在破 碎仪机体上的，转头击打离心管时会带动破碎仪机体在工作平台上振动，机体运行很不平稳。 实际破碎细胞过程中，通常需要操作人员按压机体或采用其他机械结构将机体固定在工作平 台上。

综上所述，目前虽然已有很多细胞破碎方法，但其中大多数方法一般只能破碎动物细胞、 革兰氏阴性菌等一些较易破碎的细胞，通常不能破碎革兰氏阳性菌、酵母菌、细菌芽孢等， 应用范围相当局限。尽管珠磨破碎法能适应各种不同类型的细胞破碎，但是相应的设备仍有 很多缺陷和不足，破碎效果不很理想。因此，需要开发出能适应多种类型细胞(主要包括动 物细胞、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、细菌芽孢等)的通用型细胞快速破碎装置。

发明内容

为解决现有细胞破碎方法和设备的诸多缺陷，基于珠磨破碎理论，本发明提供一种结构 简单、操作方便、运行平稳、成本较低的通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置。

本发明的技术方案是提供一种通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置，主要包括主壳体、 驱动模块、控制模块、动力轴、转子、传动机构、离心管支架、离心管、研磨珠等。固定在 主壳体上的驱动模块在控制模块的支配下为整个装置提供动力源，并通过动力轴将运动和转 矩传递给转子，迫使转子高速旋转。传动机构的起始端通过高副与旋转的转子相连，并将转 子的高速旋转运动转化成传动机构末端的高频往复直线运动。离心管支架固定于传动机构的 末端，因而会随之作往复直线运动。将装有研磨珠和细胞悬浮液的离心管置于离心管支架中 并固定，离心管也会一起作高频往复直线运动，进而导致研磨珠高频颤振，与细胞相互猛烈 剪切、撞击，致使细胞破碎，释放出胞内活性物质。

所述主壳体是装置的外围结构，不仅能为内部装置提供隔离保护作用，而且还能支撑人 机交互面板。

所述驱动模块固定在壳体的底面上，为整个装置提供原始的能量、运动和驱动力。在优 选的技术方案中，所述驱动模块为一单向旋转的直流电机，其输出的运动和转矩集中在电机 输出轴上。

所述控制模块为装置系统的控制单元。在优选的技术方案中，所述驱动模块为单片机控 制器，可对直流电机的启动、暂停、急停以及电机转速和运转时间等参数进行控制。

所述动力轴为连接电机输出轴和转子的传动轴，它将电机输出轴的转动和转矩传递给转 子，用以驱动转子高速旋转。在优选的技术方案中，所述动力轴为一竖直放置的圆轴。圆轴 一端通过联轴器或离合器等与电机输出轴相联，另一端则固定在转子上。由于动力轴上承受 一定的压力和较大的扭矩，因此动力轴需要具有很高的强度、刚度和韧性，其材质优选优质 碳素结构钢调质处理或锰合金调质钢等。

所述转子绕某一竖直中心高速旋转，它直接驱动传动机构的起始端。在优选的技术方案 中，所述转子为一盘状的凸轮或偏心轮。转子驱动传动机构时，会承受较大的冲击、扭矩， 因此转子表层需要具有较高的硬度和较好的耐磨性，转子心部需要具有较高的强度和较好的 韧性，其材质优选具有中、高淬透性的合金渗碳钢，如20CrMnTi和20Cr2Ni4等。

所述传动机构是传递运动并改变运动形式的部分，具体是将转子的高速旋转运动转化成 传动机构末端的高频往复直线运动，这是本发明的创新所在。在优选的技术方案中，所述传 动机构为平面连杆机构，更进一步是平面四杆机构，由传动壳体、摇杆、压杆(也可称为拉 杆)和滑竿通过低副组成摇杆滑动机构。所述低副包括转动副和移动副，其中转动副是通过 铰链形成，移动副是通过平面配合或圆柱面配合来形成。壳体为整个传动机构提供固定约束 和支撑，压杆通过铰链将摇杆和滑竿联接起来。旋转凸轮的高速旋转，驱动摇杆单向摆动， 在压杆的推动下，带动滑竿沿直线单向移动，滑竿直线移动的方向通过固定在壳体上的导向 杆来控制。为了保证传动机构能连续工作，还需要在导向杆上设置一组复位弹簧，滑竿沿导 向杆直线移动时压缩弹簧，滑竿移动到最大行程处以后，受压弹簧将驱动整个传动机构复位， 这样就实现了滑竿的高频往复直线运动。

所述离心管支架用于支撑离心管，并能接收传动机构的运动形式。在优选的技术方案中， 将离心管支架固定于传动机构的末端，即滑竿上，这样离心管支架能够随滑竿一起作高频往 复直线运动。实际中，可将离心管支架与滑竿加工成一体，这能增强二者连接的牢固性。为 了将离心管固定于离心管支架中，离心管支架上需要配备压盖。另外，如果欲提取的胞内活 性物质对温度很敏感，可在离心管支架外围附加冷却夹套，这种局部冷却方式不仅效果好、 速度快，而且非常节能环保。

所述离心管是盛装研磨珠和待破碎细胞悬浮液的容器，为破碎细胞提供场所。离心管随 离心管支架作高频往复直线运动的同时，研磨珠在离心管内剧烈颤振，与细胞相互剪切、撞 击，致使细胞破碎，释放出胞内活性物质。在优选的技术方案中，所述离心管为带安全锁扣 的标准离心管，细胞悬浮液和研磨珠的总体积不超过离心管容积的3/4。

所述研磨珠为在离心管内剧烈颤振以破碎细胞的介质，其应具有较高的刚度、硬度和较 好的耐磨性。在优选的技术方案中，所述研磨珠为石英玻璃、陶瓷、氧化锆、不锈钢等制成 的球状珠体。实际破碎过程中，需要根据不同细胞类型选用直径不同的研磨珠，一般是0.1～1.5 mm为宜，优选0.25～0.5mm。

利用上述通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置可以对绝大多数细胞(如动物细胞、革兰 氏阴性菌、革兰氏阳性菌、细菌芽孢、酵母菌等)进行破碎以提取胞内活性物质，具体操作 步骤如下：

1)前期准备：如果原始样本是干态粉末或块状固体，应先用生理盐水(质量分数为0.4 ％的NaCl水溶液)将其制备成悬浮液，均匀混合后转入经消毒处理过的离心管中，然后根据 细胞的类型选择相应规格的研磨珠置入离心管中并压紧离心管的安全锁扣。

2)放样破碎：将装有细胞悬浮液和研磨珠的离心管置于破碎装置的离心管支架之中，并 用压盖固定离心管。然后，根据待破碎细胞的类型，设定电机转速和破碎时间。接着，启动 “开始”按钮进行破碎，破碎时间达到预设值后，电机自动停止，完成破碎过程。

3)后期处理：电机彻底停止转动后，稍等1～2分钟以使研磨珠自然沉淀。然后取出离心 管，用移液器吸取上清液(DNA、RNA、酶等释放出来的活性物质均包含在其中)，经纯化后获 取最终产物。沉淀在离心管底部的研磨珠可以经多次清洗后重复利用，也可以直接丢弃。

与现有同类装置相比，本发明提出的通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置，具有以下优 点和积极效果：

1)通用性好：现有细胞破碎装置一般只能处理少量的几种细胞，本发明提出的装置无论 是对动物细胞、革兰氏阴性菌等较易破碎的细胞，还是对革兰氏阳性菌、细菌芽孢、酵母菌 等较难破碎的细胞，都能很好的破碎，具有良好的通用性。

2)快速破碎：本发明提出的细胞快速破碎装置，离心管的高频往复直线运动迫使研磨珠 在离心管中剧烈颤振，因而能在较短时间内完成对细胞的破碎。

3)易于扩展：本发明提出的细胞快速破碎装置，其组件结构简单、布局紧凑，很容易扩 展成多通道的细胞快速破碎装置，如四通道、六通道、八通道和十二通道等，这样能极大地 增大该装置的处理通量。

4)运行平稳：本发明提出的细胞快速破碎装置，经扩展后，各通道沿电机输出轴成圆周 均匀分布状态，而且各通道都是沿径向作往复直线运动，因此各通道施加在壳体上的作用力 相互抵消，壳体能保持平稳状态。

5)不需清洗：本发明提出的细胞快速破碎装置，不直接接触处理样本(样本存于离心管 中)，因此在整个细胞破碎过程中，装置不会被样本污染，能保持清洁状态，不需清洗。

附图说明

图1是本发明一种具体实施例的立体结构示意图；

图2是图1中传动机构的运动简图；

图3是图1中各破碎通道的分布示意图；

图4是利用本发明优选的实施例对枯草杆菌黑色变种芽孢进行破碎后，提取纯化释放出 来的DNA，再进行PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图。

图中：1——直流电机，2——电机输出轴，3——动力轴，4——旋转凸轮，5——摇杆， 6——压杆，7——滑竿，8——导向杆，9——离心管支架，10——离心管，11——铰接支座， 12——复位弹簧，13——壳体。

具体实施方式

为进一步阐述本发明通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置的特点及功效，下面结合实施 例作更为详尽的说明。

一种四通道通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置实施例的整体结构如图1至图3所示， 该装置主要由直流电机1、电机输出轴2、动力轴3、旋转凸轮4、摇杆5、压杆6、滑竿7、 导向杆8、离心管支架9、离心管10、铰接支座11、复位弹簧12、壳体13以及控制模块和 人机交互面板(图中未示出)组成。在控制模块的支配下，直流电机1通过电机输出轴2将 运动形式和转矩传给动力轴3，借此驱动凸轮4高速旋转。摇杆5、压杆6、滑竿7和导向杆 8组成平面四杆机构，将凸轮4的高速旋转运动转化成滑竿7的高频往复直线运动。离心管 支架9固定于滑竿7上面，本实施例中是将二者加工为一体，因而离心管支架9也将作高频 往复直线运动。将装有研磨珠和待破碎细胞悬浮液的离心管10置于离心管支架9中，并用压 盖(图中未示出)固定，离心管支架9的高频往复直线运动将使研磨珠在离心管10中剧烈颤 振，与细胞相互剪切、撞击，致使细胞破碎，释放出胞内活性物质。

本实施例中，控制模块是采用STM32芯片组成的单片机系统，用于对直流电机1的转动 速度、转动时间进行控制，具体控制参数通过人机交互面板输入，人机交互面板上设有破碎 时间旋钮、电机转速旋钮以及“开始”、“暂停”和“急停”按钮。

本实施例中，动力轴3为一竖直放置的圆轴，直径为15mm，一端通过联轴器与电机输出 轴相联接，另一端固定于凸轮4的旋转中心，将电机输出轴2的运动和动力传递给凸轮4， 使凸轮4高速旋转。

本实施例中，凸轮4是一绕轴心旋转对称的盘状结构，最大径向尺寸为80mm，最小径向 尺寸为60mm，厚度为20mm，所用材料为合金渗碳钢20CrMnTi。

本实施例中，传动机构是由摇杆5、压杆6、滑竿7和导向杆8组成的平面四杆机构，用 于将凸轮4的高速旋转运动转化成滑竿7的高频往复直线运动。摇杆5一端通过铰接支座11 固定于壳体13上，另一端紧贴于凸轮4的外表面上，与之相切组成高副，凸轮4的高速旋转 将推动摇杆5高速单向摆动。压杆6通过铰接分别与摇杆5和滑竿7相连，组成转动副。滑 竿7通过内部开孔与导向杆8组成移动副，并通过复位弹簧12将二者相连，此处复位弹簧 12承受冲击载荷和循环载荷，需要较高的力学性能，因此本实施例中复位弹簧12所用材料 选择硅锰合金弹簧钢(60Si2Mn)。导向杆8固定于壳体13上，本实施例中是通过焊接将二者 固定，导向杆8所在直线通过凸轮4的旋转中心。摇杆5的高速单向摆动通过压杆6推动滑 竿7沿着导向杆8直线移动，同时压缩弹簧12储存能量。当滑竿7运动到最大行程处之后， 受压弹簧12将释放能量，推动整个传动机构复位，然后又进入下一个周期的循环。通过弹簧 12周期性的交替储存能量与释放能量，实现了滑竿7沿着导向杆8作高频往复直线运动。

本实施例中，将离心管支架9与滑竿7加工成一个整体，离心管支架9具有一个直径为 11mm的圆柱孔，用于容纳离心管10，并通过压盖(图中未示出)固定离心管。离心管支架9 外壁上布有冷却夹套(图中未示出)，冷却离心管10内的细胞悬浮液，可以消除或减少活性 物质的损失。

本实施例中，离心管10是带有安全锁扣的标准离心管，用于盛装研磨珠和细胞悬浮液， 为破碎细胞提供场所。滑竿7沿着导向杆8的高频往复直线运动，将迫使研磨珠在离心管内 剧烈颤振，与细胞相互剪切、撞击，使细胞破碎，释放出胞内活性物质。

本实施例中，研磨珠采用氧化锆制成的球形珠体，其直径具有0.20mm、0.25mm、0.40mm、 0.50mm、0.75mm、1.00mm等不同规格，以适应不同类型细胞的破碎。

本实施例中，将通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置扩展为四通道，即能同时处理4路 细胞的破碎，各通道在同一平面内均匀分布，其分布如图3所示。

为了验证本发明破碎细胞的功效，兹利用本实施例四通道通用型颤振珠磨式细胞快速破 碎装置对枯草杆菌黑色变种(ATCC9372)芽孢进行破碎，提取枯草杆菌的DNA，然后进行PCR 扩增，最后将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳(100V，30min)，电泳后的PCR扩 增产物使用溴化乙锭染色在紫外灯下观测。整个实施流程具体如下：

一、破碎细胞，提取DNA。

1)前期准备：从浓度为10³cfu/mL和10⁴cfu/mL的枯草杆菌黑色变种芽孢悬浮液中各取 800μL分别注入2支1.5mL的标准离心管10中，每支离心管中再分别加入200mg直径为0.2mm 的氧化锆研磨珠。

2)放样破碎：将配置好的2支离心管分别放入通道1和通道3的离心管支架9中，并用 压盖固定好离心管。然后设置电机转速为2000r/min，破碎时间为10min，启动装置对芽孢进 行破碎。

3)DNA提取纯化：破碎完成后，待研磨珠沉淀，从离心管中小心吸出上清液，利用酚- 氯仿法提取和纯化DNA。

二、PCR反应，扩增DNA。

1)引物设计：根据枯草杆菌黑色变种rrnE基因序列设计引物P₁和P₂，扩增序列长度为 494bp。

P₁：5′-GGATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3′

P₂：3′-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCTGGC-5′

2)PCR反应体系：纯化后的枯草杆菌黑色变种DNA模板液10μL，1pmol/μL的混合dNTP 4μL，200pmol的引物P₁和P₂各1μL，10×Buffer3μL，Taq聚合酶1μL，加无菌去离子 水补充至25μL。

3)PCR控制条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35 个循环；72℃延伸8min，停止于4℃。

三、电泳检测PCR反应产物

将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳电压为100V，电泳时间为30min。 电泳后的PCR扩增产物使用0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)进行染色，然后在紫外灯下观测。

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，图中M为DNA分子量标记(Marker)， C₁为未经破碎处理的枯草杆菌黑色变种芽孢悬浮液(浓度为10⁴cfu/mL)直接上样阴性对照， C₂为未加DNA模板的PCR反应体系阴性对照，C₃、C₄则分别对应浓度为10³cfu/mL和10⁴cfu/mL 的芽孢悬液，经过细胞破碎、DNA提取纯化和PCR扩增后上样电泳。

从图4可知，C₃、C₄均跑出了500bp左右的目的条带，两个阴性对照C₁和C₂则没有出现 可见条带。由此可见，本实施例四通道通用型颤振珠磨式细胞快速破碎装置能在较短时间内 (10min)完成对枯草杆菌黑色变种芽孢的破碎，令其释放出DNA。

尽管以上结合附图对本发明优选的一种实施例进行了详细描述，但是本发明并不局限于 上述的具体实施方式，具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的。本领域的工程技术 人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护范围的情况下，还可以做出 很多种改进形式，这些均属于本发明的保护范围。