适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用

摘要

本发明公开了一株适应全悬浮培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用，属于生物技术领域。本发明的一株适应全悬浮培养的MDCK细胞系，命名为MDCK-ZL2012，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6210。本发明还提供了利用所述的细胞系培养流感病毒的方法。本发明所提供的MDCK细胞系实现了MDCK细胞在无血清培养基中的全悬浮培养，因而采用本发明的MDCK细胞系进行流感病毒的培养，一方面增加了流感抗原病毒的产量，降低了流感病毒生产的成本，另一方面也降低了培养流感病毒时的外源因子污染的风险和在疫苗使用引起的应急反应，也使后续病毒处理如澄清、微滤、超滤、纯化等步骤更加简单易行。

说明书

技术领域

本发明涉及一种MDCK细胞系及其应用，特别涉及一种适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感疫苗中的应用。本发明属于生物技术领域。 

背景技术

流感病毒疫苗的制备经过了从动物组织器官到细胞培养的规模化发展过程，动物流感病毒的培养也经历了从鸡胚向哺乳细胞大规模培养，从哺乳动物细胞的微载体悬浮培养到全悬浮培养，从动物源血清的培养到无动物源血清或成分的培养的发展过程，并结合离心纯化以及柱层析纯化，使动物流感病毒或抗原生产方法的可控性提高，也减少了疫苗注射引起的应急反应。从采用的培养基上看，无动物源血清或成分的培养基使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险降低。 

尽管这样，常用的用于培养流感病毒的细胞系仍存在各种缺点，因此仍无法满足目前生产流感病毒疫苗的需求，例如MDCK具有致癌性，Vero、PER-C6的病毒产量较低。因此研究一种安全，高产的细胞基质将是现行流感疫苗工艺研究的重要问题。 

发明内容

本发明提供了一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，还提供了利用所述的细胞系培养流感病毒的方法。 

具体的，本发明采用了以下技术手段： 

本发明的一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，命名为MDCK-ZL2012，分类命名为狗肾细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6210，保藏日期为2012年6月14日。 

本发明还提供了所述的MDCK细胞系在培养流感病毒和生产流感病毒疫苗中的应用。 

本发明的一种培养流感病毒的方法，其特征在于包括以下步骤： 

（1）将所述的MDCK细胞系接种于无血清培养基中进行悬浮培养，得到MDCK细胞悬浮培养液； 

（2）当MDCK细胞悬浮培养液中的细胞密度达到1.0×10⁶~7.0×10⁷个/ml时，按照MOI 0.01-0.1接种流感病毒； 

（3）病毒液在32℃培养3-4天收获病毒上清液，即得流感病毒液。 

在本发明中的一种培养流感病毒的方法中，其特征在于所述的流感病毒为人流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒或犬流感病毒。 

与现有技术相比，本发明的有益之处在于： 

1、本发明的一种适应全悬浮培养的细胞系能够在无其它任何载体的情况下实现细胞的悬浮培养，因此实现了细胞培养密度的最大化，也减少了细胞培养的体积，减少了后续处理的劳动强度，使得各个细胞的产能等同或高出一般的贴壁培养，故而使生产流感病毒的效率提高，减少了时间和成本。 

2、本发明的一种细胞系能够在无动物源性的血清或成分的培养基中生长，因而降低了培养动物流感病毒时的外源因子污染的风险和在疫苗使用引起的应急反应，也使后续病毒处理如澄清、微滤、超滤、纯化等步骤更加简单易行，减少了工作量，更易纯化。 

附图说明

图1为MDCK-ZL2012的细胞生长曲线图； 

图2为不同感染复数接种流感病毒后流感病毒复制的情况。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

本实施例涉及的材料来源： 

1、细胞：MDCK细胞购自ATCC； 

2、病毒：禽流感病毒H5N2、禽流感病毒H1N1，A/盐山/01/2012H5N1、A/唐山/02/2012，H5N1A/邢台/03/2012购自中国疾病控制中心病毒病控制所。 

培养基MEM HAM和F12培养基购买自Invitogen公司，酵母或豆类提取物购买自Invitogen公司 

实施例1适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系的制备 

1、MDCK细胞在无血清或无动物源性的成分的培养基进行适应和驯化，培养基是MEM HAM和F₁₂培养基的混合物，其中加入1.5g/L Na₂CO₃无机盐以及4.0g/L（0.5-8g/L都可）的酵母或豆类提取物。 

2、MDCK细胞以方瓶、转瓶按照1:4或1:6的方式扩大培养，37℃培养5~6天，氧饱和度20%。 

3、传代2-4代，得到明显适应无血清培养的MDCK细胞，用0.25%胰蛋白酶+0.02%的EDTA在室温消化分散。 

4、分散后的MDCK细胞生长推迟，代次周期延至7-9天，传至30-50代次细胞趋于稳定，细胞生长曲线如图1所示。 

5、生物反应器中细胞培养密度的测定（个/ml）。 

用胰酶消化细胞培养液并用细胞计数器对细胞密度进行测定，实验共进行了3次，其结果如表1所示： 

表1全悬浮细胞培养密度的测定 

经筛选，最后得到了一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系，命名为MDCK-ZL2012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6210，保藏日期为2012年6月14日。 

实施例2MDCK-ZL2012生产流感病毒的滴度测定 

MDCK-2012细胞系在无血清或无动物源性的成分的培养基中（培养基是MEMHAM和F₁₂培养基的混合物，其中加入1.5g/L Na₂CO₃无机盐以及0.5-8g/L的酵母 或豆类提取物），在37℃，10%CO₂的培养条件下，采用转速为30-50rpm的转瓶培养细胞3-4天至单层，倒掉培养基，用含有2mg/ml双抗以及3μg/ml胰酶-EDTA的无血清培养基重悬细胞，全悬浮无血清培养MDCK细胞分散至24孔板，以MOI0.01-0.1接种禽流感病毒H5N1的病毒悬液，不同感染复数接种流感病毒后流感病毒复制的情况如图2所示，留有未加病毒液的孔作为空白，34℃培养5天，每孔取300-400μl至Eppendorf管，加入冷的PBS至1ml，5000rpm离心5分钟，弃去上清，沉淀加入100ml冷的预侵液，4℃放置20-25分钟，加入900μl预冷PBS，5000rpm离心5分钟，弃去上清，用350μl的冷的染色液（PBS，1%BSA，0.1％NaAzide，5μlFIFC标记的流感蛋白抗体）重悬沉淀在4℃放置20-30分钟，用1ml预冷的PBS洗涤1-2次，用细胞固定液1ml洗涤1-2次，在4℃贮存或黑暗中保存1周，用流式细胞仪测定病毒滴度，共进行3批次实验，结果如表2所示，或将病毒上清液液氮快速冷冻传-80℃保存。 

表2禽流感病毒滴度 

实施例3流感病毒感染MDCK-ZL2012细胞的噬斑分析 

将实施例2制备得到的流感病毒H5N1的病毒上清液10倍稀释后接种长成单层的MDCK-ZL2012细胞6孔板（培养基采用DMEM+2Mml-谷氨酰胺），37℃培养1小时后，用PBS洗涤3次，加入琼脂糖混合液（1.2ml 2.5%琼酯糖、1.5ml 2倍浓缩的MEM，3μl的200mM L-谷氨酰胺，24μg的胰酶-EDTA，250mlPBS）在10%CO₂，37℃，适宜湿度下，培养3-4天，观察噬斑并计数，该实验说明流感病毒在经驯化适应的MDCK细胞上的生长适应，形成单一的噬斑。 

实施例4采用商用生物反应器悬浮培养MDCK-ZL2012生产流感病毒 

无血清培养基：MEM HAM和F12培养基的混合物，其中加入1.5g/L Na₂CO₃无机盐以及0.5g/L的酵母或豆类提取物。 

无血清培养基高压或过滤除菌，传代45代后的MDCK-ZL2012细胞接种于100ml的无血清培养基中，放入细胞瓶，悬浮细胞以40rpm搅拌1分钟，37摄氏度 培养3小时，后加入200ml无血清培养基，37℃，培养3-5天。 

培养5天后采用搅拌培养，并且每三天后换液或灌注培养，经20天后，液体变黄，细胞生长。当细胞密度达到10×10⁵后，接种10⁷logTCID50/ml的禽流感病毒，32℃，溶解氧25％，pH7.0~7.2培养，培养过程按一定量加入胰蛋白酶，3天后，收获病毒液。培养的禽流感病毒滴度见表3： 

表3MDCK的全悬浮培养的禽流感病毒的滴度 

实施例5禽流感病毒疫苗的制备 

将实施例4制备得到的禽流感病毒经β-丙内酯或1/2000福尔马林溶液灭活，用乳化剂司本，矿物油，吐温-80混合物乳化，制成每剂60μl，灭活前含10⁸EID₅₀/ml病毒抗原。 

实施例6致肿瘤性研究 

MDCK-ZL2012细胞和MDCK细胞扩增培养至1.5×10⁶个，低速离心移去培养基，用PBS重悬细胞使细胞至1.0×10⁸个/ml，经10倍稀释使细胞达到100个/ml，注射5只一组的裸鼠，皮下注射0.1ml，同时设立一组对照注射0.1ml的灭菌PBS，每周观察肿瘤形成，<10mm的肿瘤肉眼观察，大于10mm的用尺测量，采用50%肿瘤形成剂量TPD₅₀计算。结果如表4所示。 

表4肿瘤形成量 

实施例7MDCK-ZL2012的生长型 

每个125ml通气摇瓶接种1.5×10⁵/ml的细胞悬液40ml，总计3-5个，按120rpm转动，采用计数器进行每天细胞计数。结果如表5所示。 

表5细胞密度 

实施例8经细胞或鸡胚培养的流感病毒血凝效价 

使用禽流感病毒分别接种MDCK-ZL2012以及鸡胚，进行血凝效价的测定，结果如表6所示： 

表6经细胞或鸡胚培养的血凝效价比较 

实施例9流感病毒在MDCK-ZL2012细胞上的抗原稳定性 

流感病毒经3-5代后进行HA抗原的基因序列测定和血凝抑制抗体反应（HAI），HAI用96孔板、0.5%的鸡血细胞、4HAU的流感病毒抗原进行。结果如表7、表8所示： 

表7流感病毒在MDCK-ZL2012细胞上传3代的序列 

表8细胞流感和鸡胚流感的血凝抑制效价比较