来自于稀脉萍的新的脂加氧酶

摘要

本发明提供来自于稀脉萍SH株及稀脉萍441株的具有9位生成物特异性的高活性型的新的脂加氧酶cDNA，以及由该cDNA编码的蛋白质。

说明书

技术领域

本发明涉及来自于稀脉萍的新的高活性型9位生成物特异性脂加氧酶 基因、使用该脂加氧酶基因的高活性型9位生成物特异性脂加氧酶的制造 方法、以及该脂加氧酶基因的表达产物。

背景技术

脂加氧酶是具有在亚油酸、亚麻酸(碳数18)或花生四烯酸(碳数20)等 的具有1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸中直接导入分子状氧，生成氢过氧 基(-OOH)的活性的酶，已知存在于植物以及动物、霉菌、酵母等真核微生 物等中(内山充等，過酸化脂質と生体(过氧化脂质与生物体)，23-26,1985, 学会出版センタ一)。在动物中，该酶参与由花生四烯酸生成前列腺素的过 程，因此研究进展最多(山本尚三，蛋白質核酸酵素(蛋白质核酸酶)，44， 1132-1138，1999)。对于植物的脂加氧酶，以α-亚麻酸、亚油酸等的碳数 18的不饱和脂肪酸为底物，已知可分类为在9位与13位的2个部位显示 特异性的酶(例如，内山充等，過酸化脂質と生体(过氧化脂质与生物体)， 23-26,1985,学会出版センタ一；Grechkin等，Eur.J.Biochem.,199， 451-457，1991)。9位及13位特异的脂加氧酶，已知存在于马铃薯、大豆、 西红柿、豌豆、大麦、小麦、玉米、黄瓜等中，还分离出了几种cDNA。 但是，主要研究的是与作为植物激素受到关注的茉莉酸的代谢途径相关的 13位生成物特异性脂加氧酶，对于9位生成物特异性脂加氧酶的研究比较 少。作为试剂，来自于大豆的13位生成物特异性脂加氧酶由シグマ社市售 (シグマ社，制品号L7395)，9位生成物特异性脂加氧酶没有市售。

本发明者们，在本申请前，发现具有花芽形成促进作用、植物激活作 用及包含它们的植物生长调节作用的具有以下的结构的α-酮醇不饱和脂肪 酸(以下，称为KODA)，

已知KODA是通过9位生成物特异性脂加氧酶及丙二烯氧化物合酶由 α-亚麻酸衍生的(日本特开平9-295908号公报、日本特开平11-29410号公 报、日本特开2001-131006号公报及日本特开2009-17829号公报)。

已知KODA在各种植物种中存在，并已知受到胁迫的稀脉萍(Lemna  paucicostata)与其他的植物相比放出极高的水平(数百倍)的KODA(日本特 开平11-29410号公报)。因此，推测在稀脉萍中存在具有比其他植物高的 活性的9位生成物特异性脂加氧酶。但是，尚未从稀脉萍中分离出9位生 成物特异性脂加氧酶的cDNA，序列也未知。

以α-亚麻酸或亚油酸等作为起始材料通过酶合成来制造KODA时，9 位生成物特异性脂加氧酶是必需的。但是，9位生成物特异性脂加氧酶不 能商业获得，通过大肠杆菌来表达现在已知的9位生成物特异性脂加氧酶 的cDNA时，大多为不溶性，难以大量获得显示活性的蛋白质。进而，由 植物提取9位生成物特异性脂加氧酶。材料的获得或处理需要花费相当的 功夫，另外目前为止已知的9位生成物特异性脂加氧酶活性低，因此期望 确立大量调制高活性型的9位生成物特异性脂加氧酶的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平9-295908号公报

专利文献2：日本特开平11-29410号公报

专利文献3：日本特开2001-131006号公报

专利文献4：日本特开2009-17829号公报

非专利文献

非专利文献1：内山充等，過酸化脂質と生体(过氧化脂质与生物体)， 23-26,1985,学会出版センタ一

非专利文献2：山本尚三，蛋白質核酸酵素(蛋白质核酸酶)，44， 1132-1138，1999

非专利文献3：Grechkin等，Eur.J.Biochem.,199,451-457,1991

发明内容

发明要解决的课题

本发明要解决的课题是，鉴别对表达有用的高活性型的9位生成物特 异性脂加氧酶的基因，分离cDNA，以及提供该脂加氧酶基因的表达产物， 进而提供使用该脂加氧酶以高的收量制造KODA的方法。

用于解决课题的方法

本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，在由稀脉萍分离新 的脂加氧酶cDNA时，为了得到更高活性的脂加氧酶cDNA，将稀脉萍株 对于KODA生产能进行了筛选。具体地说，进行了62种稀脉萍株的筛选， 结果令人惊讶地发现，稀脉萍SH株具有其他的稀脉萍株的平均的10倍以 上的KODA生产能。

本发明者们由稀脉萍SH株和作为代表株稀脉萍441株分离脂加氧酶 cDNA，以大肠杆菌作为宿主进行表达，讨论其生成物特异性。其结果确 认了具有9位生成物特异性脂加氧酶活性，明确了该活性具有比现有使用 的稻的9位生成物特异性脂加氧酶活性高的活性。

因此，本发明者们在本申请中提供来自于稀脉萍的新的9位生成物特 异性脂加氧酶基因及由该基因编码的蛋白质。具体地说，本发明提供包含 选自序列号1、序列号3及序列号5中的碱基序列的DNA的基因，包含与 该DNA实际上相同的DNA的基因，以及由这些基因编码的蛋白质。进而， 本发明者们提供使上述DNA与载体片段结合而成的表达载体。进而，本 发明还涉及由该表达载体转化而得的微生物、动物细胞或昆虫细胞等转化 体。通过将上述转化体进行培养、提取、纯化来得到本发明的9位生成物 特异性脂加氧酶。

发明的效果

本发明的9位生成物特异性脂加氧酶，与现有的9位生成物特异性脂 加氧酶相比较活性高，另外用大肠杆菌表达的情况下也维持高的活性。因 此，通过使用该9位生成物特异性脂加氧酶，可以以α-亚麻酸、亚油酸等 作为起始材料，通过酶合成而有效地制造以KODA为代表的α-酮醇不饱 和脂肪酸。

附图说明

图1是显示62种稀脉萍株中的KODA生产量的图。

图2A是显示稀脉萍SH株的LOX基因的基因序列的图。

图2B是显示图2A的基因序列的继续的图。

图2C是显示图2B的基因序列的继续的图。

图3A是显示稀脉萍441株的LOX1基因的基因序列的图。

图3B是显示图3A的基因序列的继续的图。

图3C是显示图3B的基因序列的继续的图。

图4A是显示稀脉萍441株的LOX2基因的基因序列的图。

图4B是显示图4A的基因序列的继续的图。

图4C是显示图4B的基因序列的继续的图。

图5A是显示使用r9-LOX1的亚麻酸-9-氢过氧化物合成反应的HPLC 图的图。

图5B是显示使用SHLpLOX的亚麻酸-9-氢过氧化物合成反应的 HPLC图的图。

图5C是显示使用441LpLOX1的亚麻酸-9-氢过氧化物合成反应的 HPLC图的图。

图5D是显示使用441LpLOX2的亚麻酸-9-氢过氧化物合成反应的 HPLC图的图。

图6是在大肠杆菌中被表达的SHLpLOX、441LpLOX1、441LpLOX2 及作为对照使用的r9-LOX1的脂加氧酶的活性的比较图。

具体实施方式

以下，对于本发明的实施方式进行说明。本发明涉及来自于稀脉萍的 新的9位生成物特异性脂加氧酶基因及由该基因编码的蛋白质。具体地说， 本发明涉及包含选自序列号1、序列号3及序列号5中的碱基序列的DNA 的基因，和包含与该DNA实际上相同的DNA的基因，以及由这些基因编 码的蛋白质。该碱基序列优选为序列号1或序列号3所示的序列。进一步 优选该碱基序列为序列号1所示的序列。在这里，所谓“实际上相同的 DNA”，是指与参考基准的DNA在碱基序列中具有至少70％的同一性的 DNA。同一性优选为至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少 98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％。进而，“实际上相同的DNA” 还是指与包含参考基准的DNA的互补碱基序列的DNA在高严格条件下杂 交的DNA。这些“实际上相同的DNA”在被转录、翻译的情况下，具有 与由参考基准的DNA编码的蛋白质相同的酶活性，即9位生成物特异性 脂加氧酶活性。进而，本发明还涉及编码包含选自序列号2、序列号4及 序列号6中的氨基酸序列的蛋白质的DNA，以及编码包含与该氨基酸序列 实际上相同的氨基酸序列的蛋白质的DNA。在这里，对于“包含实际上相 同的氨基酸序列的蛋白质”在以下详述。进而，本发明涉及作为上述DNA 的片段、且编码具有脂加氧酶活性的蛋白质的DNA片段。

杂交可按照公知的方法或依据该公知的方法的方法、例如J.Sambrook  等，Molecular Cloning 2nd,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989中记载的 方法来进行，另外所谓高严格的杂交条件，是指例如NaCl浓度为约10～ 40mM、优选为约20mM，温度为约50～70℃，优选为约60～65℃的条件。

本发明进一步涉及包含选自序列号2、序列号4及序列号6中的氨基 酸序列的蛋白质，以及包含与该氨基酸序列实际上相同的氨基酸序列的蛋 白质。该氨基酸序列优选为序列号2或4所示的序列。该氨基酸序列最优 选为序列号2所示的序列。在这里，所谓“包含实际上相同的氨基酸序列 的蛋白质”，是指包含在参考基准的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1 或数个氨基酸的氨基酸序列，而且具有包含参考基准的氨基酸序列的蛋白 质的活性，即9位生成物特异性脂加氧酶活性的蛋白质。进而，所谓“包 含实际上相同的氨基酸序列的蛋白质”，是指包含与参考基准的氨基酸序 列具有至少70％的同一性的序列，而且具有9位生成物特异性脂加氧酶活 性的蛋白质。同一性优选为至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、 至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％。进而，本发明还涉及由 包含选自序列号1、序列号3及序列号5中的碱基序列的DNA、或与该 DNA实际上相同的DNA编码，并且具有9位生成物特异性脂加氧酶活性 的蛋白质。进而，本发明还涉及作为上述蛋白质的片段、且具有脂加氧酶 活性的蛋白质片段。

在本说明书中，序列号1表示来自于稀脉萍SH株的9位生成物特异 性脂加氧酶的碱基序列，序列号2表示该脂加氧酶的氨基酸序列。另一方 面，序列号3表示来自于稀脉萍411株的9位生成物特异性脂加氧酶1的 碱基序列，序列号4表示该脂加氧酶的氨基酸序列，序列号5表示来自于 稀脉萍411株的9位生成物特异性脂加氧酶2的碱基序列，序列号6表示 该脂加氧酶的氨基酸序列。将这些具体的序列示于图2A～4C。

所谓9位生成物特异性脂加氧酶活性，是指以α-亚麻酸、亚油酸等的 碳数18的不饱和脂肪酸作为底物，在其9位的碳上特异性地将分子状的氧 作为氢过氧基导入的酶活性。

本发明中所谓9位生成物特异性脂加氧酶或具有9位生成物特异性脂 加氧酶活性的蛋白质，是指例如通过后述的活性测定法确认了具有显著的 9位生成物特异性脂加氧酶活性的蛋白质。包含例如，与具有序列号2或 序列号4所示的氨基酸序列的9位生成物特异性脂加氧酶的活性进行比较， 具有例如至少10％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、更优 选为至少95％的活性的蛋白质，进一步优选具有100％以上的活性的蛋白 质。

本发明的基因(cDNA)，例如可通过以下的步骤来得到。根据来自于植 物的脂加氧酶的共有氨基酸序列来设计引物，进行RT-PCR等，得到cDNA 片段。根据需要将该片段用³²P或地高辛等标记，使用它们并使用 5’-RACE、3’-RACE或制作的cDNA文库通过常规方法进行筛选，可得到 脂加氧酶基因(cDNA)全长。碱基序列的确定可通过桑格法(Sanger’s  method)或化学降解法(Maxam-Gilbert method)等通常的方法进行。

作为其他方法，将来自于稀脉萍的9位生成物特异性脂加氧酶使用硫 酸铵分级和/或各种色谱等的方法来纯化，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 来分离，并电转印于PVDF膜等，切下用考马斯亮蓝等的色素检测出的带， 然后通过蛋白质测序仪，确定N末端氨基酸序列，以该序列为基础设计引 物，按照上述的方法通过进行PCR可得到脂加氧酶基因(cDNA)全长。

分离的基因(cDNA)例如通过公知的方法插入质粒、病毒等来制备表达 载体，将其导入宿主细胞例如微生物、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等 培养细胞中使其表达，从而可大量制备该蛋白质。进而，作为蛋白质表达 系统，还有时使用例如使用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质表达系统。

作为载体，可使用：来自于大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒，例如 pBR322、pBR325、pUC18、pUC119；来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的质粒，例如pUB110、pTP5、pC194；来自于酵母的质粒，例如pSH19、 pSH15；λ噬菌体等噬菌体；逆转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等动物病 毒；以及pA1-11、pXT1、pRC/CMV、pRC/RSV、pcDNAI/Neo等。在本 发明中可使用市售的载体pET23d(Novagen)。

含有本发明的基因的表达载体可以通过在适当的载体的启动子的下游 介由适当的限制性位点以公知的方法连接本发明的基因来制造。作为本发 明中使用的启动子，只要是与基因的表达中使用的宿主相对应的适当的启 动子则没有特别限制。例如，在使用动物细胞作为宿主的情况下，可举出 SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动 子、β-肌动蛋白启动子等。宿主为大肠杆菌等埃希氏菌属的细菌的情况下， 优选使用trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、 T7启动子等，宿主为杆菌属菌的情况下，优选使用SPO1启动子、SPO2 启动子、pen启动子，宿主为酵母的情况下，优选使用PHO5启动子、PGK 启动子、GAP启动子、ADH启动子等。宿主为昆虫的情况下，优选为多 角体蛋白启动子、P10启动子等。根据需要，在表达载体中可进一步包含 增强子、剪接信号、多聚A添加信号、选择标志物、SV40复制起点等。

宿主细胞可以是作为用于产生重组蛋白的宿主一直以来被利用的原核 或真核细胞的任一种，例如没有限定地为哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物 细胞或真菌细胞，并且优选为细菌或真菌等的微生物。“真菌”的用语表 示包含丝状菌及酵母的含义。适当的细菌的例子可举出埃希氏菌属 (Escherichia)例如大肠杆菌、杆菌属例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 链霉菌属(Streptomyces)例如变铅青链霉菌(S.lividans)等革兰氏阳性菌；假 单胞菌属(Pseudomonas)例如洋葱假单胞菌(P.cepacia)等革兰氏阴性菌。另 外，该细胞可为真菌、即酵母或丝状菌的细胞。酵母例如可以是酵母属 (Saccharomyces)的细胞，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)。丝状菌宿主生物例 如可以是曲霉属(Aspergillus)种的株，例如黑曲菌(A.niger)。作为昆虫细 胞，可举出例如Sf细胞、MG1细胞、BmN细胞等。作为动物细胞，可举 出例如猴细胞COS-7细胞、Vero细胞、中国仓鼠细胞CHO等。在本发明 中特别优选利用大肠杆菌细胞。

宿主细胞的转化可利用公知的方法，例如氯化钙法、磷酸钙共沉淀法、 DEAE葡聚糖法、脂质体转染法、原生质体聚乙二醇融合法、电穿孔法等， 根据利用的宿主细胞来选择适当的方法即可。

用适当的培养基培养得到的重组宿主细胞，由培养液以惯用的步骤回 收目标蛋白质，所述惯用的步骤例如，没有限定地通过离心或过滤由培养 液分离细胞，根据需要破碎细胞，通过如硫酸铵这样的盐使上清液或滤液 的蛋白质性成分沉淀，接着进行各种色谱步骤，例如进行离子交换色谱、 亲和色谱等。

根据需要，如果在编码本发明的蛋白质的DNA的上游连接用于分泌 的微生物用或动物用的适当的信号序列，则可使该蛋白质分泌表达到培养 基中。改变为这样的分泌型的DNA，在容易纯化分泌于培养基中的该蛋白 质的方面是有用的。作为该信号序列的例子，可举出大肠杆菌的情况下的 pelB信号(S.P.Lei等，J.Bacteriology,169:4379-4383,1987)、酵母的情况 下的α因子信号(A.J.Brake,Yeast Genetic Engineering,p269 Butterworth, 1989)、动物细胞的情况下的免疫球蛋白的信号SG-1(H.Maeda等、Hum. Antibod.Hybridomas,2:124-134,1991)、C25的信号(WO94/20632)等。

脂加氧酶活性的测定可用通常使用的方法进行。可使用例如：使本发 明的9位脂加氧酶作用于α-亚麻酸、亚油酸等底物，基于来自于作为酶反 应生成物的氢过氧化物的生成的234nm的吸光度的增加、来自于分子状氧 的消耗的反应液中的溶存氧的减少，直接用HPLC检测氢过氧化物的方法 等。进而，对于脂加氧酶的9位生成物特异性，如文献所记载的那样 (Yamamoto等，Lipids,15,1-5,1980)，例如可通过使用硅胶柱的正相HPLC 等来检测。

本发明的蛋白质，例如作为用于在各种的亚油酸、亚麻酸衍生物等的 合成中利用的试剂可以是有用的。具体地说，本蛋白质作为由亚油酸和/ 或亚麻酸酶合成作为植物生长调节剂有用的α-酮醇不饱和脂肪酸、优选为 KODA时使用的酶是有用的。另外，考虑通过将本发明的基因导入植物体 中，可控制通过存在于植物体内的亚油酸和/或亚麻酸的9位生成物特异性 脂加氧酶进行的代谢。

以下，通过实施例更具体地说明本发明。但是，本发明的技术的范围 不受这些实施例等限定。

实施例

实施例1：KODA高生产稀脉萍株的筛选

准备从各种场所采集的62种稀脉萍，在稀释为1/2倍的Hunter培养 基中，在来自于24～25℃的日光色荧光灯的连续的光照射的下进行传代培 养。稀释为1/2倍的Hunter培养基含有以下的成分：

使用KOH(50％)调整至pH值6.2～6.5。

将增殖的稀脉萍在滤纸上展开，放置2小时后，在水中浸渍1小时。 将该水用高速液相色谱(HPLC；柱:TYPE UG120 5μm SIZE 4.6mm I.D× 250mm；保护过滤器:INERTSTL 4.6mm×50mm；洗脱液:50%乙腈+0.1% 三氟乙酸；条件:吸光度的波长210λ(nm)，流速1.ml/分钟，柱温度40℃) 分析KODA的浓度。全部的稀脉萍株的KODA生产量平均为4.97μM。 其中，稀脉萍SH株生产60.2μM的KODA，多达全部株的平均KODA 生产量的约12倍，实现了极高的生产量(图1)。

实施例2：来自于稀脉萍株的脂加氧酶的克隆化及其活性测定

由稀脉萍SH株及稀脉萍441株使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN) 提取总RNA后，以稀脉萍的各个株的总RNA 1.8μg作为模板通过 LongRange 2Step RT-PCR Kit(QIAGEN)来合成cDNA。

其后，以cDNA作为模板，使用下述简并引物(LpDPf、LpDPr)进行 简并PCR(PCR条件：初始变性94℃ 3分钟；将94℃ 0.5分钟、47℃ 0.5 分钟、72℃ 1.3分钟的循环进行39次)，得到作为目标的9-脂加氧酶的部 分序列。

LpDPf：5’-GCITGGMGIACIGAYGARGARTTY-3’(序列号7)

LpDPr:5’-GCRTAIGGRTAYTGICCRAARTT-3’(序列号8)

在这里，I表示肌苷。

该简并引物，是在用于稀脉萍脂加氧酶基因(cDNA)克隆化的引物设计 中，从对于已经被克隆化的来自于植物的脂加氧酶(大豆、马铃薯、西红柿、 大麦、稻)的氨基酸序列同一性高的区域设计的。

由SH株得到了1种序列的相当于脂加氧酶cDNA中央部的约1.0kb 的产物，由441株得到了2种序列的相当于脂加氧酶cDNA中央部的约 1.0kb的产物，进行碱基序列的确定。以得到的序列信息为基础进行BLAST 检索，结果这3种序列相对于多种已知的来自于植物的LOX显示出高的 同源性(Corylus avellana(欧洲榛)75%、Actinidia deliciosa(美味猕猴 桃)74%、Solanum tuberosum(马铃薯)75%、Oryza sativa(稻)76%、 Nicotiana tabacum(烟草)74%、Cucumis sativus(黄瓜)75%、Arabidopsis  thaliana(拟南芥)73%等)。

以该序列信息为基础设计以下的3’RACE及5’RACE法(cDNA末端快 速扩增，Rapid Amplification of cDNA end)用的引物。

3’-RACE用引物

SH-3’-TP:5’-AGCTCTTCATCTTGGACC-3’(序列号9)

441-1-3’-TP:5’-AAGCTTCTTCATCCCCACTTCC-3’(序列号10)

441-2-3’-TP:5’-AAGCTCCTTCATCCCCACTTCC-3’(序列号11)

5’-RACE用引物

SH-5’-TP:5’-TTTCATCCTTCTTGTCGC-3’(序列号12)

441-1-5’-TP:5’-GCTTGTATATTGGGTGCAC-3’(序列号13)

441-2-5’-TP:5’-AAGCAGTAACACGGTTCTGGAGG-3’(序列号 14)

3’-RACE

以上述实验中得到的SH株、441株的总RNA 2μg作为模板，使用 CapFishing^TM target full-length cDNA cloning Kit(Seegene)来合成cDNA。 以该cDNA作为模板溶液，试剂盒内接头引物(3’-RACE引物)与SH-3’-TP、 441-1-3’-TP或441-2-3’-TP分别进行PCR。

5’-RACE

以上述实验中得到的SH株、441株的总RNA 2μg作为模板，使用 CapFishing^TM target full-length cDNA cloning Kit(Seegene)来合成cDNA。 将该cDNA作为模板溶液，试剂盒内接头引物(5’-RACE引物)与SH-5’-TP、 441-1-5’-TP或441-2-5’-TP分别进行PCR。

确定各个产物的碱基序列，使用适当的限制性酶位点连接成1根，获 得cDNA全长，亚克隆在pTAC-2载体(BioDynamics)中。

将由稀脉萍SH株得到的脂加氧酶命名为SHLpLOX，将由稀脉萍441 株得到的脂加氧酶命名为441LpLOX1及441LpLOX2。

对于来自于稀脉萍441株及SH株的3种新的LOXcDNA，使用在5’ 侧添加了NcoI、在3’侧添加了NtoI切割部位的引物，通过PCR获得包含 起始密码子至终止密码子的翻译区全长的DNA片段，插入市售的表达载 体pET23d(Novagen)的NcoI/NotI位点，得到稀脉萍脂加氧酶表达用质粒 pET23d/SHLpLOX、pET23d/441LpLOX1及pET23d/441LpLOX2。将这 些质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。接着，在含有100mg/l 的氨苄青霉素的LB培养基5ml中接菌，在37℃进行一夜振荡培养。对含 有同浓度的氨苄青霉素的LB培养基10ml添加100μl该培养液，在37℃ 进行5小时振荡培养。通过离心分离由该培养液回收菌体，移至含有0.1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(和光纯药)、100mg/l的氨苄青霉素的TB 培养基中，在15℃培养40小时，进行脂加氧酶的诱导表达。培养结束后， 通过离心分离收集菌体(湿重0.4g)，以10ml的BugBuster^TM(Novagen)溶解 菌体。其后进行离心分离(9,000转/分钟，5分钟，4℃)回收上清(10ml)，制 成酶液。

作为9位特异性的对照酶液，使用如下获得的酶液：将作为来自于稻 胚芽的9位特异性的脂加氧酶的r9-LOX1插入pET23d的NcoI/NotI位点， 将所得的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，由所得的转化体与上述同样地表 达、提取脂加氧酶而得的酶液。

进行SHLpLOX、441LpLOX1、441LpLOX2及作为对照使用的 r9-LOX1的酶液中的脂加氧酶的活性测定。将5mM的α-亚麻酸水溶液(含 0.05％的TwEEN 80)25μl、0.2M的磷酸Na缓冲液(pH值7.0)10μl、蒸馏 水5μl装入1.5ml容量的管中，在该管中加入上述酶液10μl反应30分钟。 反应结束后，将反应液供于HPLC(反相系；柱：カプセルパツクC-18 UG120(4.6×250mm，资生堂)、柱温度：40℃，移动相：50％的乙腈(0.02％ TFA)，流速1ml/分钟，检测：210nm)，检查生成的亚麻酸氢过氧化物的 部位特异性及生成量。将该HPLC的结果示于图5A-D。如HPLC图所示， 分别对于SHLpLOX、441LpLOX1、441LpLOX2确认了亚麻酸-9-氢过氧 化物的峰(21.1分钟)，可知具有9位生成物特异性脂加氧酶活性。

将HPLC的结果对于亚麻酸-9-氢过氧化物的生成量进行比较。将该比 较的结果示于图6。明确了由稀脉萍SH株得到的新的LOX(SHLpLOX) 及由稀脉萍441株得到的新的LOX(441LpLOX1)是活性远远高于已知的9 位生成物特异性脂加氧酶中活性较强的r9-LOX1的9位生成物特异性脂加 氧酶。

对在这些来自于稀脉萍的新的LOX的中，亚麻酸-9-氢过氧化物的生 成量最高的SHLpLOX进行动力学分析。使用40mM磷酸缓冲液(pH值 6.0)、0.1％Tween80的反应液，反应温度在25℃下进行。作为底物的α- 亚麻酸以10～100μM的底物浓度进行试验。将反应液100μl加入比色杯 中，使用SmartSpec PLUS分光光度计(Bio-Rad)，对234nm的吸光度，以 15秒的间隔经时地进行10分钟扫描。由测定的A₂₃₄算出反应产物的量(E ＝25,000)。动力学参数使用Hanes-Woolf作图([S]/V Versus[S]作图)来确 定。其结果如表1所示，在SHLpLOX中，作为与底物的亲和性参数的 K_m值比r9-LOX1低，显示SHLpLOX与作为底物的α-亚麻酸的亲和性高。 另外，最大反应速度V_max，r9-LOX1和SHLpLOX为大致相同程度，但 作为每单位时间的反应次数的K_cat值，SHLpLOX比r9-LOX1高。成为酶 活性的指标的K_cat/K_m值，SHLpLOX为r9-LOX1的约1.6倍。由此可明 确，来自于稀脉萍SH株的新的9-LOX是非常高活性的9-LOX。

表1 SHLpLOX和r9-LOX1的动力学参数