结合蛋白质和肽的特异性吸附剂及使用所述吸附剂的分离方法

摘要

一种吸附剂，包括固体支承材料，所述固体支承材料的表面包括具有其氢原子可被取代的吡啶环的第一残基和具有羧基的第二残基。

说明书

发明领域

本专利申请涉及生物分子的分离技术领域，尤其涉及生物色谱。

发明背景

用于生物分子的色谱介质传统地已按照一种或多种下列与样品相互作用的可能模式归类：

-疏水性相互作用(反相)

-亲水性相互作用(正相)

-阳离子交换

-阴离子交换

-尺寸排阻

-金属离子螯合。

技术发酵工艺在效价方面的持续改进导致对简单、成本有效和高选择性的下游纯化技术需求的增长，该纯化技术能够处理大的蛋白容量而不会提高同样因素下所需的液体体积。由此对给定分离问题传统地逐步应用以上色谱类别，这反映在产物纯度的逐步稳定提高中，但也反映在每个阶段产物损失(最终严重累积)中，更别提操作时间和商品成本。向下游工艺早期引入亲合色谱是该需求的解决方案，因为多次证实将一系列连续的顺序色谱步骤由此减少到仅一步。亲合色谱有时被视为单独一类，但从化学角度看，它是基于如上同样的相互作用模式，并且通常基于两种或更多种模式的组合。亲合色谱的原理特性在于其对预定分析物的高度特异性，所述分析物通常基于已知的具有生物学意义的分子识别对如抗原-抗体、碳水化合物-凝集素、荷尔蒙-受体，或在互补核酸链之间。因此大多数亲合吸附剂由终端使用者根据它的特定分离任务进行定制。为生产全功能吸附剂，通过选择仅有的几种对本身可商购的支承材料的标准生物缀合技术将生物亲合残基直接或经由任选的在该残基转录和旋转运动中允许更多自由度的链(tether)偶联。这种吸附剂的保质期通常较短，往往不得不根据需要制备。

此外，已发现合成亲合配体如短链或环状合成肽或类肽，以及某些反应性染料(主要是三嗪染料)与生物分子基团特异性地相互作用。后者是廉价并且容易制备的低分子量的残基，所述残基没有在生物聚合物的三级结构中不稳定和变化的缺点。而且，由于它们小的分子尺寸和可调、强的活化化学性质，即使没有长的栓链(tethering)，它们仍可以高效地定向固定到固体载体上，然而生物聚合物在相同条件下往往在固定化之后会因未折叠、空间位阻或随机取向而缺少活性。任一种情况下，主动参与识别过程的吸附剂组分通常仅存在于支承固体的表面上(往往作为表面结合的单层)。

除了均相固体支承材料以外，现有技术熟知根据其表面覆有交联聚合物薄膜的本体固体支承材料的通用设计由2层截面形态组成的吸附剂。过去已主要使用如重度(辐射)交联的聚丁二烯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯和聚酰胺之类的聚合物。它们已主要用于形成保护周围介质以免与固体支承材料的基本部分(“载体”)发生不需要的相互作用的致密界面。这种相互作用可能导致生物分子非特异性地或甚至不可逆地结合吸附剂，而另一方面，固体支承材料的成分或其与残基的化学键合可能被样品或洗脱液的活泼组分所腐蚀。涂有聚合物的吸附剂对于如上所列的所有色谱类别的应用都基本已知，尤其对于疏水性相互作用和尺寸排阻。还已知没有内部交联而是作为直链或支链接枝到支承材料上的聚合物涂覆剂如所谓的触手树脂。

另一方面，亲合色谱已主要用本体凝胶相树脂实施。卓越的凝胶形成材料是中度交联的多聚糖、聚丙烯酰胺和聚(环氧乙烷)。这种水凝胶因其柔软度(构象柔性、弹性模量)、大孔体系、高极性和高水含量以及不存在反应性或变性化学基团而确保能恰好容纳活性残基和与其相互作用的生物分析物的生物相容性界面。它们能够截留天然态的蛋白质，即保持它们准确折叠的三维结构、缔合态和功能整体性。这主要是因为可以避免往往用来从强烈吸附的疏水性介质洗脱蛋白质或肽的有机溶剂。载体缺少的固有吸附强度由此通过引入高特异性的完整生物配体作为恰好容纳在水凝胶内的用于分离的结合体而得到弥补。但是，这些介质的耐机械性比无机支承材料弱很多，因为它们在所施加的压力下可压缩并且不耐受因搅拌、柱填装或高的液体流速所致的剪切应力。与严格的HPLC工艺条件完全相适应的亲合吸附剂因此鲜见。

仅在不久的过去已认识到固定相的耐机械性是吸附剂载体的本体性质，而仅有固定相与移动相之间的界面处的薄层影响传质和与生物分析物的相互作用。因此已提到结合机械上非常具有刚性且维度上稳定的多孔三维芯和携有活性残基用以结合分析物的生物相容性凝胶状界面层的功能的概念，并且相关的合成问题已在技术上解决。这种杂合材料在低极性的无机氧化物或致密交联的聚合物的基础上应用高极性的松散交联的聚合物。

就方法而言，它们可以通过将高极性聚合物施用到芯材料上或通过使极性单体、其前体或预聚物在芯材料和交联剂的存在下直接聚合来制备。根据后一方法制备的大多数材料在文献中被描述为具有非孔渗透或孔填充形态。尽管非渗透膜可用于与分析物相互作用的表面积受限，并且因此仅依赖于聚合物膜厚度的结合能力低，但是孔填充膜在与分析物相互作用中利用芯材料的全部内孔体积，这通常导致好的结合能力，但是孔内部的扩散传质速率和与移动相的交换动力学慢。覆盖但不是完全填充芯材料内表面的聚合物膜在此方面有益。该整类吸附剂中最好的已知代表是由接枝到多孔二氧化硅支承芯材料上的支化且任选进一步交联的聚乙烯亚胺组成的体系。已证实这种吸附剂可以进一步衍生化，但它们商业化仅用于离子交换和那些仅需要小标准残基的基团特异性的亲合应用。

概念上不同的合成亲合介质的生产方法是所谓的分子印迹技术，其基于目标底物与在聚合反应过程中形成的聚合物空穴之间的形状和官能团互补性，所述聚合反应在目标底物和致孔剂的存在下进行，必须随后除去致孔剂。就目标底物的暂时固定而言，印迹已经发展用于大多底物包括蛋白质和肽，并且可以分为共价和非共价的方法。但是，它限于一些高交联类型的聚合物作为固体支承材料的形成，并且一旦达到生产规模，迄今为止就没有得到广泛的接受度，尤其对于在监管机构控制下的药用蛋白质或肽更是没有。

最广泛用于免疫球蛋白G(IgG)纯化的亲合介质是载体结合的蛋白质A或G以及蛋白质L，蛋白质A或G二者是在葡萄球菌(Staphylococci)的细胞壁上天然生成的，但是对于大规模应用所有都要求相当高的资本投入，这根本性地阻碍它们作为一次性产品的用途。已知蛋白质A结合在抗体的恒定Fc段上的特定抗原决定部位。因此它在重组抗体片段或缺少该区域的融合产物的纯化中具有有限用途。另一方面，源于蛋白质的吸附剂的重复使用与蛋白质的二级/三级结构和/或化学键合对于苛刻的生产条件不稳定的缺点有关，导致尤其在色谱运行之间必须的强碱性卫生处理过程中可能发生失活或渗漏。除了因此减少寿命之外，关于蛋白质A吸附剂在药物生产中的应用正存在争议，因为在待纯化的产物用于体内药用时即使微量的渗漏蛋白质A都被怀疑引起人类的免疫紊乱。因此，强制性产品的注册审批和期待的市场授权是决定技术纯化工艺的其它重要因素，因此蛋白质A色谱必须随后进行额外的色谱步骤以除去渗漏的毒素已成为工业标准。

除了尝试形成这些蛋白质具有改进技术性质的工程化变体之外，还有结果是生产一些仅具有非常短(非天然)的肽抗原决定部位或甚至具有完全合成残基的吸附剂。那些用作蛋白质A/G/L替代物的可商购合成介质最近在Journal of Chromatography B，第848卷，2007年第一期中已有综述。

背景技术

早期已认识到吡啶环和羧基以及它们通过质子化-去质子平衡的可离子化形式(典型研究用于式I和II原型结构)用作生物色谱吸附剂的残基，但该认识都是独立的，并没有主张它们联用的益处。然而，就弱阳离子交换剂而言，发现包括羧基的残基例子比包括吡啶环的残基更常见于科学和专利文献中。将羧基引入吸附剂的显著方式是在存在或不存在额外的连接部分下，将酰胺键与天然氨基酸天门冬氨酸或谷氨酸或其保护形式偶联。使用这两种氨基酸，通过固相合成技术偶联到载体上的两种选择方案是可行的：在氨基处通过酰胺形成偶联，得到仍包含两个可分离羧基的结构，或替代地在这两个羧基的任一个处通过酰胺形成偶联，得到仍包含可质子化的氨基和一个可分离羧基的结构。所有这些不同的可能方案都已通过实验实现。下面提供三处代表性的现有技术。

在国际专利申请WO 00/69872(Promega Corporation)中，提供pH依赖型离子交换基质、这种基质的制备方法和使用这种基质分离目标核酸如来自污染物包括蛋白质、脂质、细胞碎片的质粒DNA、染色体DNA或RNA或其它核酸的方法。该发明的每种pH依赖型离子交换基质包含至少两个不同的离子交换官能团，一个能够在第一pH下充当阴离子交换剂，另一个能够在第二更高的pH下充当阳离子交换剂。该基质在第一和第二pH之间的pH范围具有整体中性电荷。该发明的pH依赖型离子交换基质设计为在基质的总电荷为正的pH下结合目标核酸，并且随着周围溶液的pH升高而释放目标核酸。

国际专利申请WO 98/08603(Upfront Chromatography A/S)涉及从包含免疫球蛋白的溶液如杂交瘤细胞培养上清液、动物血浆或血清或初乳中分离或纯化免疫球蛋白的方法。该方法包括在结合过程中使用最少的盐如溶致盐，并且优选还在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。固相基质，优选表氯醇活化的琼脂糖基质被可包括酸性取代基如羧酸的单环-或双环芳族或杂芳族配体(分子量：至多500道尔顿)官能化。

德国专利申请DE 102008012224(Lanxess Deutschland GmbH)涉及单分散凝胶状或大孔氨甲基吡啶树脂、其制备方法及其用途，尤其在湿法冶金和电镀中的用途，所述树脂基于至少一种单乙烯基芳族化合物和至少一种聚乙烯基芳族化合物和/或(甲基)丙烯酰基芳族化合物，其可包含任选取代的吡啶甲基自由基的结构中包含叔氮原子作为官能团。

据我们所知，在上述专利申请的任一篇以及专利或科学文献的任一现有技术中都还没有尝试制备根据本发明的吸附剂，其包含异烟酰胺和琥珀单酰胺的组合作为分别含吡啶环或羧基的残基原型，无论是否包含在相同或不同的残基内。仅在载体不完全衍生化的情况下，才不得不考虑载体(或相应的封端衍生物)的残基可及官能团可能充当次于如吡啶环结构的另一残基。但是，这些官能团在化学上通常是简单的结构部分，因此仅不得不考虑为第二残基。即使在审查每次呈现每单个残基其中之一的吸附剂的出版物中，也没有暗示在同一吸附剂中联用这两种残基的优点。而且，仅非常少的具有任一类型残基的吸附剂构造成2组分成层复合支承材料。相反，残基大多数直接或通过低分子量的连接部分固定化在本体载体材料上。

发明目的

本发明的一个目的是提供用于蛋白质和肽的新纯化方法以及用于实施所述方法的吸附剂。

发明内容

本发明涉及包括固体支承材料的吸附剂，所述支承材料的表面包含至少两种不同的残基，其中第一残基包含其氢原子可以被取代的吡啶环，第二残基包含羧基。任选地，这些至少两种残基由覆盖所述表面的聚合物膜负载。由于所述吸附剂来自完全合成源，其特征在于高的物理(特别是热)和化学坚固性，但仍允许生物分子在温和的生理学条件下甚至从不利的样品基质特异性分离。还提供制备这种吸附剂的替代方法。

本发明还提供用于从含蛋白质或肽的混合物中分离蛋白质或肽，或增加它们的浓度和/或纯度的方法。所述方法包括使所述混合物与上结合有所期望的蛋白质或肽的根据本发明的吸附剂接触，随后从吸附剂上洗脱所述蛋白质或肽，并任选中间冲洗步骤。

还公开其中所述吸附剂和/或方法可有益用于的各种分析和制备的生化与医学应用领域。根据所述方法纯化的抗体的特征在于回收率、纯度和生物学活性与通过常规生物亲合分离技术获得的那些相当，而且不具有这类技术的缺陷。

下面公开本发明的某些具体实施方案，而且各个实施方案的特性特征的组合也是可想象得到的，并因此在本发明的范围内。

根据一般方面，根据本发明的吸附剂包括固体支承材料，所述支承材料的表面包括含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基和含羧基(-COOH)的第二残基。

在一个实施方案中，第一和第二残基彼此没有直接连接，而是分别结合到本体固体支承材料本身上或由其作为载体支承的聚合物膜上。在该实施方案中，吡啶环和羧基没有通过一个且相同的官能团连接到支承材料的表面上。

一方面，本发明涉及包括固体支承材料的吸附剂，所述支承材料的表面包括第一残基、含羧基(-COOH)的第二残基和至少两个彼此可以相同或可以不同的官能团，所述第一残基包含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)，并且所述第一残基和第二残基经由所述至少两个官能团连接到支承材料表面上，其中第一残基和第二残基没有通过一个且相同的官能团连接到支承材料的表面上。

在一个实施方案中，所述吸附剂的固体支承材料包括其表面覆有包含第一和第二官能团的聚合物膜的载体，所述第一和第二官能团彼此可以相同或可以不同，并又负载所述第一和第二、任选第三和第四残基。

在一个实施方案中，所述第一和/或第二残基包含连接部分。

在一个实施方案中，所述第一和/或第二残基包含长度为1至20个原子的共价、构象柔性的连接部分。

在一个实施方案中，所述共价、构象柔性的连接部分不含硫。

在一个实施方案中，所述连接部分彼此独立地包含20至300个碳原子。在所述实施方案中，所述连接部分包含聚乙二醇部分或由其组成。

在一个实施方案中，其它取代基结合到吡啶环上。

在一个实施方案中，所述其它取代基不包含阴离子交换(即带正电)基团。

在一个实施方案中，第一残基是吡啶-4-酰胺残基(异烟酰胺残基)，所述残基优选经由其酰胺基结合到固体支承材料的表面上。

在一个实施方案中，第二残基是3-酰胺丙酸残基(琥珀单酰胺残基)，所述残基优选经由其酰胺基结合到固体支承材料的表面上。

在一个实施方案中，第一残基是吡啶-4-酰胺残基(异烟酰胺残基)，第二残基是3-酰胺丙酸残基(琥珀单酰胺残基)，这两个残基优选经由其酰胺基结合到固体支承材料的表面上。

在一个实施方案中，吡啶-4-酰胺残基和/或3-酰胺丙酸残基(残基芯)的一个或多个氢原子被取代基取代。

在一个实施方案中，所述取代基不包含疏水基团。

在一个实施方案中，所述第一和第二残基以1∶1至2∶1的摩尔比，优选以约3∶2的比存在。

在一个实施方案中，所述第一残基包括第二残基。

在一个实施方案中，所述固体支承材料的表面另外包含第三残基和任选第四残基。

在一个实施方案中，所述第三残基包含胺或酰胺结构，优选伯胺结构。

在一个实施方案中，第一残基以基于吸附剂表面上所存在的所有残基的总摩尔量在20％和50％之间的摩尔比存在。

在一个实施方案中，第二残基以基于吸附剂表面上所存在的所有残基的总摩尔量为在20％和40％之间的摩尔比存在。

在一个实施方案中，第一和第二残基以基于吸附剂表面上所存在的所有残基的总摩尔量在20％和50％之间的第一残基和在20％和40％之间的第二残基的摩尔比存在。

在一个实施方案中，第一、第二和第三残基以约35∶25∶40的摩尔比存在。

在另一实施方案中，第一和第二残基以基于吸附剂表面上所存在的所有残基的总摩尔量为40％至55％的第一残基和45％至60％的第二残基的摩尔比存在。

在一个实施方案中，所有残基的总密度合计为0.1mol·dm^-3至1.0mol·dm^-3，优选至少为约0.3mol·dm^-3。

在一个实施方案中，每种残基类型均匀和随机(统计学上)地分布在固体支承材料的表面上。

在一个实施方案中，所述固体支承材料由其表面覆有聚合物膜的载体构成，所述聚合物膜具有至少部分被第一和第二、任选第三和第四残基取代的官能团。

在一个实施方案中，所述聚合物由彼此共价交联但没有共价接枝或结合到所述载体表面的各个链构成。

在一个实施方案中，所述聚合物链以基于可用于交联的官能团数量的2％至20％的范围彼此共价交联。

在一个实施方案中，所述聚合物由共价接枝到所述载体表面但没有彼此共价交联的各个链构成。

在一个实施方案中，所述聚合物链经由其端官能团共价接枝到所述载体表面上。

在一个实施方案中，所述聚合物膜占所述吸附剂总重量的5％至30％，优选15％至20％。

在一个实施方案中，所述聚合物在水性介质或水性-有机的混合介质中可溶胀。

在一个实施方案中，所述聚合物是合成的聚电解质。

在一个实施方案中，所述聚合物的交联或接枝连接和/或残基的键合由酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲/叔胺键构成。

在一个实施方案中，所述聚合物是部分衍生化的聚合物，选自聚乙烯醇、聚乙烯胺、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸或包括至少一种这些聚合物的任意共聚物或共混聚合物。

在一个实施方案中，所述聚合物是聚乙烯胺。

在一个实施方案中，所述固体支承材料或至少所述载体是多孔材料，其孔尺寸为10nm至400nm，或其比表面积为1m²g^-1至1000m²g^-1，或其孔隙率为30体积％至80体积％。

在一个实施方案中，所述固体支承材料是颗粒尺寸为5μm至500μm的微粒材料。

在一个实施方案中，所述固体支承材料是板状或纤维状材料如膜。

在一个实施方案中，所述载体的制成材料不同于所述聚合物膜的制成材料。

在一个实施方案中，所述固体支承材料或至少所述载体由选自常规或表面改性的聚苯乙烯、聚苯乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、二氧化硅、玻璃、淀粉、纤维素、琼脂糖、琼脂糖凝胶和葡聚糖或其复合材料的材料制成。

在一个实施方案中，所述吸附剂还包括可易于检测的标记物如吸光、发光、放射性、磁性或质量-或射频-编码的标记物。

本发明还涉及用于制备吸附剂的方法，包括：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)将所述聚合物的膜吸附到载体表面上；

(iii)使所吸附的聚合物的所述官能团的限定部分与至少一种交联剂交联；

(iv)用含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基和含羧基(-COOH)的第二残基以及任选的其它残基使交联聚合物的所述官能团的其它限定部分衍生化。

本发明还涉及用于制备吸附剂的方法，包括：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)用含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基和包括含羧基(-COOH)的单核杂芳环结构的第二残基以及任选的其它残基使所述官能团的限定部分衍生化；

(iii)将所述衍生化的聚合物的膜吸附到载体表面上；

(iv)使所吸附的聚合物的所述官能团的其它限定部分与至少一种交联剂交联。

本发明还涉及用于制备吸附剂的方法，包括：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)将所述聚合物的膜吸附到载体表面上；

(iii)使所吸附的聚合物的所述官能团的限定部分接枝到所述载体上；

(iv)用含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基和含羧基(-COOH)的第二残基以及任选的其它残基使接枝聚合物的所述官能团的其它限定部分衍生化。

本发明还涉及用于制备吸附剂的方法，包括：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)用含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基和含羧基(-COOH)的第二残基以及任选的其它残基使所述官能团的限定部分衍生化；

(iii)将所述衍生化的聚合物的膜吸附到载体表面上；

(iv)使所吸附的聚合物的所述官能团的其它限定部分接枝到所述载体上。

在一个用于制备吸附剂的方法实施方案中，所述聚合物可溶于水性介质或水性-有机混合介质中。

在一个实施方案中，所述聚合物的官能团是-NH-、-NH₂、-OH、-COOH或-COO-基团。

在一个实施方案中，所述聚合物的分子量在5000道尔顿和50000道尔顿之间。

在一个实施方案中，所述至少一种交联剂选自二元羧酸、二胺、二醇和双环氧基化合物。

在一个实施方案中，所述至少一种交联剂是长度在1和20个原子之间的线性构象柔性的分子。

在一个实施方案中，所述衍生化步骤通过在所述官能团与所述残基之间形成酰胺键进行。

在一个实施方案中，所述衍生化步骤用每种残基逐步进行。

本发明还涉及用于从含所述蛋白质或肽的混合物中分离所述蛋白质或肽，或增加它们的浓度和/或纯度的方法，包括：

(i)使溶解或悬浮在第一液体中的所述混合物与根据本发明的吸附剂或根据本发明的方法制备的吸附剂接触，并持续足以使所述蛋白质或肽能够结合到所述吸附剂上的时间；

(ii)任选用第二液体冲洗所述吸附剂；

(iii)使具有所述结合的蛋白质或肽的所述吸附剂与第三液体接触，并持续足以使所述蛋白质或肽能够从所述吸附剂释放的时间；

(iv)任选用第四和/第五液体洗涤和/或再生所述吸附剂。

在一个分离蛋白质或肽，或增加它们的浓度和/或纯度的方法实施方案中，所述第一液体、第二液体和第三液体是不包含其它有机改性剂的水性缓冲介质。

在一个实施方案中，第二液体与第一液体相同。

在一个实施方案中，第三液体的pH接近于所结合的蛋白质或肽的等电子点pI。

在一个实施方案中，第三液体的pH与第一和任选第二液体的pH不同，尤其是高于第一和任选第二液体的pH。

在一个实施方案中，第一液体的pH在4.0至6.0的范围内，第三液体的pH在6.5至8.5的范围内。

在一个实施方案中，第三液体的离子强度与第一和任选第二液体的离子强度不同，尤其是高于第一和任选第二液体的离子强度。

在一个实施方案中，所述方法作为膜-过滤技术、固相萃取技术或中压至高压液相色谱技术进行。

在一个实施方案中，所述方法还包括在步骤(iii)之后从第三液体中分离所释放的蛋白质或肽。

在一个实施方案中，步骤(iii)所释放的蛋白质或肽包含低于10ppm浸出的吸附剂或其它可从中浸出的物质。

在一个实施方案中，所述方法与其它分离工艺如沉淀、离心、干燥、微-/超-滤、渗析、离子交换或病毒灭活处理组合。

在一个实施方案中，所述蛋白质或肽的等电点PI为从4.5到8.5，分子量为从100Da到500000Da。

在一个实施方案中，所述蛋白质或肽是天然抗体，特别是免疫球蛋白G、来源于抗体的片段或寡聚缔合物、遗传工程抗体或含抗体或抗体片段的融合蛋白质。

在一个实施方案中，包含所述蛋白质或肽的混合物是从微生物或细胞培养物或从作物提取物获得的生物合成粗产物或部分纯化的生物合成产物。

本发明还涉及用于液相色谱或固相萃取的柱，其包括根据本发明的吸附剂或根据本发明方法制备的吸附剂作为管状容器内的固定相和任选其它组分如玻璃料、过滤板、流量分配器、密封件、配件、螺钉、阀或其它流体处理或连接元件。

在一个实施方案中，所述柱的特征还在于其耐受高达20巴的施加压力、高达110℃的施加热以及普通消毒规程的物理和化学稳定性，因此使得其能够反复使用高达1000次，优选高达5000次。

本发明还涉及多种相同或不同的根据本发明的吸附剂或根据本发明方法制备的吸附剂的集合，或根据本发明的柱呈微孔板或微芯片阵列，或多微毛细管或微流体装置的集合，从而能够并行处理。

本发明还涉及诊断试剂盒或实验室纯化试剂盒，其包括根据本发明的吸附剂、或根据本发明方法制备的吸附剂、或根据本发明的柱、或根据本发明的吸附剂或柱的集合，以及在同一封装单元内用于实施根据本发明分离蛋白质或肽的方法或与其不同的分析、诊断或实验室方法所必需的其它化学或生物试剂和/或一次性物品。

本发明还涉及根据本发明的吸附剂或根据本发明方法制备的吸附剂在制备包含至少一种具有诊断、治疗、营养或化妆价值的蛋白质或肽的药物、营养品或化妆品组合物中的用途。

本发明还涉及根据本发明的吸附剂或根据本发明方法制备的吸附剂在除去至少一种蛋白质或肽中，以及在医学预防或治疗人类或动物因所述至少一种蛋白质或肽的存在所引起的疾病中的用途。

本发明还涉及根据本发明的吸附剂或根据本发明方法制备的吸附剂在标识、表征、量化或实验室纯化至少一种蛋白质或肽中的用途。

本发明还涉及根据本发明的吸附剂或根据本发明方法制备的吸附剂用于可逆固定化至少一种蛋白质或肽并任选测试其它化学或生物结构结合所述蛋白质或肽的用途。

根据第一方面，本发明涉及包括固体支承材料的吸附剂，所述支承材料的表面包括

-含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基；和

-含羧基(-COOH)的第二残基；

其特征在于第一和第二残基彼此没有直接连接，而是分别结合到本体固体支承材料本身上或由其作为载体支承的聚合物膜上。

根据第二方面，本发明涉及包括固体支承材料的吸附剂，所述支承材料的表面包括

-第一和第二官能团，它们可以相同或不同；

-含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基；和

-含羧基(-COOH)的第二残基；

其特征在于第一残基与第一官能团结合，第二残基与第二官能团结合。

根据第三方面，本发明涉及包括固体支承材料的吸附剂，所述支承材料的表面包括

-第一和第二官能团，它们可以相同或不同；

-含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基；和

-含羧基(-COOH)的第二残基；

其特征在于第一残基与第一官能团结合，第二残基与第二官能团结合，其中没有所述官能团既结合所述第一残基又结合所述第二残基。

根据第四方面，本发明涉及包括固体支承材料的吸附剂，所述支承材料的表面包括

-第一和第二官能团，它们可以相同或不同；

-含其氢原子可以被取代的吡啶环(-C₅H₄N)的第一残基；和

-含羧基(-COOH)的第二残基；

其特征在于第一残基与第一官能团结合，第二残基与第二官能团结合，其中第一和第二残基彼此没有直接连接。

在一个实施方案中，第一残基、或第二残基、或第一和第二残基经由连接部分结合所述第一和第二官能团。

在一个实施方案中，5至95％、或20至90％、或30至80％、或40至70％、或50至60％所述第一和第二官能团结合所述第一残基和第二残基，其中所述第一残基和第二残基以1∶1至2∶1的摩尔比存在。

在一个实施方案中，固体支承材料的表面覆有包含所述第一和第二官能团的聚合物膜，所述第一和第二官能团又负载所述第一和第二、任选第三和第四残基。

在一个实施方案中，所述第一和第二官能团的第一部分与至少一种交联剂交联，其中所述第一和第二官能团的第二部分结合所述第一和第二以及任选其它残基。

就本公开内容而言，如根据本发明一般方面的吸附剂所列的所有实施方案可以与根据本发明第一、第二、第三和第四方面的吸附剂组合。

优选实施方案的详细描述

本发明的根本技术问题可以描述为提供用于蛋白质和肽的纯化新方法，所述方法不存在如前面部分已概述的先前已知方法的缺点。这意味着本方法应该允许以高回收率在单个步骤中从样品基质中分离靶蛋白质或肽而不损害其功能整体性，同时主要避免昂贵的材料但仍足够通用以致能够遵守在用设备的标准清洗和卫生规程，并因此确保本方法能被各个监管机构所接受，即以经济可行的方式提供药用品质的靶蛋白质或肽。

该技术问题现在通过提供要用在待纯化蛋白质或肽的固-液平衡分配工艺中的新型吸附剂而得以解决，所述吸附剂与现有技术已知的那些的主要区别在于其被残基特异性双重化学衍生化，所述衍生化适合以与常规亲合介质相匹配的选择性和灵敏度从其副产物中分离靶蛋白质或肽，特别是与各种其它蛋白质或肽分离的问题，但具有完全不含可能制备昂贵和/或在严苛条件下分解的复杂细微的生物材料的组合物。吸附剂生产中所用的所有材料高度耐用还确保使用该吸附剂的任何分离方法具有长期再现性，这从分析结果不存在漂移效应可显而易见。

在解决以上给出的技术问题中有帮助的是吸附剂的成层组合体，其包括至少两种不同材料，其中一种是负载两种残基并覆盖作为固体基材的第二材料的合成或生物合成聚合物膜。该特定组合体的特征在于一方面聚合物膜具有相当高的重量含量和高的物理稳定性，而且仍具有相当高度的链柔性，从而导致高的溶解(solvent)和样品摄取能力和快速扩散交换。该膜因此保持在均匀、生物相容性、柔软和凝胶状的状态。这允许分析物蛋白质或肽以其部分或全部分子体积浸没到含吸附剂的负责穿过其或沿其表面结合和迁移并同时防止它们变性的那些活性成分的层内。因此它确保形成用于分析物的准三维相互作用空间，并允许在分布于整个蛋白质或肽表面上的抗原决定部位与残基改性的凝胶相之间多点接触。样品组分由此也被聚合物膜有效保护以免与固体支承材料的基本成分发生不期望的相互作用。

为了评估本发明的整个范围并使其变得更精确，首先在下面的段落中定义本发明下文所用许多术语的意思。必须理解，所有给出的实施例仅用于举例说明，并不表示是排它的一组实施方案。本领域技术人员肯定能想到在不偏离其整体精神下实施本发明的其它和类似方式。图6的示意性表达又符号化本文所用与吸附剂组成有关的许多不同术语之间的相互关系。

术语“吸附剂”表示任何用作样品固液平衡分配过程中的固定相的合成或生物合成材料，其作为所述样品中所含的至少一种给定的靶蛋白质或肽的受体表现出选择性的非共价结合性质，或者其能够在所述样品中所含的不同构成的至少两种给定的靶蛋白质或肽之间区分其非共价结合性质(即高的绝对结合常数或高的结合常数之差)。因此它被特别设计为解决给定的分析或制备检测、分离、固定化或(生物)化学转化任务，这种任务往往由至少一种靶蛋白质或肽的独特组合以及样品基质组成，所述独特组合的组成可以是已知的、部分已知的或未知的，所述样品基质的组成可以类似是已知的、部分已知的或未知的。

与类分相(其根据对整个分析物分子基本平均的累积参数如静电荷、偶极矩或亲油性区分分析物)相比，这种吸附剂至少部分通过基团互补性结合到所述至少一种靶蛋白质或肽的三维分子表面上的至少一个结构域(抗原决定部位)。因此该新概念也超出传统意义上根据两种标准平均效应的组合分离的所谓混合模式吸附剂的范围。本发明的吸附剂因此在分子水平设计为仅结合单一蛋白质或肽或一类结构相近的蛋白质或肽，后者在可能包含大范围不同副产物的环境外具有高的亲合性和高的个体或组群选择性。

作为“固体支承材料”，所有本领域技术人员已知的无孔或优选多孔的吸附介质例如各种无机矿物氧化物如二氧化硅、氧化铝、氧化镁、氧化钛、氧化锆、硅酸镁载体、磁铁矿、沸石、硅酸盐(硅藻土)、云母、羟磷灰石、氟磷灰石、金属-有机骨架、陶瓷和玻璃如可控孔度玻璃(CPG)、金属如铝、硅、铁、钛、铜、银、金以及石墨或无定形碳、纸、(生物)聚合物树脂如多聚糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯如Amberchrom^TM等都可用于构造吸附剂，无论是球形还是不规则形状。聚(苯乙烯-共聚-二乙烯苯)(特别是如用在强阳离子交换树脂中的本体-或表面-磺化的聚(苯乙烯-共聚-二乙烯苯))、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、二氧化硅、玻璃和多聚糖如淀粉、纤维素、纤维素酯、直链淀粉、琼脂糖、琼脂糖凝胶、甘露聚糖、黄原胶和葡聚糖是优选的固体支承材料。最低刚度和硬度的固体基材引入作为不溶性支承功能体为固定相与移动相之间的界面扩大以及特别在流动和/或加压条件下增加机械强度和耐磨性提供基础，所述界面是作为蛋白质或肽在所述相之间分配过程的分子基础而与其相互作用的地方。根据本发明的固体支承材料可以具有均相或非均相组成，因此还混有是上述一种或多种材料的复合材料，尤其是多层复合材料。本文中要特别提到磁性颗粒。

在与之相关的一个重要实施方案中，固体支承材料的表面可以覆有聚合物膜。这种任选的膜被视为固体支承材料的一部分，因为本文中开发和引入的所有制备和分离方法均依靠单一本体固体支承材料的直接表面上的官能团或残基，其同样也与该聚合物覆层的各官能团或残基一起工作。此外，本体固体支承材料所固有的介孔或大孔形态通常在涂覆过程中得到保留。如果在这样得到的混合材料中必须将表面聚合物膜与用于本发明目的的所有下方材料进行区别，则后者单独总称为“载体”，或换言之，混合固体支承材料包括载体和聚合物膜二者。然而，实际上这种区别只有在吸附剂的制备历史已知的情况下才是可行的。作为提供吸附剂刚性框架部分的载体近似于固体物理条件并且可由以上列举的作为固体支承材料的那些材料中的任一种构成，所述材料同样可以根据本发明用作上方不具有表面聚合物膜的本体固体支承材料或用作这种表面聚合物膜的载体。因此，上述所有的特征、选择和限制除了用于聚合物吸附的适用性外等同适用于这两个术语。因此，本发明的中心实施方案是一种吸附剂，其中固体支承材料由载体构成，所述载体表面覆有聚合物膜，上述聚合物具有至少部分被第一和第二以及任选的第三和第四残基取代的官能团。

如果，如优选的那样，使用多孔材料作为载体，则聚合物膜将通常均匀覆盖其外表面和其大部分较大的内表面。因而，“表面”是指吸附剂在其制备和作为分离剂应用期间的整个固液相界面，其中发生通过残基对分析物的识别和结合，并且至少一种溶解的蛋白质或肽可经由(任选加压的)流体动力流、对流、灌注、扩散或电迁移或其任意组合可达此界面。由于包含软物质的载体，特别是表面聚合物膜在合适液体中的可能的溶胀，所以不存在清晰的边界，而是可能涉及中间凝胶相层。吸附剂的表面特性可与所用材料的本体特性不同。特别是在使用两种不同材料作为载体和聚合物膜并且所用的制备方法得到特别大的比表面积时确是如此。

“覆盖”在技术上可通过技术人员已知的所有涂覆技术实现，其可以在自然驱动力下或手动进行，所述涂覆技术为例如自发吸附、气相沉积、液相、气相或等离子体相的聚合、旋涂、表面缩聚、润湿、浸涂、蘸涂、刷涂、喷涂、压印、蒸发、施加电场或压力以及所有基于分子自组装的方法，例如液晶、Langmuir-Blodgett膜或层叠膜形成。聚合物膜可由此直接涂覆为多层或在彼此上方的各个单层的逐步序列。只要涉及大分子，无论是自发的或人工加速的单点或多点“吸附”，在任何情况下均被认为是从聚合物溶液与固体表面物理接触开始的任何涂覆过程的第一(不完全)步骤。需要在固体表面和每一单个聚合物链之间存在部分至少弱吸引物理作用(范德华力)，或在载体和聚合物上存在互补官能团时存在相当特异性的非共价键化学力，并且如果多层被吸附，那么在相同和不同的垂直堆叠层内的聚合物之间也具有上述作用力以形成至少介稳聚集体。相反电荷之间的静电力经常被用于该目的，载体的表面电荷由此被其z电势所赋予。初始吸附可以以松散且不规则的形式发生，该形式可能随后转变成更大程度的二维-三维序列和/或密度。这可以归因于表面上的聚合物链的部分残基的迁移性，所述迁移是因为在单独的表面位点处的吸附和脱附过程之间的稳态平衡所致并且可例如通过退火得到促进。通常有必要通过在邻近的官能团之间随后引入共价键以及通过链的物理缠结的基础空间排列(熵)稳定化来进一步提高所吸附的聚集体的稳定性。为了实现进一步提高的稳定性，聚合物膜的链可进一步共价接枝到下方的载体材料上。

固体支承材料的外表面由此可以是平坦的(板、片、箔、盘、玻片、过滤片、膜、织物或非织物、纸)或弯曲的(凹的或凸的：球、珠、颗粒、(中空)纤维、管、毛细管、小瓶、样品盘的孔)。固体支承材料的内表面的孔结构可特别由规则的、连续的毛细通道或不规则(不规则碎片)几何形状的孔腔构成。在微观上，其可以是光滑或粗糙的，这取决于制造方式。孔体系可连续延伸遍及整个固体支承材料或终止在(分支的)孔腔中。蛋白质或肽在移动相中的溶剂化和在固定相表面上的截留之间的界面平衡的速率以及由此得到的连续流动分离体系的效率主要是通过经由固体支承材料的孔进行扩散的传质以及由此通过其特征性的颗粒和孔径分布所决定的。孔径可任选地表现为不对称、多模态和/或空间(例如在截面上)不均匀的分布。适合在本发明用作全部固体支承材料或载体的多孔固体的典型孔径为10nm至400nm，并且因此可归类为介孔或大孔；颗粒材料的典型颗粒尺寸为5微米至500微米。合适的固体具有30体积％至80体积％的可接受的孔隙率，典型的比表面积为1m²g^-1至1000m²g^-1。

作为替代方案，最近推出的固体支承材料是所谓的整体式色谱介质，其被浇注成具有所需形状(通常棒状)的单个宏观实体，该形状与由松散的微观颗粒制成的常规可压缩柱填料不同。整体柱可以由二氧化硅或聚合物材料例如聚甲基丙烯酸酯构成，其微观结构可以包含纤维状毛细管或烧结颗粒附聚物。

术语“聚合物的膜”或“聚合物膜”是指二维或优选三维的合成或生物合成的具有至少一层的聚合物网络，通常为几个或几十个分子层。这样的(衍生化或非衍生化)聚合物网络本身可根据本领域技术人员已知程序进行制备。该聚合物膜可具有均质化学组成，或者其可包括至少两种不同的互穿聚合物链(例如，聚丙烯酸和聚胺)，所述链不规则缠结或呈有序方式(层叠)。术语“链”一般是指最长的连续主链，也可以是指在其上结合有官能团的聚合物支链。该术语用来表示在吸附剂制备过程中溶解、吸附或接枝的聚合物的完整主链长度，以及表示位于交联聚合物网格结点之间的链段，因为在后一种情况下单个链的完整长度难以确定。

在其主链或侧链中包含至少一个官能团的“聚合物”是优选的，因为它们允许在同质或异质介质中在这种官能团处容易地被残基衍生化。此外，固体状态或溶解状态的聚合物的许多特性以及其在给定固体载体上的自发吸附以及永久性结合的趋势是通过其官能团确定的。在此特别提及的是聚电解质。在这方面，含有官能单元和非官能单元的交替、无规或嵌段序列的共聚物也是可实现的。优选的官能团是伯氨基和仲氨基、羟基以及羧酸或酯基。根据周围介质的酸碱性，氨基可作为质子化铵离子存在，羧基作为去质子化羧酸根离子存在。如果多孔或非多孔本体聚合物也被用来作为固体支承材料的载体，则应指出其上涂覆的聚合物膜如本文所述会具有不同的化学组成。这些差异可能起因于下列官能团的存在、种类或密度，低分子量或低交联度。所有这些参数导致增加的亲水性、溶剂溶胀性/扩散和生物相容性以及涂覆表面上减少的非特异性吸附。

天然和合成聚合物可用于根据本发明的吸附剂中。优选合成聚合物。优选的聚合物膜包括至少一种含有氨基的聚合物。高度优选聚乙烯基胺。其它合适的聚胺可包括聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺等。

其它合适的聚合物为除含氨基聚合物外的功能聚合物，如聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、它们的前体聚合物如聚(马来酸酐)、聚酰胺或多糖(纤维素、葡聚糖、支链淀粉等)。如果使用共聚物，则优选的共聚单体是简单的烯烃单体或极性的惰性单体如乙烯基吡咯烷酮。所用聚合物的优选分子量的范围为(但不限于)5000道尔顿至50000道尔顿，对于聚乙烯基胺尤其如此。分子量接近上述范围下限的聚合物表现为甚至渗透载体的窄孔，使得具有高表面积并由此具有良好的传质动力学、分辨率和结合能力的固态材料可用于根据本发明的吸附剂中。

聚合物将在第一和第二残基衍生化之前或之后或者在第一残基的衍生化步骤和第二残基的衍生化步骤之间被吸附并随后交联或接枝到合适载体表面上作为薄吸附层(adlayer)。包括残基衍生化的所得混合材料的膜含量可为约5wt％至约30wt％，优选约15wt％至约20wt％，以吸附剂总重量计。全功能吸附剂的聚合物含量的准确值还取决于衍生化程度、残基的分子量和选定载体的比重。这些值对应于处于较低纳米范围的膜厚。所涂布的聚合物仍然可以保持其溶胀或收缩的能力，实际的膜厚由此强烈取决于所用溶剂的类型。

聚合物膜的交联度可为2％至20％，分别基于交联可用官能团的数目。特别优选通过官能团缩聚进行交联，但高分子化学(包括自由基化学和光化学)中已知的所有其它方法都可以应用。然而，交联键也可以直接形成在所涉及的聚合物的官能团之间，而不加入交联剂。这尤其在使用共聚物或共混聚合物来提供表现出彼此之间潜在反应性的至少2个不同的官能团，如在活化后可在彼此之间形成酰胺键的胺基和羧酸基。优选的交联涉及形成共价C-N键，如酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺/叔胺键，并且可经由活化的羧酸或环氧化物与胺的反应形成。作为替代方案，交联可以具有非共价性质，利用相反电荷的官能团之间的离子配对或利用多电荷反离子等。

如本文所用的“交联度”是指基于交联可用官能团总数的在交联反应中形成的交联的最大数量。如果，如优选的那样，使用双官能试剂进行交联，则交联度因此反映了提交到交联反应中的交联剂的量和可进行交联的聚合物官能团的数量(在这种情况下，每形成一个交联需要两个官能团)之间的摩尔比，在此认为反应以本文所述比例接近定量地进行。在原理上，可以形成链间和链内交联以及非交联封端侧链(来自于部分反应的交联剂)。

相反，“接枝”是指单个聚合物链共价锚定在固体载体的表面上，优选在其上形成有官能团。如果每个聚合物链被锚定在链上的至少一个任意位置处就已足够。更好的膜稳定性可以通过多点接枝实现，使得在表面上形成突出的聚合物环。然而，后一种方法减少聚合物链的三维柔性。单点结合优选通过链末端实现，可沿着链优选结合多个官能团/残基或可在相对末端上仅结合单个官能团/残基，使得充分拉长的链可从表面向外伸出。尽管接枝聚合物的实际构象可能是无规线圈，但是使用表面上的高接枝密度和适当的溶剂可导致溶胀和在例如在可进一步通过交联稳定化的聚合物刷的形成中相邻链间经由分散相互作用的取向自组装现象。优选地，接枝是通过类似于交联反应的温和缩合反应实现的，但也可以应用涉及增长自由基、离子或自由基离子的方法，如氧化或辐射引发的方法。选定的方法将取决于容易程度、类型、载体功能化程度。接枝在原理上可通过两种不同的技术实现：第一种技术采用表面结合的单体或引发剂通过从表面开始的原位聚合来建立平行的聚合物链，而在第二种技术中，首先在均质介质中(即在不存在表面的情况下)合成全长度的聚合物链，随后仅在额外的步骤中将其接枝到表面上。如果本发明的吸附剂通过接枝程序制备并且该技术构成本发明的方法实施方案，优选后一种技术。

在本发明的一个优选实施方案中，聚合物膜如果通过共价键进行内交联，则其不接枝(即共价连接)到下方载体材料上，即其仅仅通过物理和/或化学吸附结合在载体材料上。因此，术语“结合”包括物理和/或化学吸附。随后，由于交联聚合物膜的载体总体物理缠结实现复合材料的化学和力学稳定性。聚合物膜的厚度和密度仍然足以屏蔽在支承载体表面上的非常极性或反应性的基团，例如在固体聚苯乙烯磺酸酯的情况下的苯基或磺酸酯基，使它们免于进入，而这种进入为试剂分解或与待分离混合物中的靶蛋白质或肽或其伴随杂质进行未限定的无法重现或不可逆的相互作用。

在另一实施方案中，聚合物膜接枝到载体上，但不进行内部交联。作为第三选择方案，聚合物膜可以内部交联并且接枝到载体上。在图2中示意性示出聚合物膜的所有三种不同的所得网络形态。图2的情况A表示优选的吸附剂，其中单独的聚合物链彼此共价交联而不共价接枝到载体表面。情况B表示一种吸附剂，其中单独的聚合物链共价接枝到载体表面，但彼此不共价交联。情况C表示一种吸附剂，其中单独的聚合物链既共价接枝到载体表面，又彼此共价交联，因此是两种固定技术的组合(可以任何顺序进行)。

术语“官能团”是指任何简单独特的化学部分，其属于(非衍生化的)固体支承材料或限于在其表面上任选的聚合物膜，或通过膜吸附制备所述表面的过程中的聚合物，其可作为化学结合点或锚点，因此其至少在固体支承材料或其上覆盖的聚合物膜处于溶胀状态时适合通过化学加成或取代反应进行液相或固相衍生化以及任选的交联。因此，官能团通常包含至少一个弱键和/或一个杂原子，优选表现为亲核或亲电的基团。反应性较低的官能团可能需要在衍生化之前进行活化。它们因此可在聚合物链和吸附剂残基之间形成结构连接以及形成交联网络的结点。与残基不同的是，官能团主要不是设计为与分析物进行相互作用(尽管实际上不能严格排除它们在分离过程中经由副组分的排斥的确具有相互作用或辅助作用)，而是提供具有限定化学反应性的分子尺寸点的表面覆盖，其可以转化成实际的相互作用残基(衍生化)或用于形成共价连接(聚合物交联和接枝)。本文所用的术语“连接”或“键合”应包括直接形成共价键以及通过涉及多个原子的序列的成行的共价键扩展系列。在吸附剂或分析物中可能存在并且不具有已知和特异性功能的其它缩减为简单双原子分子片段的化学部分被简称为“基团”。

一组官能团可作为多个分离但相同的单元进行处理，其化学行为主要是仅通过可预测和可重现的基团性质来确定的，基本不受所连接的材料或其在这些材料上的准确位置的影响。这样的官能团少量提及的有：氨基、羟基、巯基、羧酸基或羧酸酯基。官能团表示固体支承材料的组成部分，并且因此均匀分布在其表面的大面积上。合适的官能团经常表现出弱酸或弱碱性，由此赋予成膜聚合物两性电解质的特性。聚合物中的官能团可以在相应单体的聚合期间引入，或通过在吸附到载体上之前或之后的后续官能团转化(类似聚合物的反应)而引入。如果不同的单体进行共聚，如果官能团转化在完成之前停止或如果不同的聚合物彼此层叠或成为互穿网络，则聚合物膜还可以包含两个或更多个不同的官能团。优选的官能团是伯氨基和仲氨基。特别优选的是伯氨基。

术语“衍生化”是指能够在吸附剂制备过程中在固体支承材料表面上或在用于覆盖所述表面的聚合物中引入特定残基以制备中间或完全功能化吸附剂的任何化学反应，特别是通过含有所述残基或其前体的合适的衍生化试剂对其官能团进行加成或取代。官能团向不同但仍具有反应性的官能团的相互转化也应包括在该术语中。残基的“前体”可引入被屏蔽或受保护的化学部分，其可以脱保护或以其它方式在与衍生化步骤中的表面或聚合物形成连接之后或与此同时转化成最终残基。例如，如果聚合物包含伯氨基或仲氨基官能团并且通过与它们形成酰胺键来进行衍生化，则在残基中待包含的其它伯胺或仲胺部分应该初始保护成例如在衍生化试剂中的Boc-或Fmoc-衍生物。此外，如果在表面或聚合物官能团与衍生化试剂上的反应中心之间的衍生化反应过程中待形成的键导致形成具有识别靶蛋白质或肽能力的新化学部分，则相应的残基将只有在衍生化后完全发展并且只有其一部分或官能改性体被包含作为衍生化试剂的前体。在这种情况下，前体部分的一部分(离去基团)也可以在衍生化反应过程中分裂(例如缩合反应过程中的水分子)。

衍生化在至少一个步骤或任选多个步骤的每个步骤中总是在官能团的“限定部位”上进行。考虑到不同官能团和试剂的反应性，这意味着在未衍生化的聚合物或固体支承材料中存在的目标预定百分数的每种给定类型的官能团总是被转化成用选定的相应残基衍生化的官能团。为了得到均匀且可重现的衍生化吸附剂，使计算好合适量的衍生化试剂与聚合物反应。也可以尝试完全衍生化(衍生化程度＝100％)，在此衍生化试剂经常过量使用，但这并不是必须的。

由于吸附剂的其余材料不应在衍生化步骤中受损，所以经常期望在温和条件下进行衍生化。因此可能有必要在实际成键步骤之前或期间活化官能团或衍生化试剂，以保持在该条件下足够的反应性。优选地，活化衍生化试剂。优选的衍生化反应涉及含富电子氮官能团例如氨基的亲核聚合物和含结合在缺电子碳例如羰基或羧基衍生基上的离去基团的亲电试剂，反之亦然。因此，活化可以通过固相或液相肽合成的标准技术例如通过活化酯实现。优选的衍生化反应涉及与官能团形成酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺和/或叔胺键。由于酰胺和氨基甲酸酯键相对于羰基碳的不对称性，它们可分别由氨基或羧基聚合物的任一个方向形成以及由氨基或羟基聚合物的任一个方向形成。

吸附剂的亲合性和选择性主要由两种或更多种不同残基的组合确定。术语“残基”是指能够在纳米尺度上(自身或自身部分或相同或不同类型的残基簇内)组装成复合物的任何区别的化学部分或明确可识别的、通常重复出现的、相同或不同类型的化学部分的排列，或者对于至少一种蛋白质或肽的至少一个互补结构或表面区域具有高亲合力和/或选择性亲合力的位置，只要亲合力强于与吸附剂表面上的晶格或聚合物链的CH或CH₂重复单元的仅范德华接触即可。这种在固/液界面处的位置类似于涉及生物大分子的特异性相互作用，称为“结合位点”。由此，残基可以是完全合成或天然产物或其部分或组合，但其应当适合进行化学合成和/或衍生化。其可包括一种或更多种的不同化学部分(包括化学上不反应的部分，例如烷基或烯基单元，不过它们能够参加疏水或分散相互作用)。

因为两种或更多种不同残基以可变比例引入吸附剂中，所以结合位点包括两种或更多种相同和不同的残基。形成特定结合位点所涉及的全部残基位于彼此邻近的封闭二维或三维空间中并且可以但不必一定涉及相邻表面官能团或聚合物膜的相邻重复单元上的残基。共同结合位点的单独残基也可属于交联或表面接枝聚合物的不同链(相同的原理应用于暴露在相应的蛋白质或肽表面上的结合的对应物)。另一方面，特定残基可被两个或更多个相邻或重叠的结合位点共享。由于交联键和残基在表面上或聚合物膜内的官能团上的分布的随机(统计学上)特性，所以可形成类似的但是在结构上和能量上均不相同的结合位点的所得分布。结果，这些结合位点对于靶蛋白质或肽的尺寸和亲合力可在显著程度上不同，但是这实际上并没有被证明是缺点。

吸附剂的结合位点和靶蛋白质或肽之间的“结合”应该是可逆的并且因此应该通过吸附剂的互补化学部分之间的任何形式的非共价相互作用进行。占优势的非共价结合模式是离子、氢键、给体-受体电荷转移、π-π、阳离子-π、偶极、配位、分散和疏水相互作用，但是经常遇到的是混合且非化学计量的形式，这不允许指明单个结合模式的贡献。因此，在可能涉及相同或不同残基的结合伙伴之间可出现单、双或多重同时接触。影响分析物在粗糙表面上和在微观孔隙中移动的物理力和熵力以及溶剂介导的相互作用可以是影响结合的因素。在某些情况下，所得的包含吸附剂和至少一种结合的蛋白质或肽的复合物可被检测到或甚至可分离，但是更经常的是只具有瞬态特征。结合强度的适用下限没有限制，这是因为该值不仅是给定的吸附剂-分析物对的内在特性，而且是强烈依赖于溶剂的。此外，甚至小至1kcal/mol的差示Gibbs焓也能被色谱法解析出来，这是由于柱内多个系列平衡所致，柱的理论塔板数可取值为约10³至约10⁴/米色谱床长。在色谱应用中，结合也应该不过强，因为否则难以在环境或生物相容条件下实现可逆性。

考虑本发明的吸附剂时，残基可连接到固体支承材料的表面上的官能团，所述固体支承材料包括覆盖在所述表面上的任选聚合物膜，并且如果这样的话，残基包括从官能团的结合点离开表面的整个部分结构或在不同官能团上以相同方式出现的结构的至少一部分。整个残基不必直接参与靶蛋白质或肽的结合。残基也可包含其目的只是使实际的结合结构彼此分离或连接或提供几何形状适合结合位点的合适框架以向靶提供结合结构的原子或部分。在固体支承材料上，特别是在其表面上任选的聚合物膜上的官能团与实际的结合结构之间任选的间隔单元、支化单元或其它连接单元，因此正式被指认为它们与其形成至少一个连接的每个残基的一部分。所述连接通常可通过官能团的至少一个特定衍生化过程来实现，该衍生化过程在以均相或非均相方式将任选的聚合物膜施加在载体介质上之前或之后以随机(普遍存在)或选择性方式进行。因此，聚合物溶液或薄膜可与预先合成的已经包含有残基或其前体的衍生化试剂反应。

但是，如果官能团或其结构部分通过用残基或其前体的衍生化转化为不同类型的部分，或随后形成具有所述残基的额外原子的整体化学单元(例如，-NH₂官能团转化成-NHCO-R残基中的氮原子)，则它们也可被认为基本失去了其作为官能团的特性，相反被认为是属于所述残基的结构部分。

如果相同或不同类型的残基直接或通过共价的构象柔性的连接部分单独结合到固体支承材料的官能团，则认为它们独立地适应于其在靶蛋白质或肽表面上的互补对应物，驱动力为总Gibbs焓的最小化。因此，基于本发明的目的，结合位点的残基安排成正确的三维取向用以优化给定蛋白质或肽抗原决定部位(如在天然抗体中那样)是没有必要的；它们只需要能够通过其构象空间的探索(底物诱导匹配)而采取该取向即可。在许多情况下，特别是如果争取差异化结合，那么靶蛋白质或肽的两个或更多个不同的或重叠的抗原决定部位可通过相同吸附剂识别出来。

虽然术语“残基”在功能上进行了这样的限定，即限定为从吸附剂表面向外伸出并且在其上相同或相似地多次重复以参与分析物结合的总体单元，但是该残基可在分子结构水平上由一个或更多个可区别但在其自身内相邻的子单元构成，仅在形式上残基可分段成子单元，所谓的“结构”。该术语在本发明中以其最宽泛可能的含义使用。虽然有些武断，但是将残基分成不同的结构应该符合化学相似性原理和直觉，由此分子部分或片段应该被有目的地根据常见结构和/或物理性质归类在一起。与属于相同残基的不同结构相关联的功能可由此同样是不同的：部分结构可涉及分析物结合，而其它的不涉及。鉴于因残基小的结构变化导致实现根据本发明的吸附剂的无限可能性，可基于此将残基的必要部分与非必要部分分开。对于那些不主要涉及在分析物结合中的任选结构，“连接部分”是短分子(经常为简单烃)链(tether)的附属部分，任选地包括在一端或两端的官能团或不饱和价用以形成必要的连接，和在实际结合结构与相邻结构和/或吸附剂表面之间形成纽带。因此，例如可以在本发明的吸附剂中采用几种不同的残基，其均包括第一残基和第二残基，其中第一残基包括吡啶环，第二残基包括羧基，但包括具有不同类型、长度或连接性以及任选的或缺少的其它结构的连接部分。这样的一组残基可随后在分子水平上进行区别，但是它们在功能上将共同定性为本发明含义内的“第一残基”和“第二残基”。连接部分的使用在下文中更详细讨论。

负责进行靶识别的残基结构涉及作为第一残基的“包括其氢原子可被取代的吡啶环的残基”和作为第二残基的“包括羧基的残基”。

根据常用命名法，“吡啶基”是指来源于任何单核的由5个碳和一个氮原子并且没有其它杂原子构成的六元芳香环体系(即吡啶或氮杂苯)的部分结构(基团)，其通过至少一个单键连接到残基的其余部分，但各种取代的吡啶也可能被称为不同的俗名。不过，其它的芳族环、杂芳族环、脂环族环或杂脂族环或环体系可以经由直接单键连接到至少一个环原子，任选经由间隔单元结合到吡啶环上作为取代基。然而，扩展环稠合(两点取代结合)只可能与脂环或杂脂环形成，使得吡啶的π-电子体系不扩展到附加环的全长度上，并且避免具有更高核性的环体系。由于残基片段化成为结构的多种单独可能性，因此在本文所用的范围内，如果至少一个可行的第一残基和第二残基片段化分别得到吡啶环和羧基就应该足够了。

“取代基”是被认为是吡啶环的任选部分的有机基团(除氢外)，因此被认为也参与分析物结合。

在现有技术中，表现出高亲合力和选择性的吸附剂主要是从其上附加抗体或其它生物来源的高分子量受体的固体支承材料得知。这种抗体首先必须特异性地提高对涉及活组织的生物过程中的靶抗原的抗性，或者靶蛋白质或肽必须可逆地缀合至抗原或仅少数已知的天然亲合对的一个组分。本发明的吸附剂可以通过其残基利用化学合成、利用低分子量和高化学稳定性可进入来与那些进行区分。然而，它们也可以在所有类型的亲合色谱方法中用作固定相。

术语“蛋白质”和“肽”分别表示聚氨基酸和寡聚氨基酸，其为在化学、生物合成或生物分析方面可明确识别的实体，其可具有合成或生物来源(不论其性质上可能的出现情况)、线性或支化的同质或异质序列，并且对其没有最小或最大的序列长度或分子量的限制。最低要求是其应该由至少2个氨基酸通过至少一个酰胺键连接，这将例如对应于二肽。均能形成肽键的非蛋白源或完全非天然的氨基酸、β-氨基酸、N-烷基氨基酸、其它类肽单元等的存在不应有害。小(寡)肽往往可以通过逐步或收敛方法合成制备；术语肽在这种情况下应另外包括通过不寻常的连通性形成的可得结构，例如缩肽类或类肽。较大的蛋白质通常具有限定的三维结构，可以采取许多不同的形状，例如球状(白蛋白)或丝状/纤维状(肌动蛋白、胶原蛋白)；它们可以溶解在细胞质、细胞膜(membrane-bound)、部分细胞外基质中或可存在于细胞表面上。由于现代分子生物学方法可以处理极少量的蛋白质，所以不需要知道用以确认它们的其主氨基酸序列；有时甚至不知道它们是否作为匀质组合物存在。结合到(胶体状)分散载体(纳米)颗粒例如病毒、量子点或乳胶球的表面上的蛋白质或肽通常需要首先切断以暴露出其整个分子表面否则屏蔽的部分，用于在其可用于本发明分离方法之前与吸附剂相互作用。

上述术语一方面包括非共价肽聚集体以及同源多聚体蛋白质和异源多聚体蛋白质，但另一方面也包括全部蛋白质的功能性或非功能性亚单元，例如酶消化或二硫键还原的产物，而且也包括从头设计的小型蛋白质，例如affibodies^TM、anticalins^TM、nanobodies^TM或其它人工重组活性位点。在蛋白质中可能包含金属离子或复合物，通常是在蛋白质的活性位点中。分析物蛋白质可以通过体内翻译后修饰如磷酸化、硫酸化、糖基化，葡糖醛酸化或泛素化进行修饰。与苷和脂质缀合分别得到糖蛋白和脂蛋白，包括氨基酸以外的其它结构单元。其上调或下调可作为其中产生这种蛋白质的有机体的某些病理状态的标志物的蛋白修饰因此通常是至关重要的。同样地，蛋白质表面以及蛋白质的活性或变构位点在体外的生化修饰包括与底物激动剂或拮抗剂以及各种氨基、羧基和侧链功能的保护基团化学形成可逆或不可逆的复合物。蛋白质或肽可以进一步进行化学或生化标记(例如寡聚组氨酸序列标记物、缀合染料或放射性标签)或与另一(载体)蛋白融合。目的是增强蛋白质或肽的表达、溶解度、分泌、检测或分离，由此缀合点可以是可断开的，但它们也可缺少其天然序列的一部分，例如膜锚定尾段。

在使用术语“靶蛋白”，“靶肽”或简称“靶”中的一个时，是指为其设计了对其具有特异性残基的吸附剂的特殊的蛋白质或肽或多种蛋白质或肽(通常通过结构、分类、合成或来源进行关联)。这通常是分析物或进料混合物的组分，它们表现出对吸附剂的最高亲合力。靶蛋白质或靶肽可区别于其潜在的蛋白质类副产物，不仅通过其氨基酸序列(低至单点序列的突变或缺失，包括在基因转录过程中因选择性剪切或SNP变体得到的那些)而且通过其包括存在不同的折叠态(天然、展开或错误折叠)的完整的二级和三级结构要素进行区别。靶蛋白质或靶肽通常但不必一定是进料混合物的主要组分(按重量或摩尔计)，甚至不是主要肽组分。不论其在混合物中的丰度如何，靶往往但并不必一定是有价值的混合物组分或需要纯化的特定物质，而后者可能是包含在流出级分中。由于许多蛋白质或肽具有明显的毒性，因此在健康或环境导向的应用中，靶大部分也可以是在其必须从中排出的混合物中显示出这样的毒性或其它不必要特性的蛋白质或肽。也有可能靶不是主要产物，而是制备过程中的较少副产物，其需要从混合物的其余部分中分离或移除，由此另一种混合物成分-通常为主要产物-(其本身可能是或可能不是蛋白质或肽)的浓度和纯度增加。对于多步血浆分级过程而言，可能有必要进行多次连续分级来精馏在进料混合物中同时存在的大量不同的蛋白质或肽，由此分级的特定阶段的流出物可在下一阶段吸附，反之亦然。

待分离混合物中的所有溶质的集合称为“分析物”，其中包括能够与本发明的吸附剂在合适条件下发生至少弱相互作用的靶。大多数的分析物是蛋白质或肽，因为这些是吸附剂所专门设计针对的分析物，但在某些情况下，有可能小的非肽分子可属于该组别。密切相关的分析物可能一起形成合成或生物合成库，例如来自胰蛋白酶消化的库、噬菌体展示库或已适当地进行体内或体外转录的随机cDNA库表达产物。但是，吸附剂的亲合力对于结构偏离靶组的分析物通常迅速下降并且如果在结构上与靶不相关则接近零。

优选的蛋白质或肽具有从4.5到8.5的等电点PI，其分子量可为从100Da到500000Da。这些PI值大致匹配引入在至少一个第一残基中的吡啶环的酸度pK_a。本发明吸附剂的特别优选的靶蛋白质是“抗体”或其混合物，该术语还应包括抗体片段(轻链和重链，Fab和Fc区，Sc可变区，等)、该片段得到的人工分子构造(双抗体、三链抗体)、寡聚抗体缔合物以及含有抗体或抗体片段的融合蛋白或其它类型的缀合物，如含有可检测标记物如谷胱甘肽或GFP(也可以彼此化学连接)的那些。它可以是多克隆或单克隆抗体。通常在免疫球蛋白(Ig、γ-球蛋白)中，抗体可能属于任何同型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，每一种又可分为若干亚类。抗体可以是人类或其它哺乳动物(典型的是：鼠或啮齿动物(小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)、山羊、羊、狗、猪、牛、马)的来源。优选的抗体是人抗体或人源化(嵌合的)抗体。它们的独特型可以针对所有类型的抗原(其它抗体或其它生物物质、小分子)。

“含有蛋白质或肽的混合物”是指可具有各种来源的混合物。本发明对所得混合物的来源没有严格限制。唯一的要求是，它包含至少一种蛋白质或肽，其可定性为本发明吸附剂对其表现出至少弱受体特性的分析物。该混合物由此可包含两种或更多种不同的蛋白质或肽，意图将其与混合物的其余部分集体分离(即它们所有都是分离靶)或彼此分离(即只有其中之一或极少部分是分离靶)。混合物中至少两种蛋白质或肽的通过吸附剂残基识别的结构基序(抗原决定部位)可以是相同的、类似的或部分相同的或不同的。假定后者将在许多情况下导致与吸附剂的不同类型的相互作用，由此得到结合强度方面的较大差异，前提是所述至少两种蛋白质或肽具有相当的分子量并且包含大约相同数量的可识别抗原决定部位。

如果蛋白质或肽是天然产生的或重组产生的物质，则它可从液体或固体生物材料如动物、植物、微生物或病毒(包括过量产生产物的育成或转基因物种)的新鲜或干燥提取物、细胞培养物或细胞培养介质的提取物，微生物(细菌或真菌)或酶发酵液，商业原料或其任何组合得到。另外，含有蛋白质或肽的混合物可以是化学合成或部分合成的初级产物。这尤其包括手动或自动方式实施的标准溶液和固相肽合成方法。

如对于任何纯化技术，尤其是任何色谱技术典型的，所用的确切条件不仅取决于靶蛋白质或肽的构成，而且取决于样本基质的构成。“基质”是用于混合物中所有活性和非活性成分的集体的术语，不包括靶但包括其分散在其中的介质。这是因为分离过程通常利用的不是靶蛋白质或肽的绝对物理或化学性质，而是利用在靶蛋白质或肽与所有或少数具体基质成分之间的所述性质的差异。通常，基质的组成至多只是部分已知的(定性和定量)，因为一种单一的分析方法往往不能够检测所有成分，至少不具有同等的敏感性。在化学或生物材料的下游分离纯化过程中的不同过程阶段获得的中间产物代表本发明上下文的含义中的不同基质。待测试其在吸附剂上的吸附行为的整个混合物(靶和基质的组合)在分析范围内也常被称为“样本”。

用本发明吸附剂进行处理之前，化学或生物原材料可以通过其它预处理进行部分纯化，所述其它预处理通过其它非破坏性的单元操作，特别是常规分离过程的任意组合进行，其可包括过滤(包括微滤或超滤)、透析和电渗析、洗涤、离心、沉淀、离子交换、凝胶过滤、溶解、蒸发、结晶、干燥、粉碎、任何方式的病毒减少处理和常规色谱(在低特异性吸附剂上色谱或常规利用生物残基的亲合色谱)以便从化学或生物材料中移除尽可能多的废料(例如，不溶物和大多数蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和在生物材料情况下的无机物，只留下有价值的物质)，有害或腐蚀性物质或怀疑可能使吸附剂劣化或降低其分离能力的那些物质，从而在其与吸附剂接触之前增加靶的浓度。在本文中，参考LC/LC偶联技术。干混合物例如冻干材料需要在用吸附剂处理之前溶解在合适的进料溶剂中。期望溶解的混合物是均匀的并且不含悬浮或胶体颗粒。同样地，本发明分离方法也可以随后与上述类型的一个或更多个步骤进行组合。

许多蛋白质或肽已经以工业规模生产并已发现在医药、营养品(如膳食补充剂)、化妆品或农业上的应用。其中大部分的大规模生产到目前为止可以经济地并且在合理的时间段内只通过提取生物质，即例如从药用植物、利用原核或真核微生物的微生物发酵或直到昆虫或哺乳动物细胞(如常用的CHO、NS0、BHK或永生化HeLa细胞)的较高级生物体的细胞培养物得到的生物材料来实现。总之，根据本发明混合物的经常来源因此是生物合成产物，例如从微生物或细胞培养物或从作物提取物得到的那些。

微生物发酵包括细菌或真菌(如酵母)菌株的浸没培养或漂浮培养。产物可从整个生物体收获物或从分离部分如菌丝体和/或相应的可在其中分泌的培养介质上清液得到。半合成程序包括天然产物或中间体的下游化学修饰和合成原料的生物转化。在所有情况下，副产物往往包括蛋白亚型、截断形式和积累的中间体或沿得到靶蛋白质或肽的生物合成途径的后续产物。这些可还伴有普遍分泌的抗生素、内毒素、真菌毒素、热原、细胞增殖的促进剂或抑制剂、蛋白酶抑制剂、消泡剂，未完全消化养分的残余物、部分降解的产物以及高分子量和部分不溶性组分(如细胞碎片)，因为它们可由生产生物体的最后阶段细胞溶解得到。细胞溶解产物往往由于释放额外的物质类如核酸和大量所谓的宿主细胞蛋白质到可提取介质中而进一步增加混合物的复杂性。

与本发明的分离方法相关的术语“分离”包括将混合物分离或分割(split)成其部分的所有类型，特别是分开一种或更多种分子程度上溶解在液体中的结构不同的组分并且将它们分成不同的液体级分。混合物中一种突出的组分总是应该与至少一种其它混合物组分分离的靶蛋白质或肽。因此，是否将靶分离在一个级分中并且将副产物集体分离在另一(共同)级分中，或者是否将每一单独的混合物组分与任何其它组分分离在其自己的级分中，或者是否该方法得到在这些极限情况之间的任何情况都是不重要的。只要在实施该方法之后得到的至少一种液体级分中观察到在原(进料)混合物中已存在的至少一种溶解的蛋白质或肽富集就已足够。分离的副产物不必一定作为分离的液体级分回收；它们也可例如与吸附剂结合而直接抛弃。分离过程保持未完成导致含有所需有价值产物的级分中产率损失是常见的。避免重叠的洗脱带的清晰分级会提高分离质量(即纯度)但会进一步产生产率损失。

术语“浓度”和“纯度”涉及混合物中各物质的给定或可实现的级分含量，由此术语浓度是指在总参比量的混合物中包含的溶剂量的溶液，而术语纯度是指(有时假设)不考虑溶剂(包括残余水)的干混合物。它们往往表示为重量分数或摩尔分数(重量/重量，重量/体积，摩尔/摩尔，摩尔/体积)。更高的纯度因此可以更高的稀释(即低浓度)为代价实现，或反之亦然，这取决于在特定体系中待实现的更重要的目的。用于确定本文所用这些指标的实际值的测量是HPLC峰面积，在此必须注意的是除重量外的每一种定量方法显示出可检测性好的混合物组分对可检测性差的混合物组分的某些偏差，并且还可能产生非线性校准曲线。不溶材料例如无法通过HPLC进行量化。根据其来源、分离和预处理的方式，该混合物可通常包含(合并)纯度为1％至99％，优选至少10％，更优选至少50％的靶蛋白质或肽，其余为副产物或结构和功能与靶无关的化合物如残留溶剂、试剂等。根据实际纯化任务，本发明的分离方法可因此用作从极稀或粗混合物中初始捕获或分离的步骤，或作为含有几乎纯的靶蛋白质或肽的已预纯化混合物的最后抛光步骤。混合物的副产物或其它成分的数目可为1(如单点序列突变或缺失)到基本无限数目(例如未经处理的生理样本)。副产物的类型还取决于原料来源和之前的加工过程。

术语“接触”是指利用作为固(固定)相的吸附剂对液(移动)相中存在的初始(进料)混合物通过在现象学(润湿)以及分子(表面或孔隙扩散)尺度上在两相间建立物理接触所进行的任何适当的处理。所形成的接触的强度应该足以使混合物中所有可能在分子水平上分散的组分(但至少是靶蛋白质或肽)能到达其上具有残基的吸附剂的所有外部表面和可选的内部表面并随后与它们相互作用。接触的形成可在静态或(柱塞流、层流、湍流等)流动条件下发生，例如在吸附剂粒子的固定床或流化(扩张)床上进行。由于混合物将溶解在第一液体(进料液或吸附液)中，所以这将是异质过程并且接触形成可在宏观上通过搅拌或振荡所得混悬液得到加速，但对于终止该操作步骤没有时间限制，除非靶蛋白质或肽和可选的副产物与吸附剂的稳态结合平衡已经建立。

本文所使用的术语“液体”是指任何溶剂(包括作为最重要溶剂的水)或溶剂混合物，其具有对于待分离的一种或更多种混合物组分的至少弱溶解性能。不同组成的液体可以用于在方法的不同步骤中处理吸附剂，这是因为在每一步中所用的相应液体必须完成特定的任务，应实现诸如靶吸附(结合)、靶脱附(释放)或吸附剂清洗。在色谱环境中，能够实现混合物的一种或更多种组分与吸附剂的动态平衡交换的液体通常也被称为移动相。由于在本发明吸附剂上的色谱分离主要取决于强极性和疏水相互作用，所以可以使用对各个混合物组分具有不同的溶剂化能力的多种液体组合物，这取决于应该有利的相互作用的类型。为了进一步调节任意或所有这些相互作用随分离方法的任意步骤的时间进程的强度，有时也可能有利的是逐步改变所述步骤中所用液体的组成，例如通过梯度混合。因此，用于完成特定任务的液体的组成不需要在所采用的工艺步骤的全时间段内保持不变。在选择合适的吸附和洗脱液体时，也必须考虑靶蛋白质或肽的比溶解度。蛋白质(除了膜结合蛋白质外)如果必须保持其天然状态并且必须防止聚集则通常需要使用高含水量的液体。许多蛋白质或肽也耐受低至中等百分数的二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈或低级醇和丙二醇。由于本发明的吸附剂对几乎所有的质子和非质子有机溶剂是化学耐受的，即使载体中所含的本体固体支承材料通过作为与液体(优选是促进吸附剂或位于其上的至少所述任选的聚合物膜溶胀的那些主要的极性溶剂)直接接触的唯一材料的表面聚合物膜而受到屏蔽的情况下也是如此。相容性液体混合物的确切极性由此从而可以很容易地通过其组成进行微调。

此外，在这样的液体或液体混合物中可有利地添加少量助剂物质-优选挥发性的-酸、碱或缓冲液，从而通过调节所施用液体的pH(或在部分有机洗脱液中为表观pH)并由此调节选定的或全部分析物和/或选定的或全部吸附剂残基的质子化程度和/或非质子化程度来实现在不同的溶剂化能力之间的切换。在这方面有用的物质是例如甲酸、乙酸、三氟乙酸和它们的盐类。添加高浓度惰性的有机或无机盐也可以用于改变液体的离子强度，从而通过竞争性相互作用来选择性地破坏分析物和吸附剂之间的离子对。然而，在制备性应用中，如果靶蛋白质或肽意图通过结晶进一步纯化，则这样的非挥发性盐添加剂难以随后从回收的洗脱液中移除。

在某些情况下，将其它有机改性剂与吸附剂联用可能对于蛋白质或肽的混合物的分辨率是有利的，这是通过一种超越单纯调节液体pH或离子强度的机制实现的。至于“改性剂”，是小分子或大分子或其混合物的总称，其不是自身具有溶剂化特性的液体，但其可少量溶解或悬浮在本发明的分离方法所用的一种或更多种的不同液体中，用以帮助或防止待分离的混合物的某些组分在该方法的特定步骤过程中溶解/洗脱，或出于一些次要(技术)原因，例如，溶剂的长期稳定和贮存，防止吸附剂生物淤积，保护分析物不发生化学或生物降解或凝聚，提高溶剂的混溶性，吸附剂溶胀，改善分析物的检测，破坏水的结构，控制蛋白质展开或再折叠等，这取决于个别的分离问题。有机改性剂的特定实例是离子对试剂、表面活性剂(去污剂)和离液剂。

“冲洗”、“洗涤”和“再生”是用于更好地区别用不同液体逐步处理相同吸附剂的不同表达。液体由此通过所执行的任务而不是其组分进行区分。实际处理过程可因此非常相似，有时区别只在于根据处理后溶解在其中的物质来决定是否液体必须进一步提纯、分级、重收集或丢弃。冲洗涉及用液体进行处理，理想的是溶解并从吸附剂中释放任何混合物组分，除了可能已被吸附剂非特异性结合的靶。洗涤涉及目的是溶解并从吸附剂中释放出所有剩余结合的混合物组分甚至可以是比靶的结合更强结合的那些的处理。再生涉及使用能够移除痕量洗涤液的液体并且涉及使在该方法的下一轮开始用于吸附步骤的干净吸附剂恢复理想的物理和化学性质。

“固定”是指消除或基本延缓蛋白质或肽在吸附剂表面上的远程横向和/或纵向移动的过程，否则这样的移动可能由于统计学上的扩散迁移(布朗运动)或直接的物理或化学力(如渗透压、剪切流动)造成。因此，固定化的蛋白质或肽在表面的吸附部位上的宏观二维或三维位置可以被视为在短时间尺度内被固定。围绕固定中心的纳米级的不可避免的小波动例如构象变化、分子旋转或振动，相邻结合位点之间的跳跃或蛋白质或肽本身和所结合的残基以及由于将相应结合位点残基固定至表面的(任选聚合物的)链的联合半径内的任何平移运动保持不受影响。通过在大的时间尺度上使结合表面层交叉来缓慢释放结合的蛋白质或肽也可以是期望的性质。

在一个限定物质组成的中心实施方案中，本发明涉及新吸附剂的靶向特异性设计。具有官能团的固体支承材料已被用于随后的表面衍生化，产生多个残基的二维或三维排列，其适用于与包括在其中的靶蛋白质或肽的多价和/或多官能空间相互作用。

本发明的一般方面因此可以描述为一种包括固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面包含包括吡啶环的第一残基和包括羧基的第二残基，所述吡啶环的氢原子可被取代。

本发明的更具体方面可描述为根据“发明内容”章节中规定的第一、第二、第三和第四方面的吸附剂。

术语“其中所述官能团不包括所述第一残基和第二残基”用来描述根据第三和第五方面的吸附剂，是指载体表面的小于5％，优选小于1％，更优选小于0.1％的可用官能团，更优选没有官能团具有第一和第二残基。

在一个具体实施方案中，常用分析方法如光谱方法无法检测具有第一和第二残基的官能团。

所述吸附剂的固体支承材料可以选自包括聚苯乙烯、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、二氧化硅、玻璃、淀粉、纤维素、琼脂糖、琼脂糖凝胶和葡聚糖或其任意组合的组别。固体支承材料可属于通用本体或其它表面改性材料，如引入表面官能团或增加水润湿性。

在一个特殊的实施方案中，吸附剂还可包括容易检测的标记物，如光吸收、光发射、放射性或质量或射频编码的标记物。该标记物可用来识别在吸附剂混合物中具有其独特残基组合的特殊吸附剂或促进蛋白质或肽结合的检测。标记物可以被引入固体支承材料的核心或者与残基一起引入其表面上。

特别属于如上所述包括吡啶环的残基在经常以有机小分子的化学结构出现的部分，如图3所列举的那些。吸附剂对于给定的特定蛋白质或肽的特异性亲合力的微调通过仔细选择在吡啶环上对应的取代基，第一和第二残基的摩尔比以及任选其它残基来实现。因此，清楚的是不可能穷尽处理全部的变化；相反将提供建立根据现有需求的吸附剂的概念框架。

为了简单起见，在图3中只示出每个结构的一个内消旋化学式。此外，根据本发明的目的，如果存在该结构的杂芳族吡啶特征的至少一个合理的内消旋或互变异构的化学式，甚至存在可能的其它非杂芳族化学式，仍在足以满足术语“吡啶环”的含义内。环体系和残基其余部分之间的连接以及与最终的固体支承材料的连接可通过包括自由价的杂原子的任意的环原子作为结合点来进行。

吡啶环和羧基都是离化的，这是指电中性原子或含有其的任何基团可以在进行分离的条件(即，通常是不影响吸附剂或分析物的结构完整性的温和或环境条件)下可逆地转化(如通过质子化或去质子化)成在环境条件下稳定或与不带电形式平衡的条件下的阳离子或阴离子。更具体而言，吸附剂的第一残基至少部分地可接受质子化作用，因此至少部分地以其质子化形式存在。虽然带电形式在图中没有明确显示，但是在给定条件下可在两侧实际达到几乎完全的平衡，并且在带电和不带电形式之间仍然可存在可测量的相互之间的转化。质子化取决于环境pH，但在大部分非质子有机溶剂中也是占优势的，使得难以区分是否两种形式或只有一种形式对吸附剂表现出的亲合力负责。各个残基的准确的质子化程度将取决于在移动相上的它的碱度、浓度和酸的类型以及吸附剂预处理的方式。

根据特定的分离任务，用表现出残基的吸附剂来处理待分离的混合物因而可能是有利的，所述残基已经调节为主要是非带电状态或主要是带电状态或者甚至可在分离过程中改变带电状态一次或更多次(如通过弱离子交换中已知的缓冲交换)。如可以很容易地想象的如果分离是在其pH接近相应结构pK值的环境中进行，吸附剂的离化吡啶环和/或羧基部分电离的条件也是可能的。也可能有必要生产或储存非带电状态的吸附剂而同时在带电状态下进行分离，反之亦然。

优选涉及pH为约5的水性缓冲体系的吸附剂的预处理，特别是在存在含有胺结构的其它(第三)残基(见下文)的情况下。这种处理将建立属于每一种铵结构或其它离化残基的反离子的均匀分布。残基对于分析物表现出的氢键强度也受到反离子性质，其碱度和/或其《硬》与《软》极化行为的影响，该反离子预期将保持在周围的溶剂化物壳中并形成与质子化残基的离子对。

其它取代基可以与吡啶环结合，并可以独立地选择每个环。如图3所示的示例性结构，取代基R¹，R^1’…R⁴独立地表示氢(H)、有机基团基。不希望被限制在特定的环几何构型或取代模式中，合适的取代基可尤其包括由一个或更多个的下述简单的有机基团组成的那些：C₁-C₂₀线性或支化的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、环烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、环烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、卤烷基、卤烯基、卤炔基、卤环烷基、卤芳基、卤芳烷基、卤烷氧基、卤芳氧基、卤芳烷氧基、卤烷硫基、卤芳硫基或卤芳烷硫基。

本发明的全合成吸附剂必须与常规亲合介质进一步区分，在常规亲合介质中表面结合残基本身往往是蛋白质或肽或其部分，并且其密切模仿已知的生物配体-受体的相互作用。一般来说，这样的介质具有本文开头所述的缺点。

每种残基的衍生化程度优选为其中第一和第二残基的摩尔比为约3∶2，在更宽泛的意义为至少1∶1至2∶1。第一和第二残基组合的总衍生化程度优选接近至少50％(根据可进行衍生化的官能团的数量)以促进形成混合组合物的多价相互作用位点，同时仍保持吸附剂对靶蛋白质或肽的高结合能力。第一和第二残基随后可分别以例如接近35％和25％的衍生化程度存在。优选的第三残基(见下文)包括胺或酰胺，更优选是伯胺结构。在这种情况下，第一、第二和第三残基的摩尔比分别为约3∶2∶3。这些值周围约10％的相对偏差是可以接受的。

在一个实施方案中，5至95％的官能团连接至所述第一和第二残基的相互作用结构(分别为吡啶环和羧基)，优选20至90％，更优选30至80％，更优选40至70％，再优选50至60％。由于第一与第二残基的摩尔比可自由选择，所以有可能将吸附剂最优调节到特异性分离问题的所述给定范围内，例如蛋白质或肽与包含所述肽或蛋白质的混合物的分离，或调节吸附剂以优化来自包含肽或蛋白质的混合物的所述肽或蛋白质的浓度和/或纯度的增加。这种变化性使根据本发明的吸附剂特别适合用于上述分离或增加浓度和/或纯度的问题。

因此，在一个实施方案中，5至95％的官能团连接至所述第一和第二残基的相互作用结构(分别为吡啶环和羧基)，优选20至90％，更优选30至80％，更优选40至70％，再优选50至60％；其中第一和第二残基的摩尔比为1∶1至2∶1。

残基连接的类型可以是共价键的任何变型(同原子或杂原子，可变键序)并且可以直接利用在固体支承材料的表面上或覆盖所述表面的任选聚合物膜上的官能团形成，是否结合至其主链或其悬挂的线性或支化侧链或任选通过端基或双官能连接部分进行偶联。除了作为第一残基与靶蛋白质或肽进行选择性相互作用的指定部分的吡啶环外，这些残基因而还可包括共价连接部分。这种双官能连接部分因为它们长度和化学组成存在很大可能的变化性而没有特意在附图中示出，但它们由标准固相合成或生物缀合法(如琥珀酰基)已知；最简单的双官能连接部分是预定数为1至约20个原子的烯基链。最适合的连接部分是构象柔性的部分。将这个残基连接至聚合物膜的优选共价键合将再次由酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺/叔胺键形成。

在本文中，已经提及了特别是长烯基链或聚乙二醇部分用作连接部分可以对所述蛋白质或肽施加额外的主要是非特异性的疏水力，分别叠加或放大第一、第二残基的主要作用。但是，前述很容易合成并连接到活化表面上的含硫的连接部分不是本发明的重点，因为公知硫原子或含硫基团与分析物的分子表面上的相同类型的对应基团发生良好的相互作用，存在可能能够将主动引入特殊的选择性使得可能会干扰吸附剂的结合机制的事实。

因此不可排除在这样的任选连接部分和固体支承材料的官能团和/或残基的相互作用结构之间通过它们的结合形成的可能的附加化学结构也可进入各种分析物并且因而可以有助于靶蛋白质或肽的选择性保留。对于设置在作为对应残基的一部分的杂原子结构和固体支承材料表面之间的附加结构实体的化学组成的唯一实际限制是需要在吸附剂的制造、贮存和使用过程中施加的条件下具有化学稳定性和相容性。因此，也有可能是各残基通过特定的结合点作为亚结构被引入更高复杂性的支架(包括聚合物)中，其可包括相同和/或不同类型的额外残基。

残基可直接偶联到本体固体支承材料的表面上，特别是通过与所述表面上的官能团形成共价键。例如，选择与二氧化硅的表面硅醇基团偶联的残基的方法是利用氯硅烷或烷氧硅烷封端的连接部分来实施的，而与碳水化合物支承体的羟基的偶联可通过例如经典的溴化氰活化等各种方法实现。这些方法为本领域技术人员所充分知晓。

然而，在优选的实施方案中，本体固体支承材料只代表其直接表面覆盖有具有官能团的聚合物膜的载体，该官能团进而至少部分地被悬挂的第一和第二以及任选的其它残基所取代。因此，形成薄中间层，其使吸附剂的宏观形状确定的且与分析物相互作用的部分彼此移动分开，但并不显著改变整体的基本表面形态，因此被视为该表面的组成部分。残基可以结合到所述聚合物官能团，其将使所用的基础聚合物转变成至少部分衍生化的共聚物。合适的具有官能团的基础聚合物是例如聚乙烯醇、聚乙烯基胺、聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸以及包含这些聚合物中至少其一的任何共聚物或聚合物共混物。特别是如果固体支承材料由本体聚合物材料作为载体构成，在该载体的表面上再覆盖聚合物膜，而且如果使用非聚合物载体，则制备载体的材料可以不同于制备聚合物膜的材料。这种差异可以例如自身体现在不同的单体组成、聚合的区域或立体化学、立构规整度、分子量分布、交联度或其组合。

聚合物膜的确切厚度以及吸附剂的分离动力学和能力由此取决于聚合物的溶胀状态，其自身将总是移动相组成的函数，因此可以在不同的外部条件下发生变化。对于在水性介质或水性-有机混合介质中进行蛋白质和肽的分离，优选聚合物在该介质中是可溶胀的。这在聚合物是合成聚电解质的情况下是最容易实现的。如上所述，任何可能的离化残基的电荷性质也影响聚合物膜的溶胀性，其在一定程度上也是溶剂依赖的。本文所用术语“含水”是指含有50体积％以上的水的液体，其余的是其它水可混溶的溶剂或添加剂，例如无机或有机缓冲液、盐类等。

这种形态设计用于在移动相和固定相之间通过孔隙扩散保持非常高的传质速率。线性或支化聚合物本身已被牢固地固定在刚性坚固的载体表面，用于使聚合物膜耐受制备所用的分离过程的条件，并在整个过程中保留在原位上。固定可以通过单个聚合物链内部交联而形成连续聚合物网络，或通过将单个聚合物链在沿所述链的一个或更多个的位置处接枝到载体固体来进行。交联以及接枝可以容易地分别在聚合物的相同或不同的官能团之间或在聚合物中任意位置处存在的官能团和未涂覆的载体的表面上存在的官能团之间实现。优选聚合物的交联或接枝连接由酰胺、氨基甲酸酯、脲或仲胺/叔胺键形成。单个聚合物链的端基官能团对于接枝是最好的，这将得到赋予最高链柔性的端基构型。

虽然两种技术的组合肯定是可行的，但是通常其中之一就足够了。优选的固定方法是交联(无接枝)。聚合物链由此可以彼此共价交联的程度为1％至20％，基于可用于交联的官能团数目计。

如果交联剂含有适合与一种或更多种的分析物相互作用的化学结构，则额外补充的残基因而可在原理上是由于在聚合物膜中引入交联造成的。由于聚合物的交联度优选保持在相当低的百分数，因此它们的贡献被认为是相当微不足道的。同样认为额外的酰胺(如甲酰胺)或氨基甲酸酯基团的贡献也是如此，所述基团可以保持为变化量，但通常不超过1％，它们是因为含氨基官能团的聚合物膜通过不完全水解反应合成导致的，得到无规的胺/酰胺或胺/氨基甲酸酯共聚物。

然而，可以利用两种或更多种不同的第一残基和/或两种或更多种不同的第二残基根据其相应的部分结构的定义来衍生化固体支承材料。这些可随后在其相互作用结构(取代的吡啶环和/或羧基)或在其将这些结构与固体支承材料表面连接的方式或二者方面彼此区别。在优选的实施方案中，第一残基的总数和第二残基的总数(或其等同物各自的衍生化程度)处于同一数量级，以在提供随机(无规)空间残基分布的情况下实现包括所有不同的第一和第二残基的最大数量的混合组成结合位点。

通常，在优选的实施方案中，第一和第二残基不直接彼此连接，但是分别结合到本体固体支承材料本身或其支承的作为载体的聚合物膜上。因此，吡啶环和羧基不通过一个官能团或相同的官能团连接到支承材料表面。

另一方面，相同或不同类型的两种或更多种的残基也可以直接彼此通过共价键连接，而不涉及聚合物膜的主链或以任何其它方式涉及固体支承材料的表面。在这种情况下，各残基之间的界限开始模糊并变得任意，因为它们可能只有在吸附剂的衍生化历史(即衍生化步骤的次序和类型)已知的情况下才有意义。如图1的示意图A-H所示例性示出的，在固体支承材料表面上的两个侧官能团可以用多种方式利用两种不同的残基进行衍生化(长的水平波形线在此是指表面的一部分，其自身可包含其它残基)。

除了上述平均分配的情况(其中每个单个官能团负载一个残基(式A或B))外，它们也可以例如在相同的官能团上顺序排列成“行”(式C、D)或平行(式E、G)。这样的构型可以通过特别是实验实现，其中残基自身包含与聚合物或表面官能团相同或不同的官能团，并且在聚合物或表面官能团用所述第一残基衍生化后，其用第二残基(情况C)进行自身衍生化(任选在去保护和/或活化后)，或其中一个官能团衍生化至少两次(在单一步骤或多个连续步骤中)，使得具有支化结构的共同官能团(情况G)或连接部分(情况E)被两个残基共用(一个适当的例子是伯氨基进行两次或三次烷基化以得到叔氨基或季铵部分)。但是，由此产生的构型C、D、E、F也可以通过替代路径实现，其中具有官能团的表面或聚合物与被具有正确相互排列的第一和第二残基的单一衍生化试剂所衍生化。两个残基的更复杂的相互排列例如大环或多环体系(情况F和H)当然也是可想象的。在除A和B外的所有情况下，用第一残基衍生化的官能团的第一部分总是等于用第二残基衍生化的官能团的第二相同部分。

所有上述情况在统一的观点下也可以被视为其中单个残基排列成等级次序的更普遍情况下中的边缘情况。

如果鉴于这种普遍的表示情况复查一个给定的实施例，则这样的构型尤其可以实现，其中两个不同的结构共有共同的连接部分或其一部分，通过所述连接部分或其一部分所述两个不同的结构结合至固体支承材料本身的表面上。这两个结构可以由此线性排列在相同支链或不同支链上，如果连接部分具有支链结构的话。整个残基，即最大可能的是统一结构单元(包括终止在表面官能团中的可能的连接部分和所有其它与其相连的亚结构)，然后只是在形式上正式归因于第一残基，同时第二残基会在形式上再次在这种构型中只包括相应的羧基结构和其可能的与整个(第一)残基的其余部分直接连接的单元。

已经出乎意料地发现，任何具有上述两个结构特征的组合的吸附剂允许容易地回收大量的蛋白质或肽，在某些情况下，在以仅部分纯化的混合物起始的单一步骤中，纯度高于98％或各种杂质的最终浓度低于1％。因此，可以获得制药等级而无需费力或繁琐的程序。在例如直接从工业规模制造得到的粗原料中的蛋白质或肽的浓度也可在单一步骤中富集到高水平。适用的效价范围在混合物中为约1％至约90％。所述步骤的回收产率由此至少与常规纯化方法一样高并且可达到95％的值。用于本发明给定目的的包括两类残基的吸附的显著优良的性能甚至更令人出乎意料，因为表明包括具有紧密相关结构或两种必须结构中的仅一种的残基的吸附剂仅表现出至多中等的分离效率。

不希望受限于理论，与涂覆有简单且未衍生化的聚合胺的膜的吸附剂相比，这种特殊吸附剂的高效能可归因于存在额外的且结构新颖的多价结合位点。负责产生这样的新结合位点的结构可主要归因于聚合物的部分无规改性。在这些结构中，特别要注意的是在所述结合位点内潜在存在的扩展的富电子或贫电子π-体系和/或弱碱性或酸性的缀合体系。基本的相互作用模式被认为既涉及属于极性/偶极组别的相互作用，例如静电力、电荷转移和氢键，以及属于非极性组别的那些，例如疏水相互作用和π堆叠。π体系的杂原子预期是偶极力和氢键的潜在位点，无论是通过电子π体系本身或通过额外的孤对电子。然而，并没有对给定分离中的实际运行机制以及每种残基对总体结合强度的部分贡献进行调查，不能对任何这样的结构预先得出明确的结论，部分是因为与溶剂分子形成竞争的氢键也可能使情况复杂化。空间因素可能对所设计的吸附剂的选择性有额外的贡献。至少，来自第一或第二残基的纯离子贡献是不太可能的。

此外，在测试大量不同衍生化的吸附剂之后，出乎意料地发现，就本发明的给定分离目的而言，除了固体支承材料表面上的官能团的第一和第二部分被第一和第二残基衍生化之外，第三残基的存在产生甚至更优异的结果。固体支承材料可因此进一步被补充的第三、第四和第五残基等衍生化。包括固体支承材料，并且其表面除上述第一和第二残基外还包含第三残基的吸附剂因此是本发明的进一步实施方案。吡啶环和羧基被排除作为第三残基以及每个进一步的残基的结构构建单元。除了这种排除外，关于两种残基之间的可能结构关系的所有选项，如图1中针对第一和第二残基所示例性示出的，同样适用于第三残基与第一残基以及第三残基与第二残基之间以及在任何额外的残基之间的相互关系。每一个不同类型的额外残基促进吸附剂产生对于给定蛋白质或肽的非常特异性的结合位点的潜力，并且促进其与其密切相关的副产物进行区别。然而，每一类残基应具有至少约20％的衍生化程度，因为显著较低的衍生化程度在大多数情况下基于统计的原因是可以忽略不计的。对于大多数应用，因此在大约相等的衍生化程度下，足以使残基类别≤5。无论不同残基的数量和相互比例，每种类型的残基仍应是均匀和随机(无规)分布在固体支承材料的表面上。

虽然官能团的第一部分由此可包括官能团的所述第二部分或可与其不同，第三残基也可由所述固体支承材料的表面官能团被部分第一和第二残基的不完全衍生化所产生。根据所用的试剂和合成条件，衍生化反应往往是不完全的。因此，在待衍生化的包括任选其上覆盖基础聚合物(即，引入至少一个相应的单体或重复单元的那些)的固体支承材料的表面上共有的一定数量的非衍生化官能团可有意地或因技术原因而保存下来。这些仍然可以进入各种分析物，可以作为结合位点的补充部分，协助结合靶蛋白质或肽，从而增加了吸附剂的分离能力。这意味着所述官能团本身的第三(剩下的)部分可代表所述第三残基的类型。在本发明中，优选采用覆盖聚胺膜特别是聚乙烯基胺膜的固体支承材料。因此，优选的官能团是伯氨基和任选的仲氨基结构，它们可因此被视为补充的第三残基。在特殊实施例中示出，衍生化官能团分数达到100％导致对于给定分离对象的选择性下降。这一事实可被视为在包括第一和第二残基以及在空间上紧密相邻的未衍生化官能团的吸附剂内产生新型多官能结合位点的指标。

通过这种经设计的三级衍生化或不完全的一级和二级衍生化，对于给定的蛋白质或肽的选择性可以在许多情况下进一步增加，并且作为伴随的实际益处，经常观察到作为覆盖固体支承材料的表面的任选聚合物膜获得额外的化学稳定性和较好的溶剂相容性或溶胀特性，这取决于第一和第二残基以及所涉及的官能团的相对极性。然而，可以说，第一和第二残基是用于实现基本分离目的的在特异性方面最重要的残基，因为完全未衍生化的聚合物如交联聚乙烯胺(仅向分析物提供主链的伯氨基官能团)的膜并没有令人满意地实现本发明的分离目的。在理想情况下，残基(包括作为补充残基的未衍生化官能团)的总密度为0.1mol·dm^-3至1.0mol·dm^-3，但优选至少为约0.3mol·dm^-3。

另一方面，固体支承材料或其上任选的聚合物膜的未衍生化反应性官能团，更具体的是氨基基团，还可以表现出对于待分离的混合物中靶或可能的反应性副产物具有相当大的可逆或不可逆的反应性，这可能导致牢固捕获这些物质(即使它们只以低浓度存在)并且在反复使用后，吸附剂缓慢劣化并失去结合能力。为了避免这种不必要的相互作用，一般做法是在制备色谱固定相时使这种残余官能团通过所述基团的“封端”而失活。因此，额外的(第三或第四)残基在此可通过原游离官能团至少部分转换为结构不同的封端官能团而产生。以这种方式，封端可被视为衍生化反应的一种特殊情况，用以根据相应的分析物、基质和移动相的要求建立改善的固/液界面相容性，但不能产生额外的结合强度，因此没有额外的选择性。然而，部分或全部封端的残余官能团可最终证明在长期过程稳定性方面是有利的，尽管在固定相制备中需要更多的努力。

优选地，封端亲核官能团如氨基是通过减少官能团的亲核性的反应实现的。封端基团被设计成具有简单的分子结构，所以没有表现出与宽范围的分析物的相互作用或至少只有低强度的非共价和非特异性的相互作用，并且没有显著改变固定相的总体极性。但是，可以设想，它们可在高衍生化程度下有助于第一和第二残基与底物的多价相互作用。尽管由于不完全或混合封端导致在吸附剂上存在多于两倍混合的三级衍生化的可能性，但是已经证明，优选旨在整个吸附剂上实现均匀封端(即程度＞95％)，或根本没有封端。根据封端基团的结构，如果经形式处理的话，其因而可以或不可以潜在地作为三级残基。

在第一方法实施方案中，本发明涉及用于制备具有上述特征的本发明吸附剂的方法。该方法将得到特殊类型的吸附剂，其中固体支承材料由载体构成，载体表面上覆盖有聚合物膜，所述聚合物具有至少部分被残基取代的官能团。该优选类别的吸附剂的特殊特征已经广泛列举如上。现在，所述制备方法至少包括以下步骤：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(a)将聚合物膜吸附在载体的表面上(“吸附步骤”)；

(b-I)利用至少一种交联剂交联被吸附的聚合物的官能团的限定部分(“交联步骤”)；或：

(b-II)将被吸附的聚合物的官能团的限定部分接枝到载体上(“接枝步骤”)；

(c)用包括其氢原子可被取代的吡啶环的第一残基和用包括羧基的第二残基以及用任选的其它残基来衍生化聚合物的官能团的限定部分。

涉及上述制备方法的具体布局的几个变化方案设想如下。首先，步骤(b-I)和(b-II)即分别交联和接枝被视为等同替代，这些步骤中的任一步骤足以实施该方法以建立根据本发明的吸附剂，其将表现出以上进一步描述的特征。两种替代方案用作在进一步处理和使用吸附剂的条件下完成被吸附的聚合物牢固固定在载体上的任务的手段，即使用强溶解性的溶剂进行处理也是如此。这是通过在所有聚合物链之间形成附加共价键的连续网络并因此物理缠结载体(交联)，或通过在每一单个聚合物链与载体之间形成共价键(接枝)来实现。当然，两种用于固定的替代过程也可以在本方法内进行组合，或者同时组合在单个步骤中或连续作为两个可区别的子步骤进行，没有吸附剂稳定性方面的缺点。

其次，另一变化方案可能涉及与吸附步骤(a)相关的衍生化步骤(c)的相对时间顺序。因此可以想到，首先在均相溶液中用残基衍生化聚合物，然后将已含有残基的衍生化聚合物膜吸附到合适的载体上。这种程序将需要研究和优化每种不同衍生化的聚合物的涂覆步骤的实验条件。因此，优选的变化方案是首先将未衍生化的聚合物吸附到载体上，如在与衍生化步骤(c)并行或之前的吸附步骤(a)中进行，以获得薄且均匀的层。

交联步骤(b-I)或接枝步骤(b-II)在任何情况下均分别立即在吸附步骤(a)之后进行，因为一旦交联，聚合物就难以被吸附成膜。另一步的边界条件是步骤(i)总是序列的第一步骤。放在一起考虑，所述两种独立的步骤变化方案的以下四种组合是可能的(步骤b-I或b-II与步骤(a)和(c)的相对顺序的组合选择)：

第一方法：根据本发明的吸附剂的制备方法，包括顺序如下的步骤：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)吸附步骤(a)；

(iii)交联步骤(b-I)；

(iv)衍生化步骤(c)。

第二方法：根据本发明的吸附剂的制备方法，包括顺序如下的步骤：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)衍生化步骤(c)；

(iii)吸附步骤(a)；

(iv)交联步骤(b-I)。

第三方法：根据本发明的吸附剂的制备方法，包括顺序如下的步骤：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)吸附步骤(a)；

(iii)接枝步骤(b-II)；

(iv)衍生化步骤(c)。

第四种方法：根据本发明的吸附剂的制备方法，包括下列顺序的步骤：

(i)提供具有官能团的聚合物；

(ii)衍生化步骤(c)；

(iii)吸附步骤(a)；

(iv)接枝步骤(b-II)。

序列的每一步骤是指利用在紧接着的前一步骤完成后得到的其状态下的聚合物进行，即交联或接枝步骤后的衍生化步骤将利用已交联或接枝的聚合物进行，而在吸附步骤之前的衍生化步骤将利用游离的非吸附聚合物进行。如果聚合物官能团的限定部分在特定步骤中反应并且类似部分已经在前一步骤中反应，则意味着该特定步骤中的限定部分将来自于前一步骤留下的并且预先没有反应的那些官能团的全部(免除二价或多价官能团)。虽然所有四种方法原则上产生相当的结果，但是第一方法因其实施简单而是优选的。

在其它目前尚未明确提及的变化方案中，聚合物官能团的第一部分可以在溶液中衍生化，然后吸附部分衍生化的聚合物，并且在所得被吸附的聚合物上的前述相同或不同官能团的第二部分用前述相同或不同的残基进行衍生化。或者，聚合物官能团可首先通过溶液衍生化而转化成不同的官能团或残基前体，在吸附后转化成最终残基。通过这种混合组合制备步骤引入单个残基的最合理顺序由此在很大程度上取决于特定类型的载体材料和特定的部分衍生化的聚合物在载体上的吸附容易性。

层的分子内和分子间交联将形成稳定的二维或优选的三维聚合物网络并防止其从“包覆”的载体介质上解吸附。虽然交联可以根据现有技术中已知的所有程序进行，但也包括基于在聚合物链上的任何位置处产生自由基的非选择性方法，如电化学、光或(电离)辐射引发方法，交联步骤优选只在聚合物的官能团之间利用交联剂进行，例如设计为进行与所述官能团进行缩合反应。交联优选长度在1和20个原子之间的线性且构象柔性的分子如α，ω-双官能缩合试剂。而且，可采用两种或更多种的不同长度和/或不同反应性和/或不同链刚性的交联试剂，优选用于连续步骤中。交联不会以耗尽的方式进行，这会得到刚性材料，但总是只进行到预定的程度，即与聚合物官能团的限定部分交联，这可容易地通过相对于所加入交联剂的可用聚合物官能团的化学计量分数进行控制。在这方面，合适的交联剂包括二羧酸、二胺、二醇和二环氧化物，例如1，10-癸二酸或乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)。4，4′-联苯二甲酸可用作刚性交联剂。

交联剂优选选择为与聚合物官能团具体反应，但不与模板或基本载体材料反应，例如只在聚合物膜内实现稳定交联，但在聚合物膜与载体表面不形成稳定交联。无论如何，建立适度数目的后一类型的额外交联肯定不会显著改变吸附剂的性质。

如果需要额外的封端基团，通常在过程最后被引入(在最后的特定残基衍生化之后)，如果在前的衍生化尚未完成的话。封端原则上可以类似于上述特定衍生化步骤进行。然而，得到高反应性试剂的活化方法在封端反应中是常见的，因为它们需要与在在前的衍生化步骤中被证明反应性最低的那些官能团进行反应。优选的是酰基酐、酰基氯化物，特别是乙酸的酰基酐、酰基氯化物或异氰酸酯和异硫氰酸酯或环氧化物。此外，可以采用两种或更多种不同的封端试剂或包含两种或更多种不同的封端基团的试剂，例如混合酸酐。也可以想到，使用其它具有良好的离去基团的典型烷基化试剂如甲基碘化物、硫酸二甲酯或重氮甲烷。现有技术中已知的适合用于聚合物或非聚合物固定相的其它封端方法可以类推使用。通常，尽可能多的残留官能团的完全封端是期望的，但是该过程也可控制为根据需要在基本任何任意的封端程度上停止。

也可暂时用保护基团来衍生化聚合物膜的官能团或残基的取代基。所述官能团或取代基可以因此在引入一个或更多个的其它残基组期间受到保护，免于有时与对应的衍生化试剂发生不期望的反应，否则可能导致不可控的残基累积或高阶取代模式如支化。一旦额外的残基组处于合适位置后，保护基团通常被再次移除。

待吸附到载体表面上成膜的聚合物的优选官能团是伯氨基或仲氨基、羟基和羧酸或羧酸酯基团。这些基团具有易衍生性、生物相容性并增加聚合物的水溶性。因此在该方法中也优选采用溶于水性介质或水性-有机混合介质中的聚合物，这是因为吸附步骤优选从该介质进行到悬浮在其中的载体材料上。虽然吸附步骤本身在原理上可以在每一步骤中使用不同聚合物逐步进行，但是优选只使用单一类型的聚合物进行(即，具有相同类型的官能团或带有相同符号的电荷的官能团的聚合物)。特别优选聚合物的分子量为5000道尔顿至50000道尔顿。

一般来说，针对本发明吸附剂的组成和性质的上述所有其它优选实施方案也适用于其制备方法以及在上述方法中以类似方式使用的材料，因此不需要在本文中重复说明。

锚定基团，即衍生化步骤中所用的衍生化试剂的活化位点可接近待形成的结合位点或与上述结合位点的距离近或远，这主要取决于结构、功能或合成的要求，即可以在形成结合位点和活化位点的结构之间引入间隔基团。这种间隔基团可以是刚性或柔性并且具有不同长度，由此较长的间隔基团经常转化成增加的构象柔性，这有时可能是在吸附剂结合位点和靶蛋白质或肽之间的复合物所需要的，以采取有利的几何形状。间隔基团可以首先分别与对应的吡啶环结构和羧基结构偶联，在单独的(可以是均相的)反应中形成结合位点，所形成的类似于完整残基的缀合物与聚合物偶联，或间隔基团可首先与聚合物然后与所形成的缀合物偶联，然后在任选的去保护之后，分别与对应的吡啶环结构和羧基结构偶联以形成完整的残基。两种偶联反应可由此具有相同或不同的类型。一般来说，如果含有伯氨基官能团的聚合物被用作成膜聚合物，则功能性氨基的氮原子可以直接引入残基中。

优选的衍生化试剂包括胺、环氧化物、羧酸或酯以及异(硫)氰酸酯，导致与优选的聚合物官能团形成酰胺、氨基甲酸酯或(硫)脲键合。出于结构、稳定性和便利的原因，最优选的是，衍生化步骤通过在官能团和残基之间形成酰胺键进行，即在含氨基聚合物和羧基封端的衍生化试剂之间或在含羧基聚合物和氨基封端的衍生化试剂之间形成酰胺键。对于氨基聚合物而言，特别优选的衍生化试剂是活化羧酸衍生物。

如果在衍生化之前必须进行化学活化，则其可以在衍生化步骤之前的额外步骤中进行或与衍生化步骤同时进行。聚合物官能团或优选衍生化试剂可以被活化。例如，羧基的活化可以通过固相肽合成的标准技术，例如通过活化酯如OBt(苯并三唑氧)或ONB(降冰片烯二肟基氧)酯进行。羟基可以类似处理。在一个经济并因此特别优选的实施方案中，活化将在衍生化步骤期间利用肽化学中已知的方法原位进行，即作为一锅法反应，其中活化物质的稳态浓度持续产生而不是会分离出来。

这两种残基均可以在单个的衍生化步骤中引入聚合物。任选地，在此使用单一衍生化试剂，其已包含两个残基(或分别是其前体)或包含含有第二残基的第一残基(或反之亦然)。或者，至少两种不同的衍生化试剂作为混合物使用，其中每一种包含至少一种但不同的残基。衍生化步骤可以利用每种残基逐步交替进行。然后，在第一衍生化步骤中采用的衍生化试剂包含第一残基并且在第二衍生化步骤中采用的衍生化试剂包含第二残基，反之亦然。

在一个制备方法的变化方案中，衍生化步骤(c)可以利用每种残基逐步进行或作为单个步骤进行。该实施方案考虑到在聚合物官能团的衍生化反应中，第一和第二残基可以很容易地同时引入。其实现方式可以是，使用至少两种衍生化试剂的混合物，第一衍生化试剂包含第一残基，第二衍生化试剂包含第二残基。虽然随后得到两种残基沿聚合物主链的随机不规则分布，但是衍生化聚合物可通过第一和第二残基的统计比例来表征，其基本上是通过至少两种衍生化试剂的相对量和反应性来确定的。作为替代方案，如果该衍生化试剂已经包含第一和第二残基(或如果第一残基包含第二残基，或反之亦然)，则仅适用一种衍生化试剂也是可行的。当然，两种残基随后在所得衍生化聚合物中的比例为1∶1，并且具有预先限定的相互区域和立体化学性质。与两种完全发展的残基不同的是，也可以是至少一种残基在衍生化试剂中作为前体存在。

在本发明制备方法的相同变化方案的范围内，可以实现多种构型，其中使用衍生化试剂的混合物，每一种衍生化试剂包含第一和第二残基二者。特别的，在这种混合物中，第一残基(或其前体)的部分结构可以在衍生化试剂中变化，而第二残基(或其前体)可保持相同，反之亦然。非常特别地，在寻求制备方法时，衍生化试剂可以相互组合，限定量的衍生化试剂可包含第一和第二残基二者，而另一限定量的衍生化试剂可只包含第一残基或只包含第二残基。如果试剂的量和反应性相当，则所得产物随后表现为一种残基相对于另一种残基过量。这样，尤其可以实现第一和第二残基在聚合物官能团中的定制的但仍然均匀和随机(统计学上)的分布。

如果将额外的第三、第四…等残基引入聚合物，则衍生化步骤可以任选逐步重复多次，因此采用包括所需结构序列的其它残基。经济上可行的是至多约四个重复步骤。优选地，每个衍生化步骤总是进行到大致相同的衍生化程度，每种残基的程度由此约占25％。

本发明的吸附剂可主要应用于含蛋白质或肽的混合物的纯化。在第二方法实施方案中，本发明因此涉及使用上述靶向特异性设计的吸附剂从含有一种或更多种蛋白质或肽以及任选的副产物的混合物中分离所述蛋白质或肽的方法或增加所述蛋白质或肽的浓度和/或纯度的方法。该方法至少包括以下步骤：

(i)使溶解或悬浮在第一液体中的所述混合物与本发明的吸附剂接触，并持续足以使所述蛋白质或肽能够结合到所述吸附剂上的时间段；

(iii)使具有所述结合的蛋白质或肽的所述吸附剂与第三液体接触，并持续足以使所述蛋白质或肽能够从所述吸附剂中释放的时间段。

在上述方法的第一变化方案中，在步骤(i)和步骤(iii)之间可包括利用第二(洗涤)液体的单独冲洗步骤，该步骤理想的是不显著破坏在吸附剂残基与待纯化的蛋白质或肽之间的非共价键或否则用于释放所述吸附剂结合的蛋白质或肽。根据混合物中副产物和其它成分的种类和数目，在分离过程中液体的这种变化有时可以增加分离效率。第二液体主要具有低洗脱强度并且将非特异性洗脱。该方法然后包括可选的中间步骤：

(ii)利用第二液体冲洗所述吸附剂；

在步骤(i)中靶蛋白质或肽和副产物的混合物与吸附剂接触之后，吸附有蛋白质或肽的吸附剂还可以再与第一液体中所含的剩余混合物进行分离，然后在步骤(ii)中用第二液体冲洗。如果剩余的混合物包含有价值的副产物，则其自身可回收。后一变化方案也可用作极稀原料的捕获手段，也是在快速间歇过程中移除潜在副产物的可行方式，其被怀疑干扰后续的完整的和更复杂的色谱分离。其中，这些可能的副产物可能导致吸附剂通过不可逆的物理或化学吸附发生缓慢劣化并因此缩短柱的耐久性。

在实践中特殊但重要的情况下，第二液体可选择为与第一(进料，吸附)液体相同。这意味着在步骤(ii)中利用与在步骤(i)中将其作为混合物施用于吸附剂时从其中吸附所述靶蛋白质或肽的液体相同的液体来冲洗该吸附剂。这往往是可能的，因为第一液体通常选择为使得它对于靶蛋白质或肽只有中到差的溶解特性，原因在于只有在靶蛋白质或肽与液体之间的相互作用焓小于靶蛋白质或肽与吸附剂之间的相互作用焓的情况下，有效吸附才有可能。另一方面，如果这种液体对于应该在步骤(ii)中从吸附剂上洗脱的副产物具有良好的溶解性能，则它也可以用于冲洗吸附剂，而靶蛋白质或肽仍将结合其上不被同时释放。

同样地，第二液体可以选择为与第三(解吸附，洗脱液)液体相同。如果第三液体对于靶蛋白质或肽与副产物的溶解性能的差异程度足够大而其在吸附剂上的吸附焓相当，则可以将相同的液体用来冲洗吸附剂。这基本上意味着，该方法的步骤(ii)和步骤(iii)可以在这些情况下合并成一个步骤。在连续流动系统中，更好溶解的副产物将随后被首先冲洗掉，接着是在相同液体的后续洗脱部分中释放靶蛋白质或肽。当然，这个序列之后可以再是含有溶解度较低应因此洗脱较慢的其他副产物的第三液体的额外部分。

甚至所有三种液体都可以是相同的。然而，即使两种或三种液体都选择为相同的，但它们仍然可以在该方法的不同步骤中以不同的流量施用于吸附剂。色谱中的体积流量一般是所施加压力范围、柱尺寸和液体粘度的函数。HPLC中移动相的对应一维速度通常为约1mm·s^-1至5mm·s^-1。编号第一、第二、第三、…液体因而用于限定完成不同任务的施用液体的相对顺序，但不意味着限定相应液体的必然特定的组成。与不连续地或逐步(即，作为阶梯梯度(step-gradient))地交换液体类型或其施用流量不同的是，可以使用其它连续梯度形状，特别是线性梯度来在不同的液体和/或流量之间缓慢转换。这分别需要液体至少部分相互混溶和建立逐步将增加的后续液体部分混入在前液体中的机制。

在本发明的一个实施方案中，第三液体在pH值方面不同于第一液体和任选的第二液体。在一个特定的实施方案中，第三液体的pH高于第一液体和任选的第二液体的pH。更优选地，第三液体的pH接近于(即：在±1单位内大致匹配)靶蛋白或肽的等电点PI，而第一液体和任选的第二液体的pH显著不同于该等电点，至少相差约两个pH单位，特别是低于该等电点。第一液体的pH可有利地在从4.0至6.0的范围内，而第三液体的所得pH在从6.5至8.5的范围内。该实施方案涉及的情况是，吸附剂和靶蛋白质或肽之间的结合焓大部分被涉及在任一结合伙伴上的一个或更多个可离化残基(如氨基、含氮吡啶环或含氧羧基)的静电或其它极性相互作用(偶极力、氢键)支配。特别地，当接近pH范围的两端极值(例如，在低pH下的质子化氮与高pH下的去质子化的氧之间)时，疏水性和极性相互作用预计将主要接近中性，而离子排斥预计将部分替代相同且迄今不带电的残基的吸引极性力。该作用可显著削弱结合焓，并因此从吸附剂上释放结合的蛋白质或肽或阻碍副产物与其结合。以相反的方式，在由于pH变动使得任一结合方失去点电荷后，吸引的离子相互作用也被削弱。在这方面特别重要的是，含氮杂芳族化合物如吡啶作为吸附剂上的残基，这是因为这些残基能够表现出疏水以及极性/离子相互作用。这种吡啶环用于本发明分离方法的吸引力来自于其结合行为可在非常接近生理条件的pH值下切换，由此准确的切换pH值范围取决于特定残基的等电点，因而可通过其结构和含有至少两种不同的离化残基的吸附剂的相对组成来进行微调。另一方面，结合焓的pH依赖性也可适用于在吸附剂和至少一种待分离的副产物之间的相互作用。这可能例如是由于靶和副产物的不同等电点或由于疏水/极性相对于静电相互作用的定量上不同的相对贡献所致。

在本发明的另一实施方案中，第三液体在离子强度方面不同于第一液体，任选地也不同于第二液体。在一个特定的实施方案中，第三液体的离子强度高于第一液体和任选的第二液体的离子强度。该实施方案涉及的情况是，吸附剂和靶蛋白质或肽之间的结合焓大部分被一种或更多种离子或可离化的残基参与的静电相互作用所支配，而这种参与在吸附剂和待分离的至少一种副产物之间的静电相互作用中是不同的，特别是较不突出的。另一方面，疏水性对结合焓的贡献将在离子强度增加后得到增强，如果所有其它参数保持不变的话。优选地，分离方法的吸附步骤(i)在第一液体中的低盐条件下(0至0.2M氯化钠)进行，而释放步骤(iii)可以在第三液体中至多1M氯化钠的条件下进行。虽然本发明的吸附剂对高盐条件的耐受性非常好，但是大多数情况下不必要也不建议在步骤(iii)的第三液体中添加高盐浓度以脱附吸附剂结合的蛋白质或肽。相反，吸附剂对许多蛋白质或肽的亲合力可随着盐浓度变化而在很大程度上不可变。因此，盐梯度在只靠自身来释放所吸附的蛋白质或肽时可能是无效的，但它们在与辅助的pH梯度结合时可能是有效的。

靶蛋白或肽从吸附剂上的释放因此可以通过增加第三液体对于靶相比于第一和第二液体的溶剂化强度来实现。作为替代方案，它可以通过利用溶解在第三液体中的置换试剂使靶蛋白质或肽相对于吸附剂的结合位点发生位移来实现。位移作用(优选是吸附剂而非竞争的靶与置换试剂结合)可以在置换试剂相对于靶蛋白质或肽摩尔过量或置换试剂对吸附剂的结合强度甚至高于靶蛋白质或肽对吸附剂的结合强度的情况下实现。置换试剂本身可以是具有类似靶的特性的蛋白质或肽或其片段，而且是对吡啶基残基和羧基残基具有高亲合力的合成小分子。

在靶蛋白质或肽已完全从吸附剂中释放后，另一洗脱剂变化可同样在经济方面是有用的，从而以色谱分辨率为代价加速色谱运行或如果其它有价值的产物被后续洗脱也是有用的。

在第二变化方案中，该方法中增加了任选的最终步骤：

(iv)利用第四和/或第五液体洗涤和/或再生吸附剂；其在步骤(iii)之后引入。

在此，作为第四(清洁)液体使用的液体大部分具有高洗脱强度，可含有上述类型的添加剂并且非特异性地洗脱。如果吸附剂以色谱柱的形式使用，则第四液体可以高体积流量应用在正常或相反方向上，因为其任务是清洁吸附剂并永久移除强吸附的或以其它方式干扰化学或生物杂质的残余物特别是颗粒物质的任何积聚，以防止逐步积垢、堵塞或柱容量下降。对于医疗卫生和安全领域，就此而言也可以将用于消除微生物污染的典型消毒或灭菌方案(例如，碱性(1.0M氢氧化钠)、酸性(0.4M醋酸)、氧化性(次氯酸盐)和/或热处理)应用于吸附剂。

在用侵蚀性或强溶剂化液体进行预先处理后，使用第五(重调节)液体来调节吸附剂、其溶胀程度和其所结合的残基的溶剂化，使得吸附剂的原始状态得到恢复并保持恒定，在每个分离运行开始时建立平衡条件。除了移除痕量的洗脱液或清洁液外，离子残基的反离子(如果存在的话)将由此被替代成原来的均匀分布，以保持恒定的吸附剂的酸碱性质。第五液体可与第一或第二液体相同，并且通常会以相同的流量施用。它也可以从每次运行后的快速简单的清洗/再生程序切换到每五次、十次等运行后的更复杂的程序，例如，取决于这些污染物的实际负载量，这对于达到所尝试的产品品质规格而言是关键的。

实施分离方法的优选方式是作为中-高压液相色谱技术。由于其操作简单，并通过上述多种变化中的任一种，该方法也可以以间歇纯化方式不连续地用作亲合性(膜)过滤或固相萃取技术或连续地用作模拟移动床(SMB)技术。所有的变化也可以彼此组合。

吸附剂的强化学稳定性以及静态和动态结合能力(分别高达约0.3I进料负载量或每升吸附剂约20g蛋白质或肽是可能的)允许用于该方法的所有5种液体的独立变化具有大自由度。而且，与常规亲合色谱不相容的强溶剂化洗脱剂体系现在可实现，使得液体性质具有充足的优化空间，例如溶解力、低成本、低毒性、低废料产生。与实施本发明相容的液体体系基本上包括对于分离方法的底物，即特别是蛋白质或肽以及优选也针对副产物，具有至少弱溶解性的任何液体或液体混合物，后者对于第二液体特别重要。由于在本发明的吸附剂上的色谱分离通常在生物相容性限制下进行，因此经常使用水性缓冲介质作为第一、第二和第三液体。对于保存蛋白质功能重要的除缓冲液或金属盐以外的有机改性剂(例如去污剂、离液添加剂、抗氧化剂、消泡剂)可假设也被添加到液体中，但为了保持待纯化的蛋白质或肽具有尽可能高的生物活性，这些试剂最好完全避免。少量易挥发性有机酸可在实际分离过程之前或之后添加，用以提高某些分析物的可检测性。

然而，如果使用其它添加剂，则它们通常都必须随后即在该方法完成后从在步骤(iii)中得到的含有靶蛋白质或肽的液体中移除，特别是在需要获得结晶形式的该蛋白质或肽的情况下。为达到这一目的，范围广泛的这种潜在额外步骤为本领域技术人员所公知。为了移除添加剂，本发明的方法可因此也随后与任何其它类型的普通分离过程组合。

虽然实际将包括超临界流体的任何有机或水性液体或液体混合物应用于本发明的吸附剂是可行的，但是优选有利于聚合物膜(如果在固体支承材料表面上存在的话)溶胀的那些极性液体。液体混合物的确切极性可以很容易地通过其组成进行微调。

由于被吸附的靶蛋白质或肽(以及副产物)往往不是在本方法的步骤(iii)中瞬间释放(如开关状态)，而是相当缓慢和逐步地进行，步骤(iii)本身可有利地逐步进行，即作为分级，用于提高整体分离过程的分辨率。随后在吸附剂与第三液体接触足够长时间后，手动或自动收集相同或不同尺寸的两种或更多种的体积固定的第三液体的级分。接着，重复步骤(iii)并使吸附剂再次接触新鲜的第三液体(具有改变的组成，如果有必要的话)直到所有结合的靶蛋白质或肽被释放为止。在级分收集过程中，连续供应第三液体也是可实现的。随后确定每种级分中释放的靶蛋白质或肽的纯度和回收率，只有在品质和经济性方面满足预设接受规格的那些级分进行进一步处理，而所有其它级分可被丢弃或回收进入给料。

可以采用fronal以及zonal洗脱技术。经常利用梯度洗脱，特别是利用在第二和/第三液体中逐渐增加极性有机溶剂(低级醇、乙腈、丙酮)含量来实现最佳的性能和生产率。但是，如果用于过程色谱或一般制造环境，则为了操作简单和技术可靠，可优选等度洗脱或简单梯度形状如阶梯梯度。pH梯度和盐梯度也可以成功实施。根据吸附剂的特定残基，就吸附剂的化学稳定性而言对于短持续时间pH值在1和14之间的范围内，对于连续运行pH值在2和13之间是可能的。相应的最优液体组成也将取决于吸附剂的实际衍生化程度并且必须针对不同情况进行实验测定。

该方法与常规离子交换吸附的明显区别在于，它也可以特别是应用于分离任务，其中蛋白质或肽不含任何净离子电荷，即溶解介质的pH非常接近其等电点。虽然由于吸附剂的可质子化含氮残基和可去质子化含氧残基的含量使得任何符号的离子电荷均可以增加对本发明吸附剂的结合强度，它们的存在对于成功完成该方法不是强制性的。对于副产物和混合物中的其它组分也是如此。电荷相互作用能够影响化合物在吸附剂上的吸附或分离的程度也取决于周围介质的偶极性质和盐浓度。以上对于相反电荷的吸附剂和分析物的解释也适用于相同符号的电荷。它们在某些情况下可导致排斥和排除出吸附剂而不是额外的吸引力。

该方法还可包括在步骤(iii)之后，从蛋白质或肽已被释放到其中的第三液体的至少一个级分中分离出蛋白质或肽。在制备应用中，可以从第三液体的溶液中分离出富集的或甚至纯粹形式的蛋白质或肽，用于表征和/或后续处理。在最简单的方法中，它可以从步骤(iii)的液体中通过温和的溶剂蒸发方法(包括冻干、冷冻干燥)进行回收。然而，溶剂蒸发也会富集来自第三液体的可能含有的低蒸气压物质。这种物质可包括添加剂如缓冲盐或稳定剂或污染物如高沸点溶剂同源物和/或降解产物，其通常在商购品质的溶剂中含有痕量。但是，由于吸附剂具有高物理和化学稳定性，所以在步骤(ii)到步骤(iv)中实际上没有发生来自固定相的浸出，使得步骤(iii)的释放的蛋白质或肽通常会包含少于10ppm的浸出吸附剂或其它可从中浸出的物质(即，其成分(聚合物、残基)或分解产物)。

优选的分离方法包括含纯化的蛋白质或肽或所述蒸发残余物的第三液体的结晶步骤，如有必要，重新溶解后进行。在该结晶步骤中，可例如通过改变温度和/或液体组成来引发的，由于低蒸汽压污染物通常保持在溶液中并因而易于与靶产物晶体中分离，所以可以实现甚至更高的纯化程度。干燥后，晶体往往被准备用于配料和配制过程。如果干贮存是不必要的或不可能的，则作为替代方案可有必要将纯化产物转移到不同组成的溶液，即通过标准操作如透析，离子交换等将第三液体与储液进行交换。

如色谱中通常那样，运行色谱的方法和相关设备也可有利地辅以合适的检测技术，该检测技术允许定性、半定量或定量测量用于清晰和精细分级的洗脱液中的靶蛋白质或肽和/或副产物或混合物的其它组分的浓度。优选的检测方法包括物理或光谱性质的在线流通池检测器，如折射计、偏振计、电导计、紫外/可见吸光度或荧光分光计、红外光谱仪、质谱仪和核磁共振谱仪。在柱前或柱后衍生化或降解单元也可以添加到系统中，以将待分离混合物的所有或特定组分转化成具有提高的可检测性的衍生物或片段，或加速或延缓其洗脱。常用的蛋白质或肽的无损检测方法是280nm波长下的紫外吸光分光计。

在大规模上，吸附剂以及采用该吸附剂的本发明的分离方法可以有利地用于制造人或兽医使用的药物或营养组合物(如抗血清或疫苗)，前提是这种组合物包含可与吸附剂结合的具有诊断、治疗或营养价值的至少一种蛋白质或肽。本发明的益处主要源于以下事实，即这些应用经常要求有价值的活性成分的纯度＞99％或甚至＞99.9％，这通过常规方法只有在冗长和昂贵的程序下才可实现，这甚至可能使某些应用在经济性观点上被禁止。

在小规模上，作为替代方案，它们可以用于至少一种蛋白质或肽的识别、表征、定量或实验室纯化。为了这个目的，该目的涉及定性和定量分析，分离方法很可能辅以特定生物测试或通过光谱方法如联用技术来完成，但也可以通过与纯且真实的样品或肽标准品进行保留体积的比较来完成。在微型规格中，它们可能关注蛋白质的应用，即同时识别或量化多种不同蛋白质在细胞或有机体中的表达水平和修饰。

作为医疗设备的一部分，它们还可以用于从生物流体中移除至少一种蛋白质或肽，其包括由于在所述生物流体中存在所述至少一种蛋白质或肽而导致的医疗预防或疾病治疗。在其中患者已经摄入或即将摄入有害或传染性的蛋白质或肽如病原体分泌的所有情况下，而且在患者自身身体产生这种有害或传染性的蛋白质如在自身免疫性疾病案例中所常见的那些情况下，该设备可应用作为解毒或净化单元。潜在的摄入源包括食物、水、空气、接触受感染的人、输血等。在一个专门的应用中，该医疗设备可以构造为血液分离置换或血浆分离置换单元。这种设备主要在离体或体外操作，但构建为小型可植入装置也似乎是可以想到的。患者的生物流体可(连续或间歇地)自患者采集，通过利用吸附剂处理使污染物耗尽，再返回到患者。来自外部来源的生物液体(其它的人、动物)也可以在该流体或其部分或由其制成的组合物被施用于有需要的患者之前利用吸附剂进行处理以减少传染病的传播风险。在这种情况下，本发明的分离方法将被用来减少“有价值”级分中的靶蛋白质或肽的浓度/纯度(由此提高其中有价值的靶蛋白质或肽的纯度)，而其将富集在“废弃物”级分中。

最后，它们可用于将至少一种蛋白质或肽固定在吸附剂上。由于吸附剂和靶蛋白质或肽之间的相互作用的非共价性质，所以这种固定将是可逆的。在诸如可过滤试剂或催化剂的制备、细胞的表面结合培养、药物递送装置(如药物洗脱或治疗支架)或药物发现筛选的应用中，这可能是潜在的优势。在后一种情况下，本发明的分离方法可以辅以其它化学或生物结构与被固定的蛋白质或肽的结合的测试方法。这种次级结合的检测可以作为任一结合伙伴可能的生理作用的第一指标。如果使用聚合物涂层，则被固定的蛋白质或肽可被周围的凝胶形成物质物理包埋并因此额外地经历高生物相容性的环境。在本文所述的吸附剂和至少一种蛋白质或肽之间形成的表达不同且非共价的可分离复合物因而也具体体现在本发明中。这样的含有抗体的作为本发明优选蛋白质的复合物可用于免疫吸附技术。

可从以上说明中立刻得出的本发明的另一目的是一种预填充柱，其在管状容器内包含本发明的吸附剂。这种柱可以被用作液相色谱或固相萃取应用中的固定所需尺寸(长×直径)的固定相。除了管状容器外，该柱可任选地包括其它组件例如玻璃料、滤板、流动分布器、密封件、接头、螺钉、阀门或其它流体处理或连接元件，其为本技术领域已知的。该吸附剂可作为浆料在重力或离心力作用下、在外部施加的液压压力下或在活塞的额外轴向压缩下填充入所述柱并以该预填充柱规格商用制造。为了增加用户的便利，因此可确保更加可重现的填充并且固定相可以在不使用时很容易地贮存并且在色谱系统中快速更换。容器的材料(化学和生物惰性材料如不锈钢、硼硅玻璃，塑料如PEEK等)通常选择为不牺牲吸附剂自身的高稳定性，这意味着整个柱应具有的理想特征在于耐受所施加压力为至多20巴或耐受所施加的热为至多110℃以及耐受常用消毒方案包括高温灭菌的物理和化学抗性。在有利的情况下，将实现柱重复使用至多1000次，优选至多5000次，并增加整体经济性。然而，它也可以是一次性或可焚烧装置。另一种选择是只设计廉价且一次性的吸附剂中间管状壳体并将其放入由长寿命耐用材料制成的第二外壳内，其也包含所有可重复使用的补充组分(药筒设计)。

柱可以是完整色谱系统的一部分。除了上述检测系统外，色谱系统的其它相关组件包括泵、流量调节器、液体储库、脱气装置、注射端口、柱切换阀、压力和流量表、温控室、出口收集托盘(圆盘传送带)和机器人分馏器。

本发明的另一目的是多种相同或不同的本发明吸附剂作为松散材料(颗粒或块(整体)设计)或作为预填充柱或筒(见上文)或膜的集合(或“库”)，亦即单个吸附剂可能相同或不同。不同吸附剂的集合可用于例如合适的吸附剂的初步筛选，其计划用于后续更复杂的制备色谱装置，而相同吸附剂的集合体例如可以用于具有相似基质的大量样本的多种医疗诊断检测或半连续过程监测中。这种集合体的优点在于其并行处理能力，无论是手动或自动方式。这种并行处理除了与串行处理相比更高的样品吞吐量而节省时间外允许在标准的或至少相同(可再现)的条件下比较不同的吸附剂或其它工艺参数的条件。这种优点尤其可用于以标准格式或可位置编码格式排列的单个集合成员的情况，优选与机器人工作站相兼容的二维矩形网格，例如微孔板阵列或微芯片阵列，或作为多毛细管或微流体装置。就考虑微型规格的读出而言，再次参考蛋白质技术。

开始于上述制备方法的交联/接枝步骤的所有中间产物对储存用于未来使用是足够稳定的。随后这种产物可以分成对其用单独的衍生化试剂实施衍生化步骤的多个子集。以这种方式，可以根据需要形成不同吸附剂(即用不同残基或它们的组合或以不同残基比率或不同衍生化程度衍生化的吸附剂)的库。如果衍生化步骤在全部子集上并行实施，则容易在短时间形成这种库以便对用于给定应用最好的吸附剂实施初步筛查，这允许快速反应来改变分离目的。除了不同的衍生化，在吸附剂库的形成中还可以应用不同固体支承材料包括不同聚合物膜、载体和/或活化化学的可能性。

随机或靶向库筛选是有时可以补充或甚至替代理性的吸附剂设计的手段。它尤其用在来自于吸附剂上的不同残基和/或靶蛋白质或肽上的对应物的贡献的相对重要性不明显的情况，前提是缺少结构信息或应用额外严格的边界，例如关于相容性液相的选择。针对给定分离对象的该库的筛选可以采取连续或全库并行或其一个或多个子集并行测量表征特定吸附剂性能(亲合力、选择性、容量、回收、稳定性等)的一个或多个参数方式实施。最突出的特征是针对形成在吸附剂和蛋白质或肽靶之间的复合物的与亲合力和选择性相关的热力学和动力学参数。适合引入库中的吸附剂的预选择可以采取计算方法进行。

一种可行的筛选方法例如包括在合适的间歇条件下利用相应的本发明吸附剂处理的含有至少一种蛋白质或肽以及副产物和/或化合物的其它组分的混合物，并且测量在吸附剂和靶蛋白质或肽之间形成的复合物的单个平衡吉布斯焓。另一种替代方法包括一方面测量吸附剂与靶蛋白质或肽的复合物形成之间的差示吉布斯焓，另一方面测量吸附剂与适当选择的副产物的复合物形成之间的差示吉布斯焓。测量可以利用本领域技术人员已知的所有热力学/动力学方法直接进行，例如量热法。测量也可以利用对瞬态形成该复合物的设想应用的类工程条件下的色谱运行来间接进行，由此得到的结果可能对洗脱液的贡献进行校正。在色谱环境中，k’和α值可以在一级近似下分别用作吉布斯焓或差分吉布斯焓的指标。

本发明的另一目的是一种诊断或实验室纯化试剂盒，除了本发明的吸附剂(或吸附剂集合或含有吸附剂的柱)外，在同一封装单元中它还包括一组其它(或甚至全部)生物或化学试剂和/或实施本发明的分离方法或其中可采用上述吸附剂的不同的分析、诊断或实验室方法所必需的一次性用品。具有正确的数目、量或浓度的材料的预填充集合旨在增加用户的便利性，前提是在实施分离方法时必须遵循标准化实验方案，特别是吸附剂或柱作为一次性装置使用。上述方案可与安全性数据表等一起引入用户指南中，该指南可任选伴随上述试剂盒。

附图说明

图1：由用一个第一残基和一个第二残基衍生化的两个相邻表面官能团(FG)的所得的不同的个体构型A-H和一个通用表示I。

图2：包括载体的固体支承材料的不同示意性形态A-C，在载体表面上覆盖有聚合物膜(在此例示出绘制为灰球的无孔颗粒载体；未按比例绘制)。

图3：包含其氢原子被取代的吡啶环的第一残基的可能取代模式的选择。

图4：用于表征分析物相互作用的吸附剂表面的术语的象征性示意图(未按比例绘制)。并不是所有示出的项目都是实施本发明所必需的。

图5：根据本发明的包含聚合物的吸附剂的象征性示意图，所述聚合物为聚乙烯基胺，其被如所述附图中限定的第一残基和第二残基部分衍生化，其中I、m和n表示彼此独立的数字，分别指示重复单元。

实施例

材料与方法

对于所有的色谱试验，将吸附剂用于40×4毫米的实际柱床尺寸(实施例2)的标准不锈钢HPLC柱或250×16毫米的实际柱床尺寸(实施例3)的玻璃柱中。通过水-甲醇(1∶1)悬浮液在20巴的压力下流动沉淀来填充所述柱。

Dionex(原Gynkotek)的HPLC系统包括四通道低压梯度泵(LPG 580，LPG 680或LPG 3400)、自动采样器(Gina 50，ASI-100或WPS-300)、6通道柱切换阀(Besta)、柱温箱和二极管阵列紫外检测器(UVD 170U，UVD 340S或VWD 3400)。对于制备运行，可使用Purifier 10(GE Healthcare)单元。

免疫球蛋白G(Octapharma(Gammanorm)，来源：人血浆)具有144kDa的分子量和6.4的等电点PI。人血清白蛋白(Octapharma(Octalbin20％溶液)，来源：人血浆)具有66kDa的分子量和4.6的等电点PI。使用的所有其它试剂具有标准实验室等级品质。

实施例1：吸附剂的制备

首先将商业聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物球状树脂珠(Rohm & Haas Company：Amberchrom^TM CG1000S)在浓硫酸中过度磺化，然后在该多孔珠上吸附商业聚乙烯基胺-聚乙烯基甲酰胺共聚物溶液(BASF：Lupamin)并且利用二环氧化物进行轻度化学交联。对于含有约0.35mmol/ml至约0.45mmol/ml的游离氨基并在二甲基甲酰胺中预溶胀的该未衍生化的中间体，通过标准固相酰胺偶联方案，将相对于衍生化靶向程度对应的预定量略微过量的原位活化的异烟酸偶联至氨基。在第二步骤中，将也略微过量的琥珀酸酐添加到相悬浮液中以获得酰胺基连接羧酸的特定等级的衍生化。该吸附剂经洗去过量的试剂并干燥至恒重。在每个衍生化步骤后，通过水解断裂和利用HPLC定量分析裂解残基来确定衍生度。衍生度定义为裂解基团相比于未衍生化中间体的可测量氨基量的比例。根据该一般程序，制备表1所列的吸附剂。衍生化精确度为约±2％。合并取代程度与100％之间的差等于残余氨基的含量。

实施例2：含IgG和HAS的标准化测试混合物的色谱分析

将125μL的商业可得的人免疫球蛋白(IgG)和人血清白蛋白(HSA)的混合物以5∶1的比例注射到所述柱上。这涉及的负载量为7.2mg总蛋白质/mL吸附材料，分别为每mL吸附剂负载约6mg/mL的IgG和1.2mg/mL的HSA。对未与吸附剂结合的蛋白质的比例进行收集(流动物(flow))并通过凝胶渗透色谱法进行分析和量化。利用标准化的IgG和HSA，可确认在流动物中存在HSA(部分未能结合)，相应地不存在(结合)IgG。通过凝胶渗透色谱柱上的HSA校正功能，可以确认在流动物中没有结合的HSA。在所有测试的吸附剂中，IgG均完全结合。HSA在流动物中量化为50至90％的进料量。在表1中，该分析中发现的两种蛋白质的量和比例的数据与相应的吸附剂的结构组成相反。

表1：实施例1和2的结果