蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊及其制备方法

摘要

本发明涉及一种微米级的，蛋白酶敏感的近红外荧光和磁双响应性微囊，其结构分为外、中、内紧密结合的三层，所述外层为包覆在所述中层上的带有负电性官能团的聚合物分子，所述中层为微囊的囊壁，由蛋白酶敏感的正离子型肽链与磁性纳米颗粒缠绕杂化而成；所述囊壁中包封近红外荧光分子和荧光淬灭分子；所述内层为所述微囊的囊腔，所述囊腔中存在单个或多个腔室，由所述蛋白酶敏感的正离子型肽链分子分隔开来。所述微囊在不含特定蛋白酶的组织中，通过MRI造影增强进行微囊的实时显影追踪，在到达含有特定蛋白酶的组织处，微囊解体，发出近红外荧光，同时伴随MRI造影减弱，达到微囊的双重靶向显影作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于MRI造影中的微囊，特别涉及一种蛋白酶敏感的 荧光和磁双响应性微囊及其制备方法。

背景技术

近年来，分子显像技术在现代诊断方法中已经成为一种独立的工具。 分子显像具有高度特异性，并且可以提供活体系统中分子水平上的生物学 特征。这种技术可以通过疾病中特定分子活动的可视化监测来实现早期诊 断和治疗过程追踪。不同的显像模式，如光学荧光成像、磁共振成像(MRI)、 超声造影等，均被成功运用于医学分子显像领域。在光学荧光成像的研究 中，近红外荧光探针由于在活体组织中的穿透能力强而成为体内造影领域 的主要研究对象。随着研究的深入发展，基于荧光共振能量转移的近红外 荧光探针可以与肽链、聚合物以及无机分子相结合，更加准确地探测靶向 生物分子或显示特异性环境的改变。蛋白酶敏感的荧光探针，即将近红外 荧光分子连接在肽链上，通过自淬灭或加入淬灭剂使荧光淬灭，在蛋白酶 存在的特定条件下，肽链断开，荧光分子重新发射荧光，达到靶向显像的 目的。但荧光淬灭效率低而导致的显影“信号/噪声”比较低一直是近红 外荧光显像的不足之处，为了弥补这一缺陷，通过近红外荧光显像与其他 显像方式协同显影是一种有效的方式。

MRI造影是一种目前医学界有力的诊断工具，在脑部与中枢神经系统 的成像、肿瘤的检测与诊断等领域都有广泛的应用。作为MRI造影剂的一 种，磁性纳米颗粒能够影响水质子的弛豫率，从而造成MR显影中信号强 度降低。磁性纳米颗粒组装体的形成能够增强水质子周围环境的磁场不均 匀性，从而增强MR显影。磁性纳米颗粒组装微囊除了进行MRI显影外， 还可以具备其他显影功能。中国发明专利授权公告号“CN100548465C”， 发明名称为“多重响应的高分子微囊及其制备方法”的专利，提到了一种 包裹气体的高分子微囊，该微囊的制备方法选用双乳化法，首先制得W/O/W 乳液，通过挥发去除油相溶剂，得到高分子微囊，具有声、磁、光等多重 响应性能。中国发明专利申请号“CN 201110046996.6”，发明名称为“多 功能聚电解质微囊及其无模板组装方法”的专利，提出一种无模板自组装 磁性纳米颗粒-聚合物分子杂化微囊，得到可以同时进行MRI造影与超声 造影的囊状组装体。但是，将蛋白酶敏感的近红外荧光显影与MRI造影结 合在一起的组装体末见研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服已有方法的不足，提供一种微米级的，蛋白酶 敏感的荧光和磁双响应性微囊，其结构分为外、中、内紧密结合的三层， 所述外层为包覆在所述中层上的带有负电性官能团的聚合物分子，所述中 层为微囊的囊壁，由蛋白酶敏感的正离子型肽链与磁性纳米颗粒缠绕杂化 而成；所述囊壁中包封近红外荧光分子和荧光淬灭分子；所述内层为所述 微囊的囊腔，所述囊腔中存在单个或多个腔室，由所述蛋白酶敏感的正离 子型肽链分子分隔开来。

所述微囊在不含特定蛋白酶的组织中，通过MRI造影增强进行微囊的 实时显影追踪，在到达含有特定蛋白酶的组织处，微囊解体，发出近红外 荧光，同时伴随MRI造影减弱，达到微囊的双重靶向显影作用。其结构如 图1所示。

所述特定蛋白酶为能够水解所述微囊中的肽链分子的蛋白酶。

所述的组成微囊囊壁的蛋白酶敏感的肽链分子包括，胰蛋白酶敏感的 聚左旋赖氨酸(PLL)，基质金属蛋白酶-2或基质金属蛋白酶-9敏感的脯 氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-精氨酸肽(PLG/LR)，蛋白酶-3(caspase-3) 敏感的天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸肽(DEVD)，二肽基肽酶敏感的 甘氨酸-脯氨酸肽(GP)等，上述肽链左侧均为氨基端。以上肽链分子的 结构可为直链、支链或环状结构，长度无特定限制。

所述近红外荧光分子为目前已经商业化的近红外荧光分子，包括吲哚 菁绿ICG多次甲菁Cy系列近红外荧光染剂 Alexa Flour系列近红 外荧光染剂(如Alexa680：吸收波长679，发射波长702，购于联科技术 有限公司、Alexa647、菁染料、含四吡咯 类的染料、噻嗪类染料和噁嗪类染料中的一种或多种，但不局限于上述种 类。

所述荧光淬灭分子是吸收波长与所述近红外荧光分子的发射波长有 部分重合的荧光淬灭物质，包括吲哚菁绿ICG、Cy系列近红外荧光染剂 (Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Flour系列近红外荧光染剂(Alexa680、 Alexa647)、NIRQBHQ荧光探针系列 QSY21、菁染料、含四吡 咯类的染料、噻嗪类染料和噁嗪类染料中的一种或多种，但不限于上述种 类。

较佳的，所述带有负电性官能团的聚合物分子为羧酸基团、羟基、磺 酸基中的一种或几种组合，如聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸钠、葡聚糖和羧甲 基葡聚糖中的一种或几种，但不局限于上述种类。

所述的磁性纳米颗粒可以缩短MRI成像的自旋-自旋弛豫时间，优选 为水溶性Fe3O4纳米颗粒，如柠檬酸修饰的Fe3O4纳米颗粒，或由硅酸基 团修饰的Fe3O4纳米颗粒。

所述的腔室中的物质可以为肽链分子、包封液体或包封气体，所述腔 室中的气体包括空气、O2、CO2、N2、氟碳气体或/和氟硫气体。

本发明所述肽链可通过本领域现有技术制备。

本发明所述蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊可通过本领域常规 技术制备。

本发明还提供了一种制备所述蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊 的方法，包括以下具体步骤：

第一步、将所述近红外荧光分子连接在带有正电荷的所述肽链上，再 于室温下加入负电性盐溶液和所述荧光淬灭分子制得混合溶液；或将所述 近红外荧光分子与所述荧光淬灭分子同时连接在所述肽链上，再加入所述 负电性盐溶液制得混合溶液；最后将所述混合溶液高速振荡(优选 500-3000rpm)，形成团聚体溶液。

第二步、将所述磁性纳米颗粒的水溶液加入到所述团聚体溶液中，所 述磁性纳米颗粒表面负电荷数不低于溶液中所述肽链上的正电荷数，于室 温下超声适当时间(优选10min-4h)，形成囊壁中包有纳米颗粒的复合组 装体。

第三步、将带有负电性功能团的聚合物分子水溶液加入到第二步所述 复合组装体溶液中，所加聚合物分子溶液中所含的阴离子数不低于负电性 盐溶液中所含阴离子数。室温下超声适当时间(优选5min-2h)，得到表面 有大分子修饰的杂化微囊。

第四步、将得到的杂化微囊高速(优选1500-6000rpm)离心清洗，冷 冻干燥，得到粉末状的所述蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊。

较佳的，本发明所述近红外荧光分子上的负电荷与所述肽链上的正电 荷的电荷比例为1∶10-1∶50；所述负电性的盐溶液中的阴离子与所述肽链 上的阳离子电荷比在1∶20-100∶1之间，所述荧光淬灭分子与所述近红外 荧光分子的摩尔比例为1∶1-20∶1之间。

较佳的，所述的带负电性的盐，包括羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸 盐等的一种或几种组合，但不限于上述种类。

所述的的清洗为用去离子水分散清洗再离心，反复3至5次。

本发明制备方法的原理与特点为：团聚体的形成主要依靠带有正电荷 的肽链与带有负电荷的盐之间离子交联的作用，而近红外荧光分子与淬灭 剂则是通过正负电荷的吸附作用组装入团聚体中，此过程中，近红外荧光 分子与淬灭分子的距离缩小至纳米级范围内，此时通过荧光共振能量转移 作用，荧光分子不会发射荧光。磁性纳米颗粒的加入使磁粒组装入团聚体 中，形成磁性微囊，随着磁粒的组装，在外磁场存在的情况下，溶液中局 部磁场增强，导致MRI造影增强，表现为核磁共振成像中T₂弛豫效能增强。 负电性表面大分子的加入将组装体内部的肽链吸附至囊壁内侧，囊壁中出 现单个或多个充水腔室，腔室由残留的肽链隔开。在特定蛋白酶存在的环 境中，囊壁的肽链发生水解，导致整个微囊的解体。荧光分子与淬灭分子 的距离增大，导致荧光分子重新发射荧光；磁性纳米颗粒组装体分解为单 分散的磁粒，导致MRI造影由强变弱，表现为核磁共振成像中T₂弛豫效能 降低，从而进行蛋白酶靶向的荧光-磁共振双重造影。

本发明所述蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊的优点为：在不含有 特定蛋白酶的溶液或组织环境中，微囊不发射近红外荧光，且MRI造影强 度较高，表现为核磁共振成像中的T₂弛豫效能增强，达到实时核磁造影的 效果；在微囊到达含有特定蛋白酶的系统环境时，微囊囊壁的肽链水解， 导致微囊解体，微囊发射近红外荧光，且MRI造影强度下降，表现为微囊 的近红外荧光激发峰增强，同时核磁造影的T₂弛豫效能降低，达到对特定 蛋白酶的靶向双重显影的结果。通过这一过程达到了核磁共振成像与近红 外荧光协同显影的目的，弥补了在实时造影和靶向显影中单一显影方式的 不足。

附图说明

图1为本发明所述蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊的结构示意 图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为 前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的 保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中所述柠檬酸包裹的Fe₃O₄磁性颗粒、SiCOOH-Fe3O4磁性 纳米颗粒，通过热分解法与配体交换方法制备，制备所参考的文献为：

1、Jongnam，P.；Kwangjin，A.N.；Yosun，H.et al.， Ultra-large-scale syntheses of monodisperse nanocrystals. Nature Materials 2004，3(12)，891-895，和

2、Lattuada，M.；Hatton，T.A.，Functionalization of  Monodisperse Magnetic Nanoparticles.Langmuir 2006，23(4)， 2158-2168。

所制备的柠檬酸包裹的Fe₃O₄磁性颗粒的核磁共振成像T₂弛豫效能为 17s^-1mM^-1，所制备的SiCOOH-Fe₃O₄磁性颗粒的核磁共振成像T₂弛豫效能为 15s^-1mM^-1，MRI表征方法见实施例1。

以下实施例中所用肽链购于美国sigma-aldrich公司。

实施例1：制备胰蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向2.5mL，1mg/mL聚左旋赖氨酸(M_w～65000)溶液中滴加2.5mL， 0.025mg/mL的ICG水溶液，孵育2h，再向溶液中加入5mL，3mg/mL的柠檬 酸钠溶液，以1000rpm的转速振荡10s，形成包裹自淬灭荧光分子的大分 子团聚体水溶液。

b.在团聚体溶液中滴加2.5mL，0.5mg/mL柠檬酸包裹的Fe₃O₄磁性颗 粒，(该磁性纳米颗粒平均粒径为7nm，形状为球形，通过热分解法与配体 交换方法制备)，室温下超声(工作频率40kHz)孵育20min，形成囊壁包有 磁性纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加1.5mL，5mg/mL的聚丙烯酸(M_w～1800)溶液，超声 (工作频率40kHz)孵育10min。

d.将孵育得到的微囊溶液以3000rpm的转速离心15min，去掉上清液， 收集所得微囊。将所得微囊分散在去离子水中，再次以3000rpm的转速离 心，反复3次。清洗后的微囊-50℃冷冻干燥，得到粉末状微囊即所述蛋 白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为1μm，结构如图1所示1为蛋白酶敏感的正 离子型肽链，2为带有负电性官能团的聚合物分子，3为磁性纳米颗粒，4 为近红外荧光分子，5为荧光淬灭分子，6为微囊囊腔。

体外磁共振成像(MRI)效果通过超导MRI扫描仪(Magnetom Trio， Siemens，Munich，德国)检测，其内部使用膝关节线圈。将所制备的微囊 在70℃下分别溶于6份1.5mL，1mg/mL的琼脂糖溶液中，使得溶液中铁元 素的含量分别为0.01、0.03、0.06、0.09、0.12，、0.15mM；所得溶液在 室温下冷却凝固，进行MRI扫描检测。测试使用T₂加权像快速自旋回波序 列(TSE)，参数为：磁场强度3×10^-3T，重复时间(TR)3000ms，切 片厚度0.5mm。根据与回波时间(TE)成函数关系的信号衰减量，计算 样品的T₂弛豫时间。以1/T₂为纵坐标，Fe含量为横坐标作图，其拟合斜 率即为样品的T₂弛豫效能。得到微囊的T₂弛豫效能为120s^-1mM^-1。将微囊 在0.25mg/mL胰蛋白酶溶液中静置30min后微囊水解，再次测得弛豫效能 为22s^-1mM^-1。

样品的荧光性能由分光光度计(RF-5301PC岛津分光光度计)测得， 以荧光染料的激发波长835nm激发所测微囊，微囊浓度为1mg/mL，测量得 到微囊发射出的荧光强度。将微囊在0.25mg/mL的蛋白酶溶液中静置 30min后，(保持微囊浓度不变)，微囊水解，再次测得水解后样品的荧光 强度。将水解后样品的荧光发射强度与水解前微囊的荧光发射强度做比 值，得到水解过程中样品的荧光增强倍率。本实施例中的荧光增强倍率为 25。

实施例2：制备基质金属蛋白酶2/9敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向2mL，2mg/mL的PLG/LR(M_w～70000)溶液中滴加1mL， 0.01mg/mLCy5.5溶液，室温下静止孵育4h，形成荧光剂修饰的聚肽大分 子。在形成的聚肽水溶液中加入5mL，3mg/mL的乙二胺四乙酸四钠盐EDTA 水溶液，及0.5mL，0.05mg/mL的荧光淬灭剂BHQ3，以750rpm的转速振荡 20s，形成包裹荧光剂、荧光淬灭剂的聚肽团聚体。

b.在团聚体溶液中滴加2mL，0.3mg/mL柠檬酸包裹的Fe₃O₄磁性颗粒， (该磁性纳米颗粒平均粒径为7nm，形状为球形，通过热分解法与配体交 换方法制备^[1，2])，室温下超声(工作频率40kHz)30min，形成囊壁包有磁性 纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加1.5ml，3mg/mL聚苯乙烯磺酸钠(M_w～70000)溶液， 超声(工作频率40kHz)10min。

d.将得到的微囊溶液以4500rpm的速度离心15min，去掉上清液，收 集所得微囊。将所得微囊分散在去离子水中，再次以同样速度离心，反复 3次。清洗后的微囊-50℃冷冻干燥，得到粉末状充空气微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为1.5μm。

体外磁共振成像(MRI)实验过程如实施例1，得到微囊的T₂弛豫效 能为118s^-1mM^-1。将微囊在0.05mg/mL基质金属蛋白酶2/9溶液中静置30min 后微囊水解，再次测得弛豫效能为20s^-1mM^-1。

本实施例中荧光性能测试激发波长为675nm，其余步骤和条件同实施 例1，蛋白酶水解过程中荧光增强倍率为35.5。

实施例3：制备蛋白酶-3敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向1.5mL、2mg/mL的DEVD(M_w～50000)聚肽溶液中滴加1mL、0.05mg/mL 的ICG溶液，室温下静止孵育4h，形成荧光剂修饰的聚肽大分子。在形成 的聚肽水溶液中加入7mL、4mg/mL的四天冬酰胺钠盐Na₅(ASP)₄水溶液， 及0.5mL，0.05mg/mL的荧光淬灭剂NIRQ820，以900rpm的转速振荡10s， 形成包裹荧光剂、荧光淬灭剂的聚肽团聚体。

b.在团聚体溶液中滴加2.5mL、0.25mg/mL硅酸盐包裹的Fe₃O₄磁性颗 粒，(SiCOOH-Fe3O4磁性纳米颗粒平均粒径为10nm，形状为球形，通过热 分解法与配体交换方法制备)，室温下超声(工作频率40kHz)30min，形成 囊壁包有磁性纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加3mL、2mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠(M_w～70000)溶液， 超声(工作频率40kHz)20min。

d.将得到的微囊溶液以4500rpm的转速离心15min，去掉上清液，收 集所得微囊。将所得微囊分散在去离子水中，再次以4500rpm的转速离心， 反复3次。清洗后的微囊-50℃冷冻干燥，充入全氟己烷气体，得到粉末 状充气微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为1.5μm。

体外磁共振成像(MRI)实验过程如实施例1，得到微囊的T₂弛豫效 能为80s^-1mM^-1。将微囊在0.15mg/mL蛋白酶-3溶液中静置30min后微囊水 解，再次测得弛豫效能为16s^-1mM^-1。

本实施例中荧光性能测试激发波长为835nm，其余步骤和条件同实施 例1，蛋白酶水解过程中荧光增强倍率为42。

实施例4：制备二肽基肽酶敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向3mL、1mg/mL的GP(M_w～60000)聚肽溶液中滴加2mL、0.015mg/mL 的Alexa680溶液，室温下静止孵育6h，形成荧光剂修饰的聚肽大分子。 在形成的聚肽水溶液中加入6mL、3mg/mL的柠檬酸钠水溶液，及3mL、 0.01mg/mL的荧光淬灭剂QSY21，以2500rpm的转速振荡20s，形成包裹荧 光剂、荧光淬灭剂的聚肽团聚体。

b.在团聚体溶液中滴加3mL、0.5mg/mL的SiCOOH-Fe₃O₄磁性颗粒， (SiCOOH-Fe3O4磁性纳米颗粒平均粒径为10nm，形状为球形，通过热分 解法与配体交换方法制备^[1，2])，室温下超声(工作频率40kHz)30min，形成 囊壁包有磁性纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加3mL、1.8mg/mL的羧甲基葡聚糖溶液(M_w～40000)， 超声(工作频率40kHz)20min。

d.将得到的微囊溶液4000rpm离心15min，去掉上清液，收集所得微 囊。将所得微囊分散在去离子水中，再次以4000rpm离心，反复3次。清 洗后的微囊-50℃冷冻干燥，负压充入CO₂气体，得到粉末状充气微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为1.6μm。

体外磁共振成像(MRI)实验过程如实施例1，得到微囊的T₂弛豫效 能为85s^-1mM^-1。将微囊在0.22mg/mL二肽基肽酶溶液中静置30min后微囊 水解，再次测得弛豫效能为17s^-1mM^-1。

本实施例中荧光性能测试激发波长为630nm，其余步骤和条件同实施 例1，蛋白酶水解过程中荧光增强倍率为37。

实施例5：制备胰蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向2mL、2mg/mL的聚左旋赖氨酸(M_w～65000)溶液中滴加0.5mL， 0.15mg/mL Cy5.5溶液及荧光淬灭剂QSY21，室温下孵育3h，形成荧光剂/ 淬灭剂修饰的聚肽大分子。在形成的聚肽水溶液中加入4mL、3mg/mL的柠 檬酸钠水溶液，以750rpm振荡20s，形成包裹荧光剂、荧光淬灭剂的聚肽 团聚体。

b.在团聚体溶液中滴加2mL、0.25mg/mL的柠檬酸包裹的Fe₃O₄磁性颗 粒，(该磁性纳米颗粒平均粒径为7nm，形状为球形，通过热分解法与配体 交换方法制备^[1,2])，室温下超声(工作频率40kHz)20min，形成囊壁包有磁 性纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加2mL、5.5mg/mL的葡聚糖(Mw～40000)溶液，超声 (工作频率40kHz)30min。

d.将得到的微囊溶液以4000rpm离心10min，去掉上清液，收集所得 微囊。将所得微囊分散在去离子水中，再次以4000rpm离心，反复3次。 清洗后的微囊-50℃冷冻干燥，得到粉末状微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为2μm。

体外磁共振成像(MRI)实验过程如实施例1，得到微囊的T₂弛豫效 能为133s^-1mM^-1。将微囊在0.25mg/mL胰蛋白酶溶液中静置30min后微囊水 解，再次测得弛豫效能为20s^-1mM^-1。

本实施例中荧光性能测试激发波长为675nm，其余步骤和条件同实施 例1，蛋白酶水解过程中荧光增强倍率为45.5。

实施例6：制备胰蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向1.5mL、2mg/mL的聚左旋赖氨酸(M_w～65000)溶液中滴加1mL、 0.08mg/mL的ICG溶液，及2mL、0.6mg/mL的荧光淬灭剂NIRQ820，室温 下静止孵育4h，形成荧光剂/淬灭剂修饰的聚肽大分子。在形成的聚肽水 溶液中加入4.5mL、3mg/mL的柠檬酸钠水溶液，1500rpm振荡10s，形成 包裹荧光剂、荧光淬灭剂的聚肽团聚体。

b.在团聚体溶液中滴加2mL、1mg/mL的SiCOOH-Fe₃O₄磁性颗粒， (SiCOOH-Fe3O4磁性纳米颗粒平均粒径为10nm，形状为球形，通过热分 解法与配体交换方法制备^[1，2])，室温下超声(工作频率40kHz)30min，形成 囊壁包有磁性纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加2mL、3mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠(M_w～70000)溶液， 超声(工作频率40kHz)30min。

d.将得到的微囊溶液4000rpm离心5min，去掉上清液，收集所得微囊。 将所得微囊分散在去离子水中，再次以4000rpm离心，反复3次。清洗后 的微囊-50℃冷冻干燥，充入全氟己烷气体，得到粉末状充气微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为2μm。

体外磁共振成像(MRI)实验过程如实施例1，得到微囊的T₂弛豫效 能为115s^-1mM^-1。将微囊在0.25mg/mL胰蛋白酶溶液中静置30min后微囊水 解，再次测得弛豫效能为18s^-1mM^-1。

本实施例中荧光性能测试激发波长为835nm，其余步骤和条件同实施 例1，蛋白酶水解过程中荧光增强倍率为40。

实施例7：制备胰蛋白酶敏感的荧光和磁双响应性微囊

a.向1mL、1mg/mL的聚左旋赖氨酸(M_w～65000)溶液中滴加2mL、 0.025mg/mL的Alexa680溶液，及1mL、0.08mg/mL的荧光淬灭剂BHQ3， 室温下静止孵育6h，形成荧光剂/淬灭剂修饰的聚肽大分子。在形成的聚 肽水溶液中加入5mL、2.5mg/mL的柠檬酸钠水溶液，以2000rpm转速振荡 20s，形成包裹荧光剂、荧光淬灭剂的聚肽团聚体。

b.在团聚体溶液中滴加2mL、0.5mg/mL的柠檬酸包裹的Fe₃O₄磁性颗 粒，(该磁性纳米颗粒平均粒径为7nm，形状为球形，通过热分解法与配体 交换方法制备^[1，2])，室温下超声(工作频率40kHz)30min，形成囊壁包有磁 性纳米颗粒的微囊结构。

c.向微囊溶液中滴加2mL、4mg/mL的聚丙烯酸(M_w～1800)溶液，超声(工 作频率40kHz)40min。

d.将得到的微囊溶液以5000rpm离心15min，去掉上清液，收集所得 微囊。将所得微囊分散在去离子水中，再次以5000rpm离心，反复3次。 清洗后的微囊-50℃冷冻干燥，得到粉末状微囊。

经动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征，所制备的微囊 具有空心结构，其平均粒径为2.2μm。

体外磁共振成像(MRI)实验过程如实施例1，得到微囊的T₂弛豫效 能为105s^-1mM^-1。将微囊在0.25mg/mL胰蛋白酶溶液中静置30min后微囊水 解，再次测得弛豫效能为22s^-1mM^-1。

本实施例中荧光性能测试激发波长为630nm，其余步骤和条件同实施 例1，蛋白酶水解过程中荧光增强倍率为35。