用于治疗和预防疾病和疾病症状的氟代ω-羧芳基二苯基脲

摘要

本发明涉及用于治疗和预防疾病和疾病症状的氟代ω-羧芳基二苯基脲，具体地，本发明涉及式(I)的化合物：

说明书

本申请是2004年7月22日提交的申请号为PCT/US2004/023500、发明名称为 “用于治疗和预防疾病和疾病症状的氟代ω-羧芳基二苯基脲”的国际申请的分案申请， 所述国际申请于2006年1月23日进入中国国家阶段，其申请号为200480021091.1.

发明领域

本发明涉及新的化合物、包含所述化合物的药物组合物以及将所述化合物或组 合物单独使用或与抗癌药物组合使用用于治疗由异常的VEGFR、PDGFR、raf、p38、 和/或flt-3激酶信号介导的疾病和疾病症状。

发明背景

ras信号转导途径的激活意味着对细胞增殖、分化和转化具有深远影响的事件的 级联反应。作为Ras下游效应子的Raf激酶是将这些信号从细胞表面受体传递到细 胞核的一个关键递质(Lowy，D.R.；Willumsen，B.M.Ann.Rev.Biochem.1993，62， 851；Bos，J.L.Cancer Res.1989，49，4682)。已经证明，通过使用raf激酶的灭活 抗体或显性失活raf激酶或显性失活MEK(raf激酶的底物)的共表达抑制raf激酶信号 途径而抑制活化ras的作用会导致转化的细胞恢复为正常的生长表型(参见Daum等， Trends Biochem.Sci.1994，19，474-80；Fridman等，J.Biol.Chem.1994，269，30105-8)。 Kolch等(Nature1991，349，426-28)进一步证明了通过反义RNA对raf表达的抑制阻 断了膜相关致癌基因引起的细胞增殖。同样地，在试管实验和体内实验中已经证实 raf激酶的抑制(通过反义寡核苷酸)与多种人类肿瘤类型的生长抑制是相关的(Monia 等，Nat.Med.1996，2，668-75)。

维持大小超过1-2mm³的肿瘤细胞的持续肿瘤生长需要功能性间质，这是包括成 纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、细胞外基质蛋白质和可溶因子的支持结构 (Folkman，J.，Semin Oncol，2002.29(6增刊16)，15-8)。肿瘤通过分泌诸如PDGF 和转化生长因子β(TGF-β)等可溶性生长因子引起间质组织的形成，所述生长因子各 自刺激宿主细胞分泌诸如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和血管内 皮生长因子(VEGF)等互补因子。这些刺激因子引起新的血管生成(angiogenesis)，这 向肿瘤提供氧和营养物质并使其生长以及为肿瘤转移提供路线。相信针对抑制间质 形成的一些治疗方法会对源自多种组织学类型的上皮肿瘤的生长加以抑制(George， D.Semin Oncol，2001.28(5增刊17)，27-33；Shaheen，R.M.等，Cancer Res，2001.61(4)， 1464-8；Shaheen，R.M.等，Cancer Res，1999.59(21)，5412-6)。然而，由于其性质 的复杂性以及多种生长因子参与血管生成过程和肿瘤恶化，一种针对单一信号途径 的物质可能仅有有限的功效。希望能对肿瘤在宿主间质中用于引发血管生成的多个 关键信号途径提供治疗方法。这些途径包括PDGF(间质形成的有效刺激因 子)(Ostman，A.和C.H.Heldin，Adv Cancer Res，2001，80，1-38)、FGF(成纤维细胞 和内皮细胞的化学趋化因子和促有丝分裂素)和VEGF(血管形成的有效调节因子)。

PDGF是间质形成的一种关键调节因子，它由多种肿瘤以旁分泌形式分泌并促进 成纤维细胞、平滑肌及内皮细胞的生长，从而促进间质形成及血管生成。PDGF最初 是作为猿猴肉瘤病毒的v-sis致癌基因产物得以鉴定(Heldin，C.H.等，J Cell Sci Suppl， 1985，3，65-76)。该生长因子由被称为A链或B链的2条肽链构成，肽链一级氨基 酸序列具有60％的同源性。肽链经二硫键相连形成由AA、BB或AB同源或异源二 聚体组成的30kDa的成熟蛋白。在血小板中发现了高水平的PDGF，并且PDGF可 由内皮细胞和血管平滑肌细胞表达。此外，在诸如血管形成不足的肿瘤组织中所发 现的低氧条件下PDGF的产生得以上调(Kourembanas，S.等，Kidney Int，1997，51(2)， 438-43)。PDGF以高亲和力与PDGF受体(PDGFR)结合，该受体是1106个氨基酸构 成的124kDa的跨膜酪氨酸激酶受体(He1din，C.H.，A.Ostman和L.Ronnstrand， Biochim Biophys Acta，1998.1378(1)，79-113)。PDGFR是同源或异源二聚体肽链形 式的，肽链在其氨基酸序列上总地具有30％的同源性，并且在其激酶结构域之间具 有64％的同源性(Heldin，C.H.等，Embo J，1988，7(5)，1387-93)。PDGFR是具有 分开的激酶结构域的酪氨酸激酶受体家族的成员，该家族包括VEGFR2(KDR)、 VEGFR-3(flt-4)、c-Kit和flt-3。PDGFR主要在成纤维细胞、平滑肌细胞和周细胞 (pericyte)上表达，并在神经细胞、肾小球细胞、Leydig细胞和中枢神经系统的Schwann 细胞上少量表达。一旦与受体结合，PDGF引起受体二聚化并经历酪氨酸残基的自我 磷酸化和相互磷酸化，这能提高受体的激酶活性并促进下游效应因子通过激活SH2 蛋白结合结构域的募集。包括PI-3激酶、磷酯酶C-γ、src和GAP(针对p21-ras的三 磷酸鸟苷酸酶激活蛋白)在内的多种信号分子与激活的PDGFR形成复合物(Soskic， V.等，Biochemistry，1999，38(6)，1757-64)。通过激活PI-3激酶，PDGF激活Rho 细胞途径从而引起细胞运动和迁移，并通过激活GAP引起通过p21-ras和MAPK信 号途径激活的有丝分裂。

在成人中，PDGF的主要作用是促进并提高伤口愈合的速度并保持血管的体内平 衡(Baker，E.A.和D.J.Leaper，Wound Repair Regen，2000.8(5)，392-8；Yu，J.，A.Moon 和H.R.Kim，Biochem Biophys Res Commun，2001.282(3)，697-700)。在血小板中发 现了高浓度的PDGF，它对于成纤维细胞、平滑肌细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞而 言是一种有效的化学趋化因子。除了其在伤口愈合中的作用之外，PDGF帮助保持血 管的体内平衡。在新生血管发育过程中，PDGF募集血管结构完整性所需要的周细胞 和平滑肌细胞。PDGF被认为在肿瘤新生血管形成中发挥相似的作用。作为其在血管 生成中所起作用的一部分，PDGF通过其对结缔组织细胞和细胞外基质之间相互作用 的调节调节血管的渗透性而控制组织间隙的流体压力。抑制PDGFR的活性可以降低 组织间隙的压力并促进细胞毒素流入肿瘤而提高这些物质的抗肿瘤功效(Pietras，K. 等，Cancer Res，2002.62(19)，5476-84；Pietras，K.等，Cancer Res，2001.61(7)， 2929-34)。

PDGF可以通过旁分泌或自分泌直接刺激间质细胞或肿瘤细胞上的PDGFR或通 过受体的信号放大或经重组激活受体而促进肿瘤生长。过表达的PDGF可以使人的 黑素瘤细胞和角质化细胞这两种不表达PDGF受体的细胞类型可能通过PDGF对间 质形成和诱导血管生成的直接作用而发生转化(Forsberg，K.等，Proc Natl Acad Sci U SA.，1993.90(2)，393-7；Skobe，M.和N.E.Fusenig，Proc Natl Acad Sci USA，1998. 95(3)，1050-5)。在其中肿瘤表达PDGF但不表达受体的结肠癌、肺癌、乳癌和前列 腺癌等肿瘤中也观察到了这种肿瘤间质的旁分泌刺激(Bhardwaj，B.等，Clin Cancer  Res，1996，2(4)，773-82；Nakanishi，K.等，Mod Pathol，1997，10(4)，341-7；Sundberg， C.等，Am J Pathol，1997，151(2)，479-92；Lindmark，G.等，Lab Invest，1993，69(6)， 682-9；Vignaud，J.M.等，Cancer Res，1994，54(20)，5455-63)。在神经胶母细胞瘤 (Fleming，T.P.等，Cancer Res，1992，52(16)，4550-3)、软组织瘤(Wang，J.，M.D.Coltrera 和A.M.Gown，Cancer Res，1994，54(2)，560-4)以及卵巢癌(Henriksen，R.等，Cancer  Res，1993，53(19)，4550-4)、前列腺癌(Fudge，K.，C.Y.Wang和M.E.Stearns，Mod  Pathol，1994，7(5)，549-54)、胰腺癌(Funa，K.等，Cancer Res，1990，50(3)，748-53) 和肺癌(Antoniades，H.N.等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(9)，3942-6)中已经 报道了对肿瘤细胞生长的自分泌刺激，其中大部分经分析的肿瘤细胞表达PDGF配 体和受体。非配体依赖型的受体激活发现地较少，但在慢性粒单核细胞白血病(CMML) 中已有报道，其中a染色体易位在类Ets转录因子TEL和PDGF受体之间形成融合 蛋白。此外，在胃肠道间质瘤中已经发现了与c-Kit激活无关的PDGFR中的激活突 变(Heinrich，M.C.等，Science，2003，9，9)。PDGFR抑制剂能干扰肿瘤间质发育并 抑制肿瘤生长和转移而没有过度的副作用。

血管内皮生长因子(VEGF，也被称为血管渗透性因子VPF)是另一种在胚胎发育 和有些血管生成依赖的疾病中血管新生和血管发生的主要调节因子。VEGF代表由于 选择性RNA剪接而以同源二聚体形式存在的促有丝分裂原异构体家族。VEGF异构 体对于血管内皮细胞来说是高度特异的(参见Farrara等，Endocr.Rev.1992，13，18； Neufield等，FASEB J.1999，13，9)。

VEGF表达受缺氧(Shweiki等，Nature1992，359，843)以及诸如白介素1、白介 素6、表皮生长因子和转化生长因子等多种细胞因子和生长因子诱导。目前已经报道， VEGF和VEGF家族成员与以下三种跨膜受体酪氨酸激酶中的一种或多种结合 (Mustonen等，J.Cell Biol.，1995，129，895)；VEGF受体1(也称为flt-1(类fms酪 氨酸激酶1))、VEGFR-2(也称为含激酶插入结构域受体(KDR)，KDR的小鼠类似物 称作胎肝激酶1(flk-1))和VEGFR-3(也称为flt-4)。已经证实，VEGFR-2和flt-1具有 不同的信号转导性质(Waltenberger等，J.Biol.Chem.1994，269，26988；Park等， Oncogene1995，10，135)。因此，VEGFR-2在完整细胞中经历配体依赖的强酪氨酸 磷酸化，而flt-1表现出弱应答。因此，相信对于诱导全范围的VEGF介导的生物学 应答而言，与VEGFR-2结合是关键要求。

VEGF在体内血管发生中发挥中心作用，并引起血管新生和血管渗透化。不加调 节的VEGF表达引发多种疾病，其特征是不正常的血管新生和/或高渗透性作用。相 信有些物质对VEGF介导的信号转导级联的调节能对不正常的血管新生和/或高渗透 性作用提供有效控制。肿瘤低氧区域内的肿瘤化细胞通过刺激VEGF生产作出反应， 这引起沉默的内皮细胞的激活以刺激新的血管形成(Shweiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.， 1995，92，768)。此外，在没有血管新生的肿瘤区域中的VEGF产生可以推动ras信 号转导途径(Grugel等，J.Biol.Chem.，1995，270，25915；Rak等，Cancer Res.1995， 55，4575)。原位杂交研究表明，在包括肺癌(Mattern等，Br.J.Cancer1996，73，931)、 甲状腺癌(Viglietto等，Oncogene1995，11，1569)、乳癌(Brown等，Human Pathol.1995， 26，86)、胃肠道肿瘤(Brown等，Cancer Res 1993，53，4727；Suzuki等，Cancer Res. 1996，56，3004)、肾及膀胱肿瘤(Brown等，Am.J.Pathol.1993，1431，1255)、卵巢 癌(Olson等，Cancer Res.1994，54，1255)、宫颈癌(Guidi等，J.Natl Cancer Inst.1995， 87，12137)以及血管瘤(Hashimoto等，Lab.Invest.1995，73，859)和几种颅内肿瘤(Plate 等，Nature1992，359，845；Phillips等，Int.J.Oncol.1993，2，913；Berkman等， J.Clin.Invest.，1993，91，153)在内的各种人类肿瘤中VEGF mRNA的显著上调。中 和性VEGFR-2单克隆抗体在阻断肿瘤血管新生中被证明是有效的(Kim等，Nature 1993，362，841；Rockwell等，Mol.Cell.Differ.1995，3，315)。

VEGF的过表达(例如在极端缺氧条件下)可以引起眼球内血管新生，导致血管过 量增生，最终导致失明。已经在包括糖尿病视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞和早 产儿视网膜病(Aiello等，New Engl.J.Med.1994，331，1480；Peer等，Lab.Invest.1995， 72，638)和老年黄斑病变(AMD，参见Lopez等，Invest.Opththalmol.Vis.Sci.1996， 37，855)在内的多种视网膜病中观察到了这样的级联反应。

在风湿性关节炎(RA)中，血管生成因子的产生可以介导血管翳的内向生长。RA 患者的滑液中具有高水平的免疫反应性VEGF，而在其他形式关节炎或退化性关节疾 病患者的滑液中VEGF水平低下(Koch等，J.Immunol.1994，152，4149)。在大鼠胶 原诱导型关节炎模型中已经证实，血管生成抑制剂AGM-170阻碍关节中的新血管形 成(Peacock等，J.Exper.Med.1992，175，1135)。

在银屑病以及诸如大疱性类天疱疮、多形红斑和疱疹样皮炎等与表皮下疱疹形成 相关的疱疹类疾病中也表现出VEGF表达的提高(Brown等，J.Invest.Dermatol.1995， 104，744)。

血管内皮生长因子(VEGF、VEGF-C、VEGF-D)及其受体(VEGFP2、VEGFR3)不 仅是肿瘤血管生成、而且是淋巴管生成的关键调控因子。VEGF、VEGF-C和VEGF-D 在大部分肿瘤中主要在肿瘤生长期间并经常以充分提高的水平表达。VEGF表达受缺 氧、细胞因子、诸如ras的致癌基因或通过肿瘤抑制基因的灭活的刺激(McMahon， G.Oncologist2000，5(增刊1)，3-10；McDonald，N.Q.；Hendrickson，W.A.Cell 1993， 73，421-424)。

VEGF的生物学活性通过与其受体的结合得以介导。VEGFR3(也称为flt-4)主要在 正常成人组织中的淋巴管内皮细胞上表达。对于新的淋巴管形成需要VEGFR3功能， 但对于维持已存在的淋巴管则不需要。VEGFR3在肿瘤的血管内皮细胞上也是上调 的。最近，VEGFR3的配体VEGF-C和VEGF-D被确定为哺乳动物中淋巴管生成的 调节因子。肿瘤相关的淋巴管生成因子诱导的淋巴管生成可能促进新的导管生长进 入肿瘤，这为肿瘤细胞提供了进入系统循环的通道。侵入淋巴管的细胞可能通过胸 导管进入血液循环。肿瘤表达研究已经允许对VEGF-C、VEGF-D和VEGFR3表达 与同原发肿瘤扩散能力直接相关的临床病理学因素(例如淋巴结转移、淋巴管侵入、 继发性转移和无病生存期)进行直接比较。在许多情况下，这些研究说明了淋巴管生 成因子表达和原发性实体肿瘤转移能力之间的统计学相关性(Skobe，M.等，Nature  Med.2001，7(2)，192-198；Stacker，S.A.等，Nature Med.2001，7(2)，186-191；Makinen， T.等，Nature Med.2001，7(2)，199-205；Mandriota，S.J.等，EMBO J.2001，20(4)， 672-82；Karpanen，T.等，Cancer Res.2001，61(5)，1786-90；Kubo，H.等，Blood 2000，96(2)，546-53)。

对于恶性细胞中VEGF产生而言，缺氧看来是一种重要的刺激因子。对于肿瘤细 胞对缺氧产生应答而诱导VEGF来说，需要p38MAP激酶的激活(Blaschke，F.等， Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，296，890-896；Shemirani，B.等，Oral Oncology 2002，38，251-257)。除了通过调节VEGF分泌而参与血管生成以外，p38MAP激 酶通过调节胶原酶活性和尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂表达促进恶性细胞侵入和不 同肿瘤类型的迁移(Laferriere，J.等，J.Biol.Chem.2001，276，33762-33772； Westermarck，J.等，Cancer Res.2000，60，7156-7162；Huang，S.等，J.Biol.Chem. 2000，275，12266-12272；Simon，C.等，Exp.Cell Res.2001，271，344-355)。

促有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)p38的抑制被证明能在试管和/或体内抑制细 胞因子形成(例如TNF、IL-1、IL-6、IL-8)和蛋白酶产生(例如MMP-1、MMP-3)。促 有丝分裂原激活蛋白激酶p38参与IL-1和TNF信号途径(Lee，J.C；Laydon，J.T.； McDonnell，P.C；Gallagher，T.F.；Kumar，S.；Green，D.；McNulty，D.；Blumenthal， M.J.；Heys，J.R.；Landvatter，S.W.；Strieker，J.E.；McLaughlin，M.M.；Siemens， I.R.；Fisher，S.M.；Livi，G.P.；White，J.R.；Adams，J.L.；Yound，P.R.Nature 1994，372，739)。

临床研究已经将肿瘤坏死因子(TNF)产生和/或向包括类风湿性关节炎(Maini.J. Royal Coll.Physicians London 1996，30，344)在内的多种疾病联系了起来。此外，在 多种炎性和/或免疫调节类疾病中发现了过量水平的TNF。这些疾病包括急性风湿热 (Yegin等，Lancet l997，349，170)、骨吸收(Pacifici等，J.Clin.Endocrinol.Metabol. 1997，52，29)、绝经后骨质疏松(Pacifici等，J.Bone Mineral Res.1996，11，1043)、 脓血症(Blackwell等，Br.J.Anaesth.1996，77，110)、格兰氏阴性脓血症(Debets等， Prog.Clin.Biol Res.1989，308，463)、脓毒性休克(Tracey等，Nature l987，330， 662；Girardin等，New England Med.1988，319，397)、内毒性休克(Beutler等，Science 1985，229，869；Ashkenasi等，Proc.Nat′I.Acad.Sci.USA1991，88，10535)、 中毒休克症(Saha等，J.Immunol.1996，157，3869；Lina等，FEMS Immunol.Med. Microbiol.1996，13，81)、全身性炎症反应症(Anon，Crit.Care Med.1992，20， 864)、包括克罗恩病(Crohn′s disease)(van Deventer等，Aliment.Pharmacol Therapeu. 1996，10(增刊2)，107；van Dullemen等，Gastroenterology1995，109，129)和溃 疡性肠炎(Masuda等J.Clin.Lab.Immunol.1995，46，111)在内的炎性肠病(Stoldcers 等，J.Inflamm.1995-6，47，91)、雅里希-赫克斯海默反应(Fekade等，New England J. Med.1996，335，311)、哮喘(Amrani等，Rev.Malad.Respir.1996，13，539)、成 人呼吸窘迫症(Roten等，Am.Rev.Respir.Dis.1991，143，590；Suter等，Am.Rev. Respir.Dis.1992，145，1016)、急性肺部纤维化病(Pan等，Pathol.Int.1996，46， 91)、肺部肉瘤病(Ishioka等，Sarcoidosis Vasculitis Diffuse Lung Dis.1996，13，139)、 过敏性呼吸道疾病(Casale等，Am.J.Respir.Cell Mol Biol.1996，15，35)、硅肺病 (Gossart等，J.Immunol.1996，156，1540；Vanhee等，Eur.Respir.J.1995，8，834)、 煤矿工人肺尘症(Borm等，Am.Rev.Respir.Dis.19S8，138，1589)、肺泡损伤 (Horinouchi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1996，14，1044)、肝功能衰竭(Gantner 等，J.Pharmacol.Exp.Therap.1997，280，53)、急性炎症中的肝脏疾病(Kim等，J. Biol.Chem.1997，272，1402)、重症酒精性肝炎(Bird等，Ann.Intern.Med.1990， 112，917)、包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)疟疾(Perlmann等，Infect.Immunit. 1997，65，116)和脑型疟疾(Rudin等，Am.J.Pathol1997，150，257)在内的疟疾(Grau 等，Immunol Rev.1989，112，49；Taveme等，Parasitol.Today1996，12，290)、非 胰岛素依赖型糖尿病(Stephens等，J.Biol.Chem.1997，.272，971；Ofei等，Diabetes 1996，45，881)、充血性心脏衰竭(Doyarna等，Int.J.Cardiol.1996，54，217；McMurray 等，Br.Heart J.1991，66，356)、心脏病后损伤(Malkiel等，Moi Med.Today1996，2， 336)、动脉硬化症(Parums等，J.Pathol.1996，179，446)、阿尔茨海默病(Fagarasan 等，Brain Res.1996，723，231；Aisen等，Gerontology1997，43，143)、急性脑炎 (Ichiyama等，J.Neurol 1996，243，457)、脑损伤(Cannon等，Crit.Care Med.1992， 20，1414；Hansbrough等，Surg.din.N.Am.1987，67，69；Marano等，Surg.Gynecol. Obstetr.1990，170，32)、包括多发性硬化中脱髓鞘和寡树突细胞丢失(Brosnan等， Brain Pathol.1996，6，243)的多发性硬化(M.S.Coyle，Adv.Neuroimmunol.1996，6， 143；Matusevicius等，J.Neuroimmunol.1996，66，115)、晚期肿瘤(MucWierzgon 等，J.Biol.Regulators Homeostatic Agents 1996，10，25)、恶性淋巴癌(Levy等，Crit. Rev.Immunol.1996，16，31)、包括急性胰腺炎中的全身性并发症(McKay等，Br.J.Surg. 1996，S3，919)在内的胰腺炎(Exley等，Gut1992，33，1126)、感染、炎症和癌症 中的伤口愈合弱化(Buck等，Am.J.Pathol.1996，149，195)、骨髓增生异常综合征 (Raza等，Int.J.Hematol.1996，63，265)、系统性红斑狼疮(Maury等，Arthritis Rheum. 1989，32，146)、胆汁性肝硬化(Miller等，Am.J.Gasteroenterolog.1992，87，465)、 肠坏死(Sun等，J.Clin.Invest.1988，81，1328)、银屑癣(Christophers.Austr.J.Dermatol. 1996，37，84)、辐射损伤(Redlich等，J.Immunol.1996，157，1705)以及给予单克 隆抗体(如OKT3)后的毒性反应(Brod等，Neurology1996，46，1633)。TNF水平也 与宿主-移植物反应相关(Piguet等，Immunol Ser.1992，56，409)，这些反应包括缺 血-再灌注损伤(Colletti等，J.Clin.Invest.1989，55，1333)以及包括肾脏(Maury等， Exp.Med.1987，166，1132)、肝脏(Imagawa等，Transplantation1990，50，219)、 心脏(Boiling等，Transplantation1992，53，283)和皮肤(Stevens等，Transplant.Proc. 1990，22，1924)在内的同种异体移植物排斥、包括慢性肺同种异体移植物排斥(闭塞 性支气管炎，LoCicero等，J.Thome.Cardiovasc.Surg.1990，99，1059)在内的肺同 种异体移植物排斥(Grossman等，Immunol.Allergy Clin.N.Am.1989，9，153)以及 全髋置换引起的并发症(Cirino等，Life Sci、1996，59，86)。TNF也与感染性疾病相 关(参见Beutler等，Crit.Care Med.1993，21，5423；Degre.Biotherapy1996，8，219)， 这些疾病包括肺结核(Rook等，Med.Malad.Infect.1996，26，904)、胃溃疡过程中 的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染(Beales等，Gastroenterology1997，112， 136)、由枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)引起的夏格氏病(Chaga′s disease)(Chandrasekar 等，Biochem.Biophys.Res、Commun.1996，223，365)、大肠杆菌感染引起的志贺样 毒素(shiga-like toxin)作用(Harel等，Clin.Invest.1992，56，40)、由葡萄球菌感染引 起的肠毒素A作用(Fischer等，J.Immunol.1990，144，4663)、脑膜炎感染(Waage等， Lancet1987，355；Ossege等，J.Neurolog.Sci.1996，144，1)、以及莱姆病螺旋体 (Borrelia burgdorferi)(Brandt等，Infect.Immunol.1990，55，983)、钩端螺旋体 (Treponema Pallidum)(Chamberlin等，Infect，Immunol.1989，57，2872)、细胞巨化 病毒(CMV；Geist等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1997，16，31)、流感病毒(Beutler 等，Clin.Res.1986，34，491a)、仙台病毒(Goldfield等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 1989，87，1490)、泰勒脑脊髓炎病毒(Sierra等，Immunology1993，78，399)以及 人HIV病毒(Poli.Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA1990，87，782；Vyakaram等，AIDS1990， 4，21；Badley等，J.Exp.Med.1997，185，55)引起的感染。

许多疾病被认为是由过量的或不需要的基质破坏性金属蛋白酶(MMP)活性或由 MMP与金属蛋白酶的组织抑制剂(TMP)的比例失衡所介导的。这些疾病包括骨关节 炎(Woessner等，J.Biol.Chem.1984，259，3633)、风湿性关节炎(Mullins等，Biochim. Biophys.Acta1983，695，117；Woolley等，Arthritis Rheum.1977，20，1231；Gravallese 等，Arthritis Rheum.1991，34，1076)、脓毒性关节炎(Williams等，Arthritis Rheum.1990， 33，533)、肿瘤转移(Reich等，Cancer Res.1988，48，3307；Matrisian等，Proc.Nat′l. Acad.Sci，USA1986，83，9413)、牙周病(Overall等，J.Periodontal Res.1987，22， 81)、角膜脱落(Burns等，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.1989，30，1569)、蛋白尿症(Baricos 等，Biochem.J.1988，254，609)、动脉粥样硬化斑块破裂引起的冠状动脉血栓(Henney 等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，USA1991，55，8154)、主动脉瘤(Vine等，Clin.Sci.1991， 81，233)、不孕(Woessner等，Steroids 1989，54，491)、营养不良性大疱性表皮松 解(Kronberger等，J.Invest.Dermatol.19S2，79，208)、创伤性关节损伤后的退化性 软骨缺失、MMP活性介导的骨质疏松、颌骨关节病以及神经系统的脱髓鞘病(Chantry 等，J.Neurochem.1988，50，688)。

由于抑制p38导致TNF形成和MMP形成的抑制，相信抑制促有丝分裂原激活蛋 白激酶p38能够提供治疗诸如类风湿性关节炎和COPD的包括骨质疏松和炎症疾病 在内的上述疾病的手段(Badger，A.M.；Bradbeer，J.N.；Votta，B.；Lee，J.C；Adams， J.L.；Griswold，D.E.J.Pharm.Exper.Ther.1996，279，1453)。

对于恶性细胞中VEGF产生而言，缺氧看来是一种重要的刺激因子。对于肿瘤细 胞对缺氧产生应答而诱导VEGF来说，需要p38MAP激酶的激活(Blaschke，F.等， Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，296，890-896；Shemirani，B.等，Oral Oncology 2002，38，251-257)。除了通过调节VEGF分泌而参与血管生成以外，p38MAP激 酶通过调节胶原酶活性和尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂表达促进恶性细胞侵入和不 同肿瘤类型的迁移(Laferriere，J.等，J.Biol.Chem.2001，276，33762-33772； Westermarck，J.等，Cancer Res.2000，60，7156-7162；Huang，S.等，J.Biol.Chem. 2000，275，12266-12272；Simon，C.等，Exp.Cell Res.2001，271，344-355)。因此， 也希望抑制p38激酶通过干扰与血管生成和恶性细胞侵入相关的信号级联影响肿瘤 生长。

对某些脲所具有的丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂和/或酪氨酸激酶抑制剂活性已经进 行了描述。尤其是已经证实了将某些脲作为药物组合物的活性成分用于对癌症、血 管生成疾病、炎性疾病的治疗。

对于癌症和血管生成，可以参见：

Smith等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，2775-2778.

Lowinger等，Clin.Cancer Res.2000，6(增刊)，335.

Lyons等，Endocr.-Relat.Cancer2001，8，219-225.

Riedl等，摘要集，92次AACR会议，新奥尔良，LA，USA，摘要4956(Book of  Abstracts，92^nd AACR Meeting，New Orleans，LA，USA，abstract4956)

Khire等，摘要集，93次AACR会议，旧金山，CA，USA，摘要4211(Book of  Abstracts，93^rd AACR Meeting，San Francisco，CA，USA，abstract42ii).

Lowinger等，Curr.Pharm.Design2002，8，99-110.

Carter等，摘要集，92次AACR会议，新奥尔良，LA，USA，摘要4954(Book of  Abstracts，92^nd AACR Meeting，New Orleans，LA，USA，abstract4954).

Vincent等，摘要集，38次ASCO会议，奥兰多，FL，USA，摘要1900(Book of  Abstracts，38^th ASCO Meeting，Orlando，FL，USA，abstract1900).

Hilger等，摘要集，38次ASCO会议，奥兰多，FL，USA，摘要1916(Book of  Abstracts，38^th ASCO Meeting，Orlando，FL，USA，abstract1916).

Moore等，38次ASCO会议，奥兰多，FL，USA，摘要1816(Book of Abstracts， 38^th ASCO Meeting，Orlando，FL，USA，abstract 1816).

Strumberg等，38次ASCO会议，奥兰多，FL，USA，摘要121(Book of Abstracts， 38^th ASCO Meeting，Orlando，FL，USA，cbstract121).

对于包括炎症疾病在内的p38介导的疾病，参见：

Redman等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，9-12.

Dumas等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10，2047-2050.

Dumas等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10，2051-2054.

Ranges等，摘要集，第220届ACS全国会议，华盛顿特区，USA，MEDI149(Book  of Abstracts，220thACS National Meeting，Washington，DC，USA，MEDI149).

Dumas等，Bioorg.Med Chem.Lett.2002，12，1559-1562.

Regan等，J.Med.Chem.2002，45，2994-3008.

Pargellis等，Nature Struct.Biol.2002，9(4)，268-272.

Madwed JB，摘要集，蛋白激酶：针对治疗手段发展的新的靶点的鉴别和确认， 圣地亚哥，CA，USA，2002年3月(Book of Abstracts，Protein Kinases：Novel Target  Identification and Validation for Therapeutic Development，San Diego，CA，USA，March 2002).

Pargellis C等，Curr.Opin.Invest.Drugs2003，4，566-571.

Branger J.等，J.Immunol2002，168，4070-4077

Branger J.等，Blood2003，101，4446-4448

ω-羧芳基二苯基脲揭示于2000年7月20日公开的WO00/42012、2000年7月20 日公开的WO00/41698和以下公开的美国申请：

2002年11月7日公开的US2002-0165394-A1，

2001年10月25日公开的US2001-003447-A1，

2001年8月23日公开的US2001-0016659-A1，

2002年9月26日公开的US2002-013774-A1，

以及未决美国申请：

2001年1月12日提交的09/758,547，

2001年7月12日提交的09/889,227，

2001年11月27日提交的09/993,647，

2002年1月11日提交的10/042,203，以及

2002年2月11日提交的10/071,248，

发明描述

已经发现，如下式I所述的具有与尿素结合的2-氟-4-(2-(N-甲基氨甲酰基)-4-吡啶 氧基)亚苯基基团的ω-羧芳基二苯基脲是raf激酶、VEGFR激酶、p38激酶以及PDGFR 激酶的有效抑制剂，所述激酶都是对治疗和预防包括癌症在内的骨质疏松、炎性疾 病、过度增殖性疾病和血管生成疾病而言感兴趣的分子靶点。

本发明提供了：

(i)具有式(I)的新的化合物，及其盐、前药和代谢物，

(ii)包含这样的化合物的药物组合物，以及

(iii)将所述化含物或组合物作为单一药剂或与细胞毒疗法结合用于治疗由 raf、VEGFR、PDGFR、flt-3和p38介导的疾病以及疾病症状。

具有下式I的化合物及其盐、前药和代谢物统称为“本发明所述化合物”。式I如 下所示：

本发明所述化合物的代谢物包括式I的氧化衍生物，其中一个或多个尿素的氮原 子被羟基取代。本发明所述化合物的代谢物也包括类似物，其中式I所述化合物的甲 基酰胺基团通过代谢降解去甲基化。本发明所述化合物的代谢物还包括其中吡啶基 团的氮原子可以是氧化物形式的(或具有羟基取代的)并包括本领域内那些称为1-氧 代-吡啶和1-羟基-吡啶结构的氧化衍生物。

在这里使用化合物、盐等等单词的复数形式的情况下，也用以表示单一的化合物、 盐等等。

本发明范围内也包括使用如式I所述化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可 接受的盐”是指本发明所述化合物的相对无毒的、无机或有机酸加成盐。例如参见S. M.Berge等的《药物盐》(Pharmaceutical Salts)，J.Pharm.Sci.1977，66，1-19。

本发明所述化合物的典型的盐包括传统的无毒的盐，例如通过本领域熟知的方 法从无机或有机酸获得的盐。例如诸如包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸 盐、天门冬氨酸盐、安息香酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑 酸盐、樟脑磺酸盐、肉桂酸盐、环戊丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、羟 乙磺酸、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐 酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、衣康酸盐、乳酸盐、马来酸盐、扁 桃酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸 盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、 酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸和十一酸盐在内的酸加成盐。

式I所述的化合物的盐或前药可以含有一个或多个不对称中心。不对称碳原子可 以以(R)或(S)构象或(R，S)构象存在。环上的取代基也可以以顺式(cis)或反式(trans)形 式存在。所有这样的构象(包括对映体和非对映异构体)包含在本发明范围以内。优选 的异构体是那些具有产生更需要的生物学活性的构象的异构体。分离的、纯的或部 分纯化的异构体或本发明所述化合物的消旋混合物也包含在本发明范围以内。使用 本领域内已知的常规技术可以实现所述异构体的纯化和所述异构混合物的分离。

实施例1中对本发明的所述实施方式中使用的化合物的制备中所采用的具体工艺 进行了描述。实施例2、3和4中描述了式I所述化合物的盐的形式。

使用方法

本发明提供了能调节涉及raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3激酶的一条或多 条信号转导途径的化合物。Raf是参与包括细胞生长、细胞存活和侵入在内的许多重 要的细胞过程的调控的重要的信号分子。它是Ras/raf/MEK/ERK途径成员。这一途 径存在于大部分肿瘤细胞中。VEGFR、PDGFR和flt-3是跨膜的受体分子，当其受 到适当的配体刺激会触发Ras/raf/MEK/ERK细胞信号途径，导致细胞内级联反应。 这些受体分子都具有酪氨酸激酶活性。

VEGFR受体受血管内皮生长因子(VEGF)刺激，并且是内皮细胞发育和功能调节 中的重要控制点。PDGFβ受体在包括间叶细胞在内的多种细胞类型中调节细胞增殖 和存活。Flt-3是FL配体的受体。其结构类似于c-kit，并调节多能造血细胞的生长， 从而影响T细胞、B细胞和树突细胞的发育。

包括野生型和突变型在内的raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3的任何基因或 异构体可以按照本发明进行调节。Raf或raf-1激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，它包 括至少3个家族成员(a-raf、b-raf和c-raf或raf-1)。参见例如Dhillon和Kolch，Arch. Biochem.Biophys.2002，404，3-9。C-raf和b-raf是本发明所述化合物的优选靶点。 在包括黑素瘤在内的多种肿瘤中鉴别了b-raf的激活突变(例如V599E突变体)，并且 这里所描述的化合物可以用于抑制其活性。

术语“调节”是指与所述化合物不存在时的正常活性相比改变了所述途径(或其组 分)的功能活性。这一作用包括任何数量或程度上的调节，这包括提高、激活、增强、 增加、促进、刺激、降低、阻碍、抑制、减少、减小、拮抗等等。

本发明所述化合物也可以调节以下一个或多个过程，这些过程包括但不限于例如 细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤细胞生长(包括例如分化、细胞 存活和/或增殖)、肿瘤消退、内皮细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、血 管生成(血管生长)、淋巴管生成(淋巴管生长)和/或造血功能(例如T细胞和B细胞发 育、树突细胞发育等等)。

虽然不希望受到任何作用机理或机制的束缚，已经发现本发明所述化合物具有调 节激酶活性的能力。然而，本发明所述的方法不局限于任何具体机制或所述化合物 如何实现其治疗作用。术语“激酶活性”是指其中将一个γ磷酸根从三磷酸腺苷(ATP) 转移到蛋白底物中的一个氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)上的催化活性。 化合物可以调节激酶活性，例如通过直接与ATP竞争激酶的ATP结合位点抑制其活 性、通过在酶的结构上产生构象变化影响其活性(例如通过破坏具有生物学活性的三 维结构)等等。

使用常规检测方法可以对激酶活性进行常规测定。激酶检测系统通常包括激酶、 底物、缓冲液和检测系统组分。典型的激酶检测方法包括蛋白激酶与底物肽和如 P-ATP的ATP反应以产生磷酸化的终产物(例如在使用底物肽时的磷酸化蛋白)。可以 使用任何适当的方法对最终产物进行检测。当使用放射性ATP时，使用亲和膜或凝 胶电泳可以将放射性标记的磷酸化蛋白与未反应的γ-³²P-ATP分离，并随后使用放 射自显影在凝胶上显影或使用闪烁计数器检测。也可以使用非放射性方法。可以使 用识别磷酸化底物的抗体(例如抗磷酸酪氨酸抗体)。例如，激酶可以与底物在存在 ATP和激酶缓冲液并且所述激酶有效磷酸化所述底物的条件下孵育。可以分离反应 混合物(例如通过电泳)，并随后可以检测底物的磷酸化(例如通过使用抗磷酸酪氨酸 抗体的免疫印迹法)。所述抗体可以用可检测的标记物标记(例如诸如HRP的酶、亲 和素或生物素、化学发光试剂等等)。其他的方法可以采用ELISA、亲和膜分离、荧 光偏振法、发光法等等。

放射性形式之外的另一种方法是时间分辨荧光共振能量传递(TR-FRET)。所述方 法按照常规激酶反应，其中底物(例如生物素化的聚(谷氨酸酪氨酸))被蛋白磷酸在 ATP存在的条件下磷酸化。最终产物随后可以用铕螯合的磷酸特异性抗体(抗磷酸酪 氨酸或磷酸丝氨酸/苏氨酸)和与生物素化底物结合的链亲和素-APC进行检测。上述 两个组分在结合时在空间上靠近，并且从磷酸特异性抗体向受体(SA-APC)的能量传 递产生均一形式的荧光读数。

本发明所述化合物可以用于治疗和/或预防涉及raf、VEGFR、PDGFR、p38和/ 或flt-3的一条或更多细胞信号转导途径所介导的任何疾病或病症。术语“治疗”按照 其常规意义使用，例如出于抗击、减轻、降低、解除、改善疾病或功能紊乱的症状 等等目的对患者进行处理或照顾。所述化合物也可以以用于预防和/或治疗由所述信 号分子介导的疾病和/或病症进行描述。术语“介导”表示例如所述信号分子是在所述 疾病和/或病症中异常或失常的途径的一部分。

可以治疗的疾病和病症包括任何上面和下面所提及的疾病以及：

包括例如细胞增殖紊乱、癌症、肿瘤等等的raf相关疾病；

包括例如癌症、肿瘤生长、炎症疾病、风湿性关节炎、视网膜病、银屑病、肾小 球肾病、哮喘、慢性支气管炎、动脉硬化症、移植排斥、涉及血管生成的病症等等 的VEGFR-2相关疾病；

包括例如癌症、角膜疾病、角膜红肿(例如Hamrah，Am.J.Path.2003，163，57-68)、 角膜移植(Cursiefen等，Cornea2003，22，273-81)、淋巴腺增生、涉及淋巴管生成 的病症等等VEGFR-3相关疾病；

包括例如特征在于细胞增殖、细胞基质形成、细胞运动和/或细胞外基质形成的疾 病或病症的PDGFR-β相关疾病。具体的例子包括例如肿瘤、恶性肿瘤、癌症、癌症 转移、慢性骨髓性白血病、炎症、肾病、糖尿病肾病、肾小球膜增生性肾小球肾病、 纤维化病症、动脉硬化症、心瓣再狭窄、高血压相关动脉硬化、静脉搭桥移植动脉 硬化、硬皮病、间质性肺病、滑液病、关节炎、白血病、淋巴瘤等等；

包括例如免疫相关疾病、血细胞疾病、涉及造血细胞(例如T细胞、B细胞、树 突状细胞)发育的病症、癌症、贫血、HIV、获得性免疫缺陷症等等的Flt-3相关疾病；

包括炎症疾病、免疫调节疾病以及其他与异常的细胞因子(特别是TNFα)产生或 异常的MMP活性相关的其他疾病的p38相关疾病。这些疾病包括但不限于风湿性关 节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨质疏松症、克罗恩病和银屑病。

此外，本发明所述化合物可以用于治疗美国专利No.6,316,479中所公开的病症 和疾病，例如肾小球硬化、间质性肾炎、间质性肺纤维病、动脉硬化症、伤口瘢痕 和硬皮病。

本发明所述化合物也具有广泛的治疗活性用以治疗或预防各种疾病的进展，这 些疾病诸如炎症病症、冠状动脉再狭窄、肿瘤相关血管生成、动脉硬化症、自身免 疫病、炎症、与肾小球或肾小球膜细胞增殖相关的某些肾病、以及与视网膜血管增 殖相关的眼病、银屑病、肝硬化、糖尿病、动脉硬化症、再狭窄、血管移植再狭窄、 支架内再狭窄、血管生成、眼病、肺纤维病、闭塞性细支气管炎、肾小球肾病、风 湿性关节炎。

本发明也为以下一种或多种人和/或其他哺乳动物的病症提供了治疗、预防、调节 等等：包括糖尿病视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞、早产视网膜病和老年黄斑病 变的视网膜病；风湿性关节炎、银屑病、或与皮下水泡形成相关的大疱病(包括大疱 性类天疱疮、多形红斑或疱疹样皮炎)、风湿热、骨吸收、绝经后骨质疏松症、脓血 症、格兰氏阴性脓血症、脓血性休克、内毒素休克、毒素休克综合征、系统性炎症 反应综合征、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、赫克斯海默反应、哮喘、成人呼 吸窘迫症候群、急性肺部纤维化病、肺结节病、过敏性呼吸病、硅肺病、煤矿工人 肺尘症、肺泡损伤、肝衰竭、急性炎症中的肝病、重症酒精性肝炎、疟疾(恶性疟原 虫疟疾和脑部疟疾)、非胰岛素依赖型糖尿病(NEDDM)、充血性心脏衰竭、心脏病后 损伤、动脉硬化症、阿尔茨海默病、急性脑炎、脑损伤、多发性硬化(多发性硬化中 的脱髓鞘和寡树突状细胞缺失)、晚期癌症、恶性淋巴癌、胰腺炎、感染中伤口愈合 弱化、炎症和癌症、骨髓增生异常综合征、系统性红斑狼疮、胆汁性肝硬化、肠坏 死、辐射伤/给予单克隆抗体后的毒性、宿主-移植物反应(缺血-再灌注损伤以及肾脏、 肝脏、心脏和皮肤同种异体移植排斥)、肺同种异体移植排斥(闭塞性支气管炎)、整 体髋关节置换并发症、以及选自肺结核、胃溃疡病中的幽门螺杆菌感染、枯氏锥虫 感染引起的夏格氏病、大肠杆菌感染引起的志贺样毒素作用、葡萄球菌感染引起的 肠毒素A作用、脑膜炎感染的感染性疾病、以及莱姆病螺旋体、钩端螺旋体、细胞 巨大病毒、流感病毒、泰勒脑脊髓炎病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)引起的感染、乳头 状瘤、芽状神经胶质瘤、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状 细胞癌、星细胞瘤、头癌、颈癌、膀胱癌、乳癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、 胃癌、肝细胞癌、白血病、淋巴瘤、霍奇金病、伯基特病、关节炎、风湿性关节炎、 糖尿病视网膜病、血管生成、再狭窄、支架内再狭窄、血管移植再狭窄、肺纤维化、 肝硬化、动脉硬化症、肾小球肾病、糖尿病肾病、移植排斥、银屑病、糖尿病、伤口 愈合、炎症、以及神经变性病、过度免疫病、血管瘤、心肌血管生成、冠状及脑侧突 血管形成、缺血、角膜病、虹膜病、新生血管性青光眼、早产黄斑病变视网膜病、伤 口愈合、幽门螺杆菌溃疡相关疾病、骨折、子宫内膜异位、糖尿病症状、猫抓热、 甲状腺肥大、哮喘或烧伤后浮肿、外伤、慢性肺病、中风、息肉、囊肿、滑膜炎、 慢性及过敏性炎症、卵巢高刺激综合征、肺部和脑部水肿、瘢痕瘤、纤维症、硬化、 腕管综合征、成年呼吸窘迫综合征、腹水、眼病、心血管病、克-富(POEMS)综合征、 克罗恩病、肾小球肾病、骨关节炎、多发性硬化、移植物排斥、莱姆关节炎、脓血 症、冯希-林二氏综合征、类天疱疮、佩吉特病、多囊肾病、肉状瘤病、甲状腺炎、 高粘稠度综合征、Osier-Weber-Rendir病、慢性闭塞性肺病、辐射、缺氧、先兆子痫、 月经过多、子宫内膜异位、单纯疱疹感染、缺血性视网膜病、角膜血管生成、带状 疱疹、人免疫缺陷病毒、副痘病毒、原生动物、弓形虫病以及肿瘤相关的渗出和水 肿。

本发明所述的化合物可以具有一种以上的所述活性并因此可以针对多条信号转 导途径。因此，这些化合物可以实现通常只能在使用不同化合物组合时才能获得的 治疗和预防效果。例如，通过使用单一化合物抑制新导管形成(例如与VEGFR-2和 VEGFR-3功能相连的)(例如血管和/或淋巴管)和细胞增殖(例如与raf和PDGFRβ功能 相连的)在治疗癌症以及其他由新的血管形成而促进的细胞增殖异常中尤其有用。因 此，本发明尤其涉及了至少具有抗细胞增殖和抗血管生成(即抑制血管生成)活性的化 合物。按照本发明可以对任何受益于导管生长和细胞增殖抑制的疾病或病症进行治 疗。由于可以更精确地定义其活性范围，使用单一化合物也是有利的。

如上所述，本发明涉及治疗和/或预防疾病和病症以及/或调节与raf、VEGFR、 PDGFR、p38和/或flt-3相关的一种或多种途径、多肽、基因、疾病、病症等等的方 法。这些方法通常包括给予有效量的本发明的化合物，其中有效量是可用于实现所 需结果的化合物的量。如以下更为详细所述，化合物可以通过任何有效路线以任何 有效形式给予。

本发明所述方法包括调节肿瘤细胞增殖，这包括抑制细胞增殖。后者表示肿瘤细 胞的生长和/或分化得到降低、减少、削弱、减缓等等。术语“增殖”包括涉及细胞生 长和分裂的任何过程，并包括分化和凋亡。如上所述，raf激酶在涉及细胞增殖、分 化和凋亡的细胞质信号级联的活化中发挥重要作用。例如，研究发现，用反义寡核 苷酸抑制c-raf可以阻碍细胞增殖(见上文)。任何量的抑制被认为是具有治疗意义的。

本发明所述方法中包括使用包括其盐、前药、代谢物(氧化衍生物)及其组合物在 内的上述化合物(式l所述化合物)以治疗哺乳动物过度增殖性疾病的方法，所述方法 包括对包括需要的人在内的哺乳动物给予有效治疗所述疾病的量的本发明所述化合 物、其药学上可接受的盐、前药、代谢物(氧化衍生物)及其组合物。过度增殖性疾病 包括但不限于实体肿瘤，诸如乳癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、尿 道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、副甲状腺癌及其远距离转移灶。 这些疾病也包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。

可以对任何肿瘤进行治疗，这些肿瘤包括但不限于在raf、ras和/或flt-3中及其所 参与的信号途径的任何上游或下游成员中具有一个或多个突变的肿瘤。如先前所述， 肿瘤可以用本发明所述化合物进行治疗而不考虑其所对应的机制。可以对任何器官 的肿瘤进行治疗，这包括但不限于例如结肠癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、 肝癌、肾癌、肺癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌、 黑素瘤等等。

乳癌的例子包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶 癌。

呼吸道癌的例子包括但不限于小细胞及非小细胞肺癌、以及支气管腺瘤和胸膜肺 母细胞瘤。

脑癌的例子包括但不限于脑干和垂体神经胶质瘤、小脑和大脑星细胞瘤、成神经 管细胞瘤、室鼓膜瘤以及神经外胚瘤和松果腺瘤。

男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括但不 限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。

消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、 直肠癌、小肠癌以及唾液腺癌。

尿道系统肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌以及尿道 癌。

眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。

肝癌的例子包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层形式的肝细胞癌)、胆 管细胞癌以及混合型肝细胞胆管细胞癌。

皮肤癌包括但不限于鳞状细胞瘤、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌 以及非黑素瘤皮肤癌。

头颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌和/或口咽癌以及嘴唇和口腔癌。

淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、 霍奇金病以及中枢神经系统淋巴瘤。

肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、淋巴肉瘤以及 横纹肌肉瘤。

白血病包括但不限于急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白 血病、慢性骨髓性白血病以及绒毛细胞白血病。

除了抑制肿瘤细胞增殖，本发明所述化合物也能引起肿瘤消退，例如肿瘤大小的 减小或肿瘤在体内分布范围的降低。

本发明也涉及调节由细胞构成的系统中血管生成和/或淋巴管生成的方法，该方法 包括对所述系统给予有效量的这里所述的化合物：由细胞构成的系统可以是诸如患 者体内的肿瘤、分离的器官、组织或细胞的体内系统、试管检测系统(CAM、BCE等 等)、动物模型(例如体内的、皮下的肿瘤模型)、需要治疗的宿主(例如患有包含血管 生成和/或淋巴管生成成分的诸如肿瘤的疾病的宿主)等等。

血管生成的不适当的异常表达会对生物体造成伤害。许多病理学症状是与额外的 血管生长相关联的。这样的症状包括例如糖尿病视网膜病、新生血管青光眼、银屑 病、晶状体后纤维素增生、血管纤维瘤、炎症等等。此外，与肿瘤及癌组织相关的 供血增加有助于生长从而导致快速的肿瘤增大与转移。而且，肿瘤中新的血管与淋 巴管的生长为变异细胞提供了逃逸路线，有助于转移及随后的肿瘤扩散。

检测血管生成和/或淋巴管生成及其抑制的有用的系统包括例如肿瘤外植体的新 生血管形成(例如美国专利Nos.5,192,744；6,024,688)、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)检测法 (例如Taylor和Folkman，Nature1982，297-，307-312；Eliceiri等，J.Cell Biol.1998， 140，1255-1263)/牛毛细血管内皮(BCE)检测法(例如美国专利No.6,024,688；Polverini， P.J.等，Methods.Enzymol.1991，198，440-450)、迁移检测法以及HUVEC(人脐带血 管内皮细胞)生长抑制检测法(例如美国专利No6,060,449)以及使用兔耳模型(例如 Szuba等，FASEB J.2002，16(14)，1985-7)。

可以使用任何其他方法测定血管生成的调节。例如，组织血管分布程度通常可以 通过评定特定样本中存在的血管数量和密度进行测定。例如，可以通过高倍显微视 野中的内皮集落数计数或通过检测微脉管内皮特异性标记或其他生长中的或已有的 血管标记(例如CD31，也称为血小板内皮细胞粘附分子或PECAM)来计算微脉管密 度(MVD)。如例如美国专利No.6,017,949；Delias等，Gyn.Oncol.1997，67，27-33 及其他文献所述，可以在常规的免疫组织学方法中使用CD31抗体对组织切片进行免 疫染色。用于血管生成的其他标记物包括例如Vezfl(例如Xiang等，Dev.Bio.1999， 206，123-141)、血管生成素、Tie-2和Tie-1(例如Sato等，Nature1995，376，70-74)。

此外，本发明涉及对患者进行筛选以确定其多本发明所述化合物的敏感性的方 法。例如，本发明涉及确定一种病症是否可以用本发明所公开的化合物进行调节的 方法，该方法包括在含有细胞或细胞提取物的样本中检测raf、VEGFR-2、VEGFR-3、 PDGFRβ、p38和/或flt-3的表达或活性，其中所述样本取自具有所述症状的细胞或 患者。当检测结果表明上述基因中的一个或多个基因(和/或其所编码的多肽)与正常 状态存在差异时，这说明用本发明所述化合物可以对该症状进行治疗，即当所述症 状中的所述表达或活性与正常对照相比有所提高时，所述疾病或症状可以用所述化 合物进行调节。所述方法可以进一步包括将样本中的表达情况与距常对照或取自正 常或未受影响的组织的样本中的表达情况相比较的步骤。比较可以针对标准品人工 进行或针对例如数据库用计算机进行等等。正常对照可以是随检测法提供的标准样 本，这可以是从相同患者获得的邻近的但未受影响的组织或可以是预先测定的数值 等等。可以对基因表达、蛋白表达(例如在细胞中的丰度)、蛋白活性(例如激酶活性) 等等进行测定。

例如，可以检测癌症患者组织切片的raf、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、p38 和/或flt-3的存在、数量和/或活性加以检测。上述一个或多个指标的表达或活性的提 高可以说明该肿瘤可以用本发明所述化合物进行靶向治疗。例如，如以下实施例所述， raf活性可以通过其启动仪器ERK磷酸化级联(即raf/MEK/ERK)从而形成磷酸ERK的 能力进行检测。肿瘤样本中磷酸ERK水平的提高说明其raf活性有所提高，这提示了 使用本发明所述化合物对其进行治疗。

表达情况检测包括测定检测细胞中存在的或由其所分泌的多肽数量，以及对其潜 在的mRNA进行检测，其中所存在的mRNA数量被认为反映了细胞生产多肽的数量。 此外，可以分析raf、VEGFR-2、VEGFR-3、DGFR-β、p38和/或Flt-3的基因以确 定是否存在造成异常表达或多肽活性的基因缺陷。

多肽检测可以通过任何可用的方法进行，例如通过免疫印迹、ELISA、点印迹、 免疫沉淀、RIA、免疫组织化学等等。例如，可以制备组织切片并用特异性抗体(直 接的或间接的)标记并用显微镜显影。多肽的量可以不通过显影而加以定量，例如 通过制备感兴趣的样本的细胞裂解液并随后通过ELISA或免疫印迹确定单位数量 组织中的多肽量。可以使用抗体和其他特异结合物质。对于如何进行检测没有限制。

可以使用允许对样本中的目标核酸(例如raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3 的基因、mRNA等等)进行定量和/或检测其是否存在的检测方法。可以在单细胞水平 或包含许多细胞的样本中进行检测，其中所检测的是所述样本中所存在的细胞和组 织的整个集合的平均表达水平。可以使用任何适当形式的检测方法，这包括但不限 于例如Southern印迹分析、Northern印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)(例如Saild等， Science1988，241，53；美国专利Nos.4,683,195，4,683,202和6,040,166；Innis等 主编的《PCR实验方案：方法与应用指导》PCR Protocols：A Guide to Methods and  Applications，Academic Press，New York，1990)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、 锚定PCR、eDNA末端快速扩增(RACE)(例如Schaefer的《基因克隆与分析：创新进 展》(Gene Cloning and Analysis：Current Innovations)99-115，1997)、连接酶链式反应 (LCR)(EP320 308)、单侧PCR(Ohara等，.Proc.Natl.Acad.Sci.1989，86，5673-5677)、 检索方法(例如美国专利No.5,508,169)、原位杂交、差异显示(例如Liang等，Nucl. Acid.Res.1993，21，32693275；美国专利Nos.5,262,311，5,599,672和5,965,409； WO97/18454；Prashar和Weissman，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：659-663，以及美国 专利Nos.6,010,850和5,712,126；Welsh等，Nucleic Acid Res.，20：4965-4970，1992， 以及美国专利No.5,487,985)以及其他RNA指纹技术、基于核酸序列的扩增(NASBA) 和其他基于转录的扩增系统(例如美国专利Nos.5,409,818和5,554,527；WO 88/10315)、聚核苷酸芯片(例如美国专利Nos.5,143,854，5,424,186；5,700,637， 5,874,219和6,054,270；PCT WO92/10092；PCT WO90/15070)、Qβ复制酶(PCT/US 87/00880)、链置换扩增(SDA)、修复链式反应(RCR)、核酸酶保护检测、差减方法、 快速扫描等等。其他有用的方法包括但不限于例如基于模板的扩增方法、竞争PCR(例 如美国专利No.5,747,251)、基于氧化还原的检测方法(例如美国专利No.5,871,918)、 Taqman技术(例如Holland等，Proc.Natl.Acad，Sci.1991，S8，7276-7280；美国 专利Nos.5,210,015和5,994,063)、实时荧光检测(例如美国专利5,928,907)、分子能 量传递标记(例如美国专利Nos.5,348,853，5,532,129，5,565,322，6,030,787和 6,117,635；Tyagi和Kramer，Nature Biotech.，14：303-309，1996)。可以使用任何适 于基因或蛋白表达的单细胞分析的方法，这包括原位杂交、细胞免疫化学、MACS、 FACS、流式细胞等等。对于单细胞检测，表达产物可以用抗体、PCR或其他类型的 核酸扩增进行检测(例如Brady等，Methods Mol&Cell.Biol.1990，7，17-25；Eberwine 等，Proc.Natl.Acad.Sci.1992，89，3010-3014；美国专利No.5,723,290)。这些及其 他方法可以用常规手段进行，例如如所述出版物中描述的手段。

可以用常规方法对raf、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、β38和/或flt-3的活性 进行检测，例如如以下实施例中所描述的方法或使用激酶活性的常规检测方法。 本发明也提供了对本发明所述化合物在治疗疾病中的功效进行评价的方法，该方 法包括任何有效顺序的以下一个或多个步骤，例如，给予一定量的化合物，检测raf、 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、p38和/或flt-3的表达或活性(见前文)，测定所述 化合物对所述表达或活性的作用。例如，可以从已经用本发明所述化合物治疗的患 者取得组织切片样本，并随后检测是否存在以及/或上述信号分子的活性。同样地， 如上所述，肿瘤组织中磷酸ERK水平的降低(例如与正常组织或治疗前相比)表示所 述化合物在体内发挥其功效并具有治疗效果。所述方法可以用于确定适当的剂量和 服药计划，例如给予多少化合物以及给药频率。通过检测其对组织中信号分子的作 用，临床医生可以确定合适的治疗方案以及是否实现了所需要的作用，例如对信号 转导途径的调节或抑制。

本发明所述化合物也可以用作测定包含生物学材料的样本中是否存在raf、 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、p38和/或flt-3及其数量的标记物。这包括任何有 效顺序的以下一个或多个步骤：(i)将包含一种生物材料的所述样本与本发明所述的 化合物接触；以及(ii)测定所述化合物是否与所述材料结合。所述化合物可以进行标 记，或可以用作诸如标记的ATP的标记化合物的竞争物。

本发明也为哺乳动物中疾病与病症的治疗、预防、调节等等提供了方法，该方法 包括给予本发明所述化合物和包括但不限于raf、VEGFR、PDGFR、p38和/或flt-3 的信号转导途径的另一种调节物质。上述物质可以存在于同一组合物中或是单独剂 型或剂量单位。可以通过相同或不同的路线给药，并可以是同时或先后给药。

以下出版物涉及VEGFR-3调节并将其对VEGFR-3介导的疾病状态的描述以及 确定这样的活性的检测方法组合在本说明书中。

以下出版物涉及VEGFR-2调节并将其对VEGFR-2介导的疾病状态的描述以及 确定这样的活性的检测方法组合在本说明书中。

以下出版物涉及flt-3调节并将其对flt-3介导的疾病状态的描述以及确定这样 的活性的检测方法组合在本说明书中。

以下出版物涉及PDGF/PDGFR调节并将其对PDGFR-β介导的疾病状态的描述 以及确定这样的活性的检测方法组合在本说明书中。

PDGFR-β

EP0869177     Matsui等

WO09010013    Matsui等

WO9737029    Matsui等

PDGFR-α

EP1000617    Lammers等

EP0869177    Matsui等

EP0811685    Escobedo等

基于本发明所述化合物的药物组合物

本发明也涉及含本发明所述化合物及其药学上可按受的盐的药物组合物。可以给 予有此需要的患者这些组合物以达到所希望的药理学效果。针对本发明的目的，患 者是需要对具体症状或疾病进行治疗的包括人在内的哺乳动物。因此，本发明包括 含有药学上可接受的载体和本发明所述化合物或其盐的药物有效量的药物组合物。 药学上可接受的载体是以与所述活性成分的有效活性相匹配的浓度对于患者相对无 毒无害从而使载体引起的任何副作用不损害活性成分的有益作用的任何载体。化合 物的药物有效量是对所治疗的具体症状产生效果或发挥影响的量。本发明所述化合 物可以通过本领域所熟知的药学上可接受的载体使用包括快速释放制剂、缓释和定 时释放制剂在内的任何有效的常规剂量单位形式经口服、非肠道、局部、鼻部、眼 球、眼部、舌下、直肠、阴道等等方式给药。

对于口服给药，所述化合物可以配制成诸如胶囊、药丸、片剂、锭剂、糖锭、熔 体、粉末、溶液、悬浮液或乳状液等固体或液体制剂，并且可以按照本领域内已知 的用于生产药物组合物的方法进行制备。固体单位剂量形式可以是普通的硬壳或软 壳的明胶类胶囊，包含例如表面活性剂、滑润剂以及诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉 米淀粉的惰性填充剂。

在另一种实施方式中，本发明所述化合物可以用诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉等常 规药片基质与诸如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶等粘合剂；诸如马铃薯淀粉、褐藻 酸、玉米淀粉、以及瓜尔豆胶、黄芪胶、阿拉伯树胶的用于给药后帮助药片分裂与 溶解的崩解剂；例如滑石、硬脂酸或硬脂酸镁、钙或锌等用于提高药片制粒流并防 止药片原料与药片模具及压片机粘连的滑润剂；用于提高药片外观质量并使其更为 患者所接受的染料、着色剂、以及诸如薄荷油、冬青油、或樱桃调味剂等的调味剂 组合制备片剂。用于口服固体剂型的适当的赋形剂包括磷酸二钙和诸如水和醇(例如 乙醇、苯甲醇和聚乙二醇)的包含或不含药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化 剂的稀释剂。各种其他材料可以以糖衣形式或是为了以其他方式对剂型的物理形式 进行修饰而存在。例如，药片、药丸或胶囊可以用虫胶、糖或这两者包被。

可分散粉末和颗粒适于制备水性悬浮液。它们提供了与分散剂或湿润剂、悬浮剂 以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂通过上面 已经提到的内容举例。也可以存在额外的赋形剂，例如上述的那些甜味剂、调味剂 和着色剂。

本发明所述药物组合物也可以是水包油乳剂形式的。油相可以是诸如液体石蜡的 植物油或是植物油混合物。适当的乳化剂可以是(1)诸如阿拉伯树胶和黄芪胶的天然 树胶，(2)诸如大豆磷脂和卵磷脂的天然磷脂，(3)酯或部分酯衍生形式脂肪酸和己糖 醇酐，例如单油酸山梨醇酐，(4)所述部分酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯 单油酸山梨醇酐。所述乳剂也可以包含甜味剂和调味剂。

油性悬浮液可以通过将活性成分在例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油等植物 油或诸如液体石蜡等矿物油中悬浮进行配制。油性悬浮液可以包含诸如例如蜂蜡、 硬石蜡或鲸蜡醇等增稠剂。所述悬浮液也可以包括一种或多种例如对羟基苯甲酸乙 酯或对羟基苯甲酸正丙酯的防腐剂；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；以及 一种或多种诸如蔗糖或糖精的甜味剂。

可以用诸如例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖等甜味剂配制糖浆或酏剂。这样的 制剂也可以包含缓和剂和防腐剂(诸如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)以及 调味剂和着色剂。

本发明所述的化合物也可以以生理上可接受的稀释剂中该化合物的注射剂量非 肠道给药，即皮下注射、静脉内注射、眼内给药、滑膜内给药、肌内给药或腹膜给 药，所述稀释剂包含可以是诸如水、盐水、水性葡萄糖和相关糖溶液、诸如乙醇、 异丙醇或十六醇的醇、诸如丙二醇或聚乙二醇的甘醇、诸如2，2-二甲基-1，1-二恶茂烷 -4-甲醇的甘油缩酮、诸如聚乙二醇400的醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或脂肪酸甘油 酯、或乙酰化的脂肪酸甘油酯的无菌液体或液体混合物的药物载体，其中包含或不 含诸如脂肪酸盐的药学上可接受的表面活性剂或去垢剂、诸如果胶、卡波姆、甲基 纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素的悬浮剂、或乳化剂以及其他药物佐剂。

可以在本发明的非肠道剂型中使用的油的例子是石油、动物、植物或合成来源的 油，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、软石蜡及矿物油。 适当的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、异硬脂酸和肉豆蔻酸。适当的脂肪酸酯是例如油 酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。适当的脂肪酸盐包括脂肪酸碱金属、脂肪酸铵和脂肪酸 三乙胺，并且适当的表面活性剂包括阳离子表面活性剂，例如卤化二甲基二烷基铵、 卤化烷基吡啶和醋酸烷基胺；阴离子表面活性剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐、 烷基、烯烃、乙醚和单酸甘油脂硫酸盐以及磺基琥珀酸盐；非离子型表面活性剂， 例如氧化脂肪胺、链烷醇酰胺脂肪酸、和聚(氧乙烯-氧丙基)或氧乙烯或氧丙烯共聚 物；以及两性表面活性剂，例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季铵盐，及其混 合物。

本发明所述非肠道组合物通常应在溶液中包含重量比从约0.5％到约25％的活性 成分。也可以方便地使用防腐剂和缓冲液。为了最小化或消除注射位置上的刺激， 这样的组合物可以包含具有介于约12到约17之间的亲水-亲脂平衡常数(HLB)的非 离子表面活性剂。在这样的剂型中的表面活性剂量介于重量比约5％到约15％之间。 所述表面活性剂可以是具有以上HLB的单一组分或可以是具有所需HLB的两种或 更多组分的混合物。

在所述非肠道剂型中使用的表面活性剂的例子是聚乙烯山梨糖醇脂肪酸酯类表 面活性剂，例如山梨糖醇单油酸酯和氧乙烯与疏水碱通过氧丙烯与丙二醇缩合形成 的高分子量加合物。

所述药物组合物可以是无菌注射用水性悬浮液形式的。这样的悬浮液可以按照已 知方法进行配制，其中使用适当的分散剂或湿润剂和诸如例如羧甲基纤维素钠、甲 基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶的 悬浮剂；分散剂或湿润剂可以是诸如卵磷脂的天然磷脂、例如聚氧乙烯硬脂酸酯的 烯化氧与脂肪酸的缩合产物、例如十七-乙烯氧十六醇的氧乙烯与长链脂肪醇的缩合 产物、诸如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯的氧乙烯与由脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的 缩合产物、或是例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯的乙烯氧与从脂肪酸和己糖醇酐衍 生的部分酯的缩合产物。

所述无菌的注射用制剂也可以是位于无毒的非肠道给药允许的稀释剂或溶剂中 的无菌的注射用溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂或溶剂是例如水、林格溶液、等 压氯化钠溶液和等压葡萄糖溶液。此外，无菌的不挥发油通常被用作溶剂或悬浮用 媒介。为此目的，可以使用包括合成的甘油单酯或甘油二酯在内的任何无刺激性的 不易挥发的油。此外，诸如油酸的脂肪酸可以用于注射剂的制备。

本发明所述组合物也可以以用于直肠给药的栓剂形式进行给药。这些组合物可以 通过将药物与适当的无刺激赋形剂混合进行制备，其中所述赋形剂在通常温度下是 固体但在直肠温度下是液体并从而能在直肠中熔解以释放药物。这样的材料例如是 可可油和聚乙二醇。

本发明所述方法中使用的另一种剂型采用透皮递药装置(“药膏”)。这样的透皮药 膏可以用于提供受控量的本发明所述化合物的连续或间断灌注。用于药物递送的透 皮药膏的构建和使用是本领域内所熟知的(参见例如通过参考结合在本说明书中的 1991年6月11日出版的美国专利No.5,023,252)。可以构建这样的药膏用于连续、 脉冲、或按要求的药物递送。

用于非肠道给药的控释制剂包括本领域内已知的脂质体、聚合物微粒和聚合物胶 体制剂。

可能要求或需要将所述药物组合物通过机械递送装置向患者给药。用于药物递送 的机械递送装置的构建和使用是本领域内所熟知的。例如直接向脑部给药的直接递 药技术通常包括将给药导管置于患者脑室系统以绕过血脑屏障。1991年4月30日出 版的美国专利No.5,011,472中描述了这样一种用于向身体的特定解剖学区域运输物 质的植入递药系统。

在需要或希望的情况下本发明所述组合物也可以包含通常称为载体或稀释剂的 常规的药学上可接受的混合成分。可以采用制备适当剂量形式的这样的组合物的常规 工艺。这样的成分和工艺包括以下通过参考组合在本说明书中的参考文献中所描述的 内容：Powell，M.F.等《非肠道剂型赋形剂概述》(Compendium of Excipients for  Parenteral Formulations)，PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology1998， 52(5)，238-311；Strickley，R.G《美国市场交易的小分子药剂的非肠道剂型，1999 年第一部分》(Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the  United States(1999)-Part-1)，PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1999，53(6)，-324-349；以及Nenia，S.等，《注射用产品中的赋形剂及其使用》(Excipients  and Their Use in Injectable Products)，PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1997，51(4)，166-171。

针对其设计的给药路线与组合物剂型相匹配的常用药物成分包括：

●酸化剂(例子包括但不限于醋酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、硝酸)；

●碱化剂(例子包括但不限于氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、乙醇胺、氢氧化钾、 硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺)；

●吸附剂(例子包括但不限于粉末状纤维素和活性碳)；

●气溶胶喷射剂(例子包括但不限于二氧化碳、CCl₂F₂、F₂CIC-CClF₂、以及 CClF₃)；

●空气置换剂(例子包括但不限于氮气和氩气)；

●抗真菌防腐剂(例子包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸 乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠)；

●抗菌防腐剂(例子包括但不限于苄烷氯铵、苄索氯铵、苯甲基醇、氯化十六烷 基吡啶、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞钠)；

●抗氧化剂(例子包括但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸盐、丁羟茴醚、丁羟 甲苯、次磷酸、硫代甘油、丙基没食子酸、抗坏血酸钠、重亚硫酸钠、甲醛次硫酸 氢钠、偏亚硫酸氢钠)；

●粘合材料(例子包括但不限于嵌段聚合物、天然及合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚 亚胺酯、硅树脂、聚硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物)；

●缓冲剂(例子包括但不限于偏磷酸钾、磷酸氢二钾、醋酸钠、无水柠檬酸钠、 二水柠檬酸钠)；

●承载剂(例子包括但不限于阿拉伯树胶糖浆、芳香糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、 可可糖浆、橙味糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌氯化钠注射 剂及抑菌注射用水)；

●螯合剂(例子包括但不限于依地酸二钠和依地酸)；

●着色剂(例子包括但不限于FD&C Red No.3、FD&C Red No.20、FD&C Yellow No.6、FD&C Blue No.2、D&C Green No.5、D&C Orange No.5，D&C Red No.8、 焦糖以及氧化铁红)；

●澄清剂(例子包括但不限于阿拉伯树胶、聚乙二醇、十六烷基醇、单硬脂酸甘 油酯、卵磷脂、单油酸聚山梨醇酯、聚氧乙烯50单硬脂酸酯)；

●胶囊剂(例子包括但不限于明胶及纤维醋法酯)；

●食用香精(例子包括但不限于茴芹油、肉桂油、可可、薄荷醇、桔油、胡椒薄 荷油和香兰素)；

●保湿剂(例子包括但不限于甘油、丙二醇和山梨醇)；

●研磨剂(例子包括但不限于矿物油和甘油)；

●油(例子包括但不限于落花生油、矿物油、橄榄油、花生油、芝麻油和植物油)；

●油膏基质(例子包括但不限于羊毛脂、亲水油膏、聚乙二醇油膏、矿脂、亲水 矿脂、白油膏、黄油膏以及玫瑰红水油膏)；

●渗透增强剂(透皮递药)(例子包括但不限于单羟基或多羟基醇、单价或多价醇、 饱和或不饱和脂肪醇、饱和或不饱和脂肪酯、饱和或不饱和二羧基酸、香精油、磷 脂酰衍生物、脑磷脂、萜烯、酰胺、醚、酮和脲)；

●可塑剂(例子包括但不限于邻苯二酸二乙酯和甘油)；

●溶剂(例子包括但不限于乙醇、玉米油、棉籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油 酸、花生油、纯水、注射用水、注射用无菌水和输液用无菌水)；

●硬化剂(例子包括但不限于十六烷基醇、十六烷基酯、蜡、微晶蜡、石蜡、硬 酯醇、白蜡和黄蜡)；

●栓剂基质(例子包括但不限于可可油和聚乙二醇(混合物))；

●表面活性剂(例子包括但不限于苄烷氯铵、壬苯聚醇10、oxtoxynol9、聚山梨 醇酯80、十二烷基硫酸钠和山梨聚醇单棕榈酸酯)；

●悬浮剂(例子包括但不限于琼脂、膨润土、卡波姆、羧乙基纤维素钠、羟乙基 纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄芪胶和硅酸 镁铝(veegum))；

●甜味剂(例子包括但不限于阿斯巴甜糖、右旋糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖 精钠、山梨醇和蔗糖)；

●药片防粘剂(例子包括但不限于硬脂酸酶和滑石粉)；

●药片粘合剂(例子包括但不限于阿拉伯树胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、可压 性蔗糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素和明胶化淀粉)；

●药片及胶囊稀释剂(例子包括但不限于磷酸氢钙、高岭土、乳糖、甘露醇、微 晶纤维素、粉末化纤维素、沉淀的碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨醇和淀粉)；

●药片包被剂(例子包括但不限于液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、纤维醋法酯和虫胶)；

●药片直接压缩赋形剂(例子包括但不限于磷酸氢钙)；

●药片崩裂剂(例子包括但不限于海藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、波拉 克林钾(polacrillin potassium)、藻酸钠、羟乙酸钠淀粉和淀粉)；

●药片滑动剂(例子包括但不限于胶体硅、玉米淀粉和滑石粉)；

●药片滑润剂(例子包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂 酸锌)；

●药片/胶囊不透明剂(例子包括但不限于二氧化钛)；

●药片抛光剂(例子包括但不限于棕榈蜡和白蜡)；

●增稠剂(例子包括但不限于蜂蜡、十六烷醇和石蜡)；

●张性剂(例子包括但不限于右旋糖和氯化钠)；

●粘性增强剂(例子包括但不限于海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、藻酸钠和黄芪胶)；以及

●增湿剂(例子包括但不限于十七烷乙烯氧十六醇、卵磷脂、山梨醇单油酸酯、 聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。

如本发明所述的药物组合物可以举例如下：

无菌IV溶液：将本发明所述的所需化合物用无菌的注射用水配制成5毫克/毫升 溶液并按需要调节pH。为了给药将所述溶液用5％无菌右旋糖稀释至I-2毫克/毫升 并用60分钟按照静脉输液给药。

用于静脉给药的冻干粉末：可以用(i)100-1000毫克冻干粉末形式的本发明所述所 需化合物，(ii)32-327毫克/毫升柠檬酸钠，和(iii)300-3000毫克右旋糖苷40制备无菌 制剂。用无菌注射用水或5％右旋糖将所述剂型再造成浓度10-20毫克/毫升，进一步 用盐水或5％右旋糖稀释成0.2-0.4毫克/毫升，并用15-60分钟通过静脉集合药团或 静脉灌注给药。

肌内悬浮液：对于肌内注射可以制备以下溶液或悬浮液：

50毫克/毫升如本发明所述的所需不溶于水的化合物

5毫克/毫升羧甲基纤维素钠

4毫克/毫升Tween80

9毫克/毫升氯化钠

9毫克/毫升苯甲基醇

硬壳胶囊：通过填充传统的两片式硬胶囊(每片含100毫克粉末状活性成分、150 毫克乳糖、50毫克纤维素和6毫克硬脂酸镁)制备大量的胶囊颗粒。

软明胶胶囊：在诸如大豆油、棉籽油或橄榄油的可消化油中制备了活性成分混合 物通过主动置换泵入熔化的明胶以形成含100毫克活性成分的软明胶胶囊。胶囊经 清洗并干燥。活性成分可以溶解在聚乙二醇、甘油和山梨醇的混合物中以制备可与 水混合的药物混合物。

药片：通过常规工艺制备大量片剂，使得剂量单位是100毫克活性成分、0.2毫 克胶体二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克淀粉和98.8毫克 乳糖。可以使用适当的水性或非水性包衣以提高适口程度、改善外观和稳定性或延 缓吸收。

速释药片/胶囊：这是通过常规和新工艺生产的固体口服剂型。这些剂量单位无水 口服以快速分解并递送药物。活性成分在包含诸如糖、明胶、果胶和甜味剂的液体 中混合。这些液体通过冷冻干燥和固态抽提技术固化成固体药片或囊片。所述药物 化合物可以与粘弹性和热弹性糖及聚合物或泡腾成分压缩以产生多孔基质用于不需 要水的快速释放。

本发明所述药物组合物的剂量

在已知的对可以用于治疗任何上述疾病的化合物进行评价的常规实验室技术的 基础上，通过常规毒性测试和通过用于确定哺乳动物中上述症状疗效的常规药理学 检测方法，并通过将这些结果与用于治疗这些症状的已知药物的结果进行比较，可 以方便地确定本发明所述化合物对治疗每种所需指征治疗的有效剂量。在对这些病 症中的一种进行治疗中所述活性成分的给药量可以大范围地变化，这取决于诸如所 使用的具体化合物和剂量单位、给药方式、疗程、所治疗患者的年龄和性别以及所 治疗病症的特征和程度等因素。

所述活性成分总的给药量可以介于约0.001毫克/千克到约200毫克/千克之间， 并且优选地介于每天约0.1毫克到约50毫克每千克体重之间。单位剂量可以优选地 含约5毫克到约4000毫克活性成分，并可以每天一次或多次给药。口服给药的每日 剂量应优选地介于0.1到50毫克每千克体重。通过注射给药(包括静脉注射、肌内注 射、皮下注射和非肠道注射)以及使用灌注技术给药的每日剂量应优选地介于0.1到 10毫克每千克体重。每日直肠给药方案应优选地介于0.1到50毫克每千克体重。每 日局部给药方案应优选介于0.1到10毫克/千克每日给药1到4次。透皮浓度应优选 需要维持0.1到10毫克/千克的日剂量。每日吸入给药方案应优选0.1到10毫克每千 克体重。其他剂量和数量可以按常规选择。

具体的初始及持续剂量方案对于每位患者有所不同，这取决于主治医生所确定的 病症的特征及严重程度、所使用具体化合物的活性、患者的年龄及身体状况、给药 时间、给药路线、药物排泄速度、药物组合等等。治疗所需的模式以及本发明所述 化合物或其药学上可接受的盐或酯或组合物的剂量数可以由精通本领域的人员使用 常规治疗检测加以确定。

本发明所述化合物及组合物与其他活性成分的组合

本发明所述化合物可以以单一药剂形式或与一种或多种其他药剂组合给药，其中 所述的组合不引起不能接受的有害结果。这对于治疗诸如癌症的过度增殖性疾病可 能是尤其实用的。在这种情况下，本发明所述化合物可以与已知的细胞毒剂、信号 转导抑制剂、或与其他抗肿瘤物质及其混合物和组合物组合使用。

在一种实施方式中，本发明所述化合物可以与细胞毒抗肿瘤物质组合使用。所述 物质的例子可以参见《墨克索引》第11版(Merck Index(1996))。这些物质包括但不限 于天冬酰胺酶、博莱霉素、卡铂、卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋门冬酰胺酶、 环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放射菌素D、柔红霉素、阿霉素(adriamycine)、表 阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、六甲密胺、羟基脲、异环磷酰胺、伊利替康、甲酰 四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨喋呤、丝裂霉素C、盐酸米 托蒽醌、泼尼松龙、波尼松、甲苄肼、雷洛昔芬、链脲菌素、它莫西芬、硫鸟嘌呤、 托泊替康、长春碱、长春新碱、长春地辛。

其他适于与本发明所述化合物组合使用的细胞毒药物包括但不限于Goodman和 Oilman所著《药物的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics(Ninth  Edition，1996，McGraw-Hill))中所述的公认的用于治疗肿瘤疾病的那些化合物。这 些物质包括但不限于氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、5-氮杂胞苷、克拉屈滨、 白消安、己烯雌酚、2’，2’-双氟去氧胞苷、多烯紫杉醇、赤羟壬基腺嘌呤、雌三醇、 5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸盐、磷酸氟达拉滨、氟甲睾酮、氟他胺、己酸羟 孕酮、去甲氧柔红霉素、干扰素、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、米托坦、 紫杉醇、喷司他丁、N-二氧磷乙酰-L-天冬氨酸盐(PALA)、普卡霉素、司莫司汀、替 尼泊甙、丙酸睾酮、噻替派、三甲基蜜胺、尿嘧啶以及长春瑞滨。

其他适于与本发明所述化合物组合使用的细胞毒抗肿瘤物质也包括新发现的细 胞毒剂，诸如奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、埃博霉素及其天然和合成的衍生物、 替莫唑胺(Quinn等，J.Clin.Oncology2003，21(4)，646-651)、托西莫单抗(Bexxar)、 trabedectin(Vidal等，Proceedings of the American Society for Clinical & Oncology2004， 23，摘要181)、以及驱动蛋白纺锤体蛋白Eg5的抑制剂(Wood等，Curr.Opin.Pharmacol. 2001，1，370-377)。

在另一种实施方式中，本发明所述化合物可以与其他信号转导抑制剂组合使用。 特别感兴趣的是针对EGFR家族(诸如EGFR、HER-2和HER-4)(Raymond等，Drugs 2000，60(增刊1)15-23；Harari等，Oncogene，2000，19(53)，6102-6114)及其各自 的配体的信号转导抑制剂。这样的物质的例子包括但不限于诸如赫赛汀(曲妥珠单 抗)、艾比特思(西妥昔单抗)和波替珠单抗(pertuzumab)的抗体药物。这样的药物的例 子也包括但不限于小分子激酶抑制剂，诸如ZD-1839/Iressa(Baselga等，Drugs2000， 60(增刊1)，33-40)、OSI-774/Tarceva(Pollack等，J Pharm.Exp.Ther.1999，291(2)， 739-748)、CM033(Bridges，Curr.Med.Chem.1999，6，825-843)、GW-2016(Lackey 等，92次AACR会议，新奥尔良，2001年3月24-28日，摘要4582)、CP-724，714(Jani 等，Proceedings of the American Society for Clinical Oncology2004，23，摘要3122)、 以及EKB-569(Greenberger等，11次NCI-EORTC-AACR肿瘤治疗中的新药研讨会 (Symposium on New Drugs in Cancer Therapy)，阿姆斯特丹，2000年11月7-10日， 摘要388)。

在另一种实施方式中，本发明所述化合物可以与针对分离的激酶结构域家族的 受体激酶(VEGFR、FGFR、flt-3、c-kit、c-fms等等)及其各自配体的其他信号途径 抑制剂组合使用。这些物质包括但不限于诸如Avastin(贝伐单抗)的抗体。这些物质 也包括但不限于小分子抑制剂，诸如STI-571/Gleevec(Zvelebil，Curr.Opin.Oncol， Endocr.Metab.Invest.Drugs2000，2(1)，74-82)、PTK-787(Wood等，Cancer Res.2000， 5(9(8)，2178-2189)、SU-1124S(Demetri等，Proceedings of the American Symposium  Cinical Oncology2004，23，摘要3001)、ZD-6474(Hennequin等，92次AACR会议， 新奥尔良，2002年3月24-28日，摘要3152)、AG-13736(Herbst等，Gin.Cancer Res. 2003，9，16(增刊1)，摘要C253)、KRN-951(Taguchi等，95次AACR会议，奥兰 多，FL，2004，摘要2575)、CP-547,632(Beebe等，Cancer Res.2003，63，7301-7309)、 GP-673,451(Roberus等，Proceedings of the American Association of Cancer Research 2004，45，摘要3989)、CHIR-258(Lee等，Proceedings of the American Association of  Cancer Research 2004，45，摘要2130)、MLN-518(Slien等，Blood2003，102，11， 摘要476)、以及AZD-2171(Hennequin等，Proceedings of the American Association of  Cancer Research 2004，45，摘要4539)。

在另一种实施方式中，本发明所述化合物可以与Raf/MEK/ERK转导途径(Avruch 等，Recent Prog.Horm..Res.2001，56，127-155)、或PKB(akt)途径(Lawlor等，J.Cell Sci.2001，114，2903-2910)的抑制剂组合使用。这些抑制剂包括但不限于 PD-325901(Sebolt-Leopold等，Proceedings of the American Association of Cancer  Research2004，45，摘要4003)和ARRY-142886(Wallace等，Proceedings of the American  Association of Cancer Research2004，45，摘要3891)。

在另一种实施方式中，本发明所述化合物可以与组蛋白脱乙酰酶抑制剂组合使用。 这样的物质的例子包括但不限于SAHA(氧肟酸环庚基苯胺)、LAQ-824(Ottmann等， Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 2004，23，摘要3024)、 LBH-589(Beck等，Proceedings of the American Society for Clinical Oncology2004， 23，摘要3025)、MS-275(Ryan等，Proceedings of the American Association of Cancer  Research2004，45，摘要2452)、以及FR-901228(Piekarz等，Proceedings of the American  Society for Clinical Oncology2004，23，摘要3028)。

在另一种实施方式中，本发明所述化合物可以与诸如蛋白酶抑制剂和m-TOR抑 制剂的其他抗肿瘤物质组合使用。这些物质包括但不限于波特珠单抗 (bortezomib)(Mackay等，Proceedings of the American Society for Clinical Oncology  2004，23，摘要3109)和CCI-779(Wu等，Proceedings of the American Association of  Cancer Research2004，45，摘要3849)。

通常，将细胞毒和/或抑制细胞生长的抗肿瘤物质与本发明所述化合物或组合物组 合用于肿瘤治疗会有助于：

(1)与单独用药相比在降低肿瘤生长或甚至消除肿瘤方面产生更好的功效，

(2)为所用化疗药物更少量给药提供条件，

(3)与单独使用化疗药物以及某些其他联合用药相比，提供了在患者中耐受良 好的具有较少有害药理学并发症的化疗治疗方法，

(4)为治疗哺乳动物尤其是人类中更广泛的不同肿瘤类型提供了条件，

(5)在所治疗的患者中产生更高的反应速度，

(6)与常规化疗方法相比在所治疗的患者中产生更长的存活时间，

(7)为肿瘤进程提供更长时间，以及/或

(8)与其他肿瘤药物联合产生对抗作用的已知情况相比，产生至少与所述药物 单独使用相同的功效和耐受性。

实施例

发明书中所使用的缩写如下：

HPLC    高效液相色谱

MS      质谱

ES      电喷雾

DMSO    二甲亚砜

MP      熔点

NMR     核磁共振

TLC     薄层层析

rt    室温

制备4-氨-3-氟苯酚

在用氩净化的干燥烧瓶中填加10％Pd/C(80毫克)随后加入乙酸乙酯(40毫升)溶 液形式的3-氟-4-硝基酚(1.2克，7.64毫摩尔)。混合物在H₂气中振荡4小时。混合物 经Celite垫过滤并将溶剂减压干燥以形成棕褐色固体状的所需产物(940毫克，7.39 毫摩尔；得率97％)；¹H-NMR(DMSO-d₆)4.38(s，2H)，6.29-6.35(m，1H)，6.41(dd， J＝2.5，12.7，1H)，6.52-6.62(m，1H)，8.76(s，1H)。

制备4-(4-氨-3-氟苯氧基)嘧啶-2-羧酸甲酰胺

冷却至0℃的4-氨-3-氟苯酚(500毫克，3.9毫摩尔)的N，N-二甲基乙酰胺(6毫升) 溶液用叔丁醇钾(441毫克，3.9毫摩尔)处理并将棕色溶液0℃振荡25分钟。在混合 物中加入4-氯-N-甲基-2-吡啶羧酰胺(516毫克，3.0毫摩尔)的二甲基乙酰胺溶液(4毫 升)。反应加热到100℃16小时。混合物冷却到室温，用20毫升水结束反应并用乙 酸乙酯(4×40毫升)萃取。结合的有机物用水(2×30毫升)清洗，干燥(MgSO₄)并脱水 产生红褐色油。¹H-NMR表明存在残余的二甲基乙酰胺，因此将所述油溶子二乙醚(50 毫升)并进一步用盐水清洗(5x30毫升)。将有机层干燥(MgSO₄)并浓缩产生950毫克 红棕色固体的所需产物，该产物不经纯化用于以下步骤。

实施例1：制备4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲 酰胺

向4-(4-氨-3-氟苯氧基)吡啶-2-羧酸甲酰胺(177毫克，0.68毫摩尔)的甲苯(3毫升) 溶液添加4-氯-3-(三氟甲基)苯基异氰酸酯(150毫克，0.68毫摩尔)。所述混合物室温 振荡72小时。反应物减压浓缩并将残余物用二乙醚磨碎。所获固体通过过滤收集并 真空干燥4小时以产生所述化合物(155毫克，0.32毫摩尔；得率47％)； ¹H-NMR(DMSO-d₆)2.78(d，J＝4.9，3H)，7.03-7.08(m，1H)，7.16(dd，J＝2.6，5.6， 1H)，7.32(dd，J＝2.7，11.6，1H)，7.39(d，J＝2.5，1H)，7.60(s，2H)，8.07-8.18(m， 2H)，8.50(d，J＝5.7，1H)，8.72(s，1H)，8.74-8.80(m，1H)，9.50(s，1H)；MS(HPLC/ES) 483.06m/z＝(M+1)。

实施例2：制备4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲 酰胺盐酸盐

实施例1所述化合物作为游离碱(2.0克)溶于无水四氢呋喃(15毫升)并加入4M HCl/二氧杂环己烷(过量)。溶液真空浓缩以产生2.32克白色固体。粗盐溶于热的乙醇 中(125毫升)，加入活性炭并将混合物回流加热15分钟。热悬浮液经Celite521垫过 滤并冷却至室温。将烧瓶冷冻过夜。通过抽滤收集晶体固体，用乙醇清洗，随后用 正己烷清洗并风干。母液浓缩并过夜结晶(在冰箱中)。收集第二批固体产物并于第一 批产物合并。无色的盐60℃真空干燥2天。盐酸盐得率是1.72克(79％)。

熔点：215℃

元素分析：

实施例3：制备制备4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧 酸甲酰胺甲磺酸盐

将实施例1的化合物作为游离碱(2.25克)溶于乙醇(100毫升)并加入过量甲磺酸保 存液。溶液真空干燥以获得黄色油状物。添加乙醇并重复浓缩，获得2.41克乳白色 固体。粗盐溶于热的乙醇(约125毫升)并随后缓慢冷却使之结晶。达到室温后，烧瓶 至于冰箱中过夜。通过抽滤收集无色晶体材料；过滤的沉积物用乙醇、随后用正己 烷清洗并风干获得2.05克产物，该产物60℃真空干燥过夜。

熔点：231℃

元素分析：

实施例4：制备4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-3-氟苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲 酰胺苯磺酸盐

将实施例1的化合物作为游离碱悬浮于在乙醇(50毫升)和苯磺酸(0.737克)乙醇溶 液(50毫升)。混合物剧烈振荡并加热。所有溶解的固体物质形成略带红色的溶液。 溶液冷却到室温并划线标记烧瓶。晶体形成难以实现，发现了一些颗粒种，将其加 入溶液并置于冰箱中过夜。烧瓶中形成了浅灰棕色固体。产物通过抽滤破碎并收集。 固体用乙醇、随后用正己烷清洗并风干。产物称重2.05克，得率69％。

熔点；213℃

元素分析；

实施例5：c-Raf(Raf-1)生化检测

用受Lck激酶激活的(磷酸化的)c-Raf酶进行c-Raf生化检测。Lck激活的 c-Raf(Lck/c-Raf)在Sf9昆虫细胞中通过用多角体蛋白启动子控制下表达GST-c-Raf(氨 基酸302-648)和Lck(全长)的杆状病毒共感染产生。两种杆状病毒以2.5感染重数使 用并在感染48小时后收集细胞。

MEK-1蛋白在Sf9昆虫细胞中通过用表达GST-MEK-1(全长)融合蛋白的杆状病 毒以感染重数5感染细胞产生并在感染48小时后收集细胞。对GST-c-Raf302-648 和GST-MEK-1使用了相似的纯化步骤。

转染的细胞在含10mM磷酸钠、140mM氯化钠、pH7.3、0.5％Triton X-100和 蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中以每毫升100毫克湿重细胞的量悬浮。细胞用 Polytron匀浆器破碎并以30,000g离心30分钟。30,000g离心上清用于GSH-Sepharose 层析分离。树脂用含50mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.01％Triton X-100的缓 冲液清洗。含GST-标签的蛋白用含100mM谷胱甘肽，50mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.01％Triton X-100的缓冲液洗脱。纯化的蛋白用含20mM Tris，pH7.5，150 mM NaCl和20％甘油的缓冲液透析。

用3倍稀释液将待测化合物在DMSO中连续稀释至通常介于50μM到20nM的 保存浓度(检测中的终浓度介于1μM到0.4nM)。c-Raf生化检测以放射性filtermat 滤膜检测法的形式在Costar聚丙烯96孔平板(Costar3365)上进行。平板上加载75微 升含50mM HEPES pH7.5，70mM NaCl，80ng Lck/c-Raf和1μg MEK-1的溶液。 随后，在添加ATP之前，在反应中加入2微升连续稀释的单个化合物。用25微升含 5μMATP和0.3μCi[33P]-ATP的ATP溶液启动反应。将平板密封并32℃孵育1小时。 通过加入50微升4％的磷酸终止反应并使用Wallac Tomtec集样器将反应物收集在 P30filtermat滤膜上(PerkinElmer)。滤膜先用1％磷酸并再用去离子水清洗。在微波 炉中将滤膜干燥、在闪烁液中浸润并用Wallac1205β粒子平板计数器(Wallac Inc.， Atlanta，GA，U.S.A.)读取。结果用抑制百分比表示。

抑制％＝[100-(T_ib/T_i)]×100，其中

T_ib＝(含抑制剂的每分钟计数)-(本底)

T_i＝(不含抑制剂的每分钟计数)-(本底)

在这一检测中，本发明所述化合物表现出对raf激酶的有效抑制。

实施例6：p38激酶的试管检测

纯化的具有His标签的p38α2(在大肠杆菌中表达的)在体外实验中被MMK-6激 活具有高特异活性。使用微量滴定板形式，所有反应在100微升体积中进行，其中 反应物在测试缓冲液(25mM HEPES7.4，20mM MgCl₂，150mM NaCl)中稀释得到 0.05μg/孔激活的p38α2以及10μg/孔髓磷脂碱性蛋白。制备待测化合物(5微升10 ％的DMSO水溶液)并在检测体系中稀释以满足介于5nM到2.5μM的终浓度。通过 添加25微升ATP混合物以形成每孔10μM ATP和0.2μCi[γ-³³P]ATP的终浓度 (200-400dpm/pmol ATP)启动激酶检测。平板32℃孵育35分钟并用7微升1N的盐 酸水溶液终止反应。使用TomTec1295集样器(Wallac，Inc.)将样品收集在P30Filtermat 滤膜上(Wallac，Inc.)，并在LKB1205β粒子平板液体闪烁计数器(Wallac，Inc.)中计 数。阴性对照只包含底物和ATP。SW1353细胞检测：SW1353细胞(人软骨肉瘤， ATCC，Bethesda，MD)接种(1000个细胞/100微升DMEM10％FCS/孔)在96孔板中 并孵育过夜。更换培养基后，细胞与待测化合物37℃接触1小时，在此过程中加入 人IL-1(1ng/nL，Endogen，Woburn，WA)和重组人TNFα(10ng/mL)。培养物37℃孵 育48小时，随后通过ELISA(Endogen，Woburn，WA)测定上清液IL-6值。

本发明所述化合物表现出对p38激酶的显著抑制。

实施例7：Bio-Plex磷酸ERK1/2免疫测定

建立了使用激光流式细胞(Bio-Rad)平台的96孔pERK免疫测定法用以检测乳癌 细胞系中基础pERK的抑制。以每孔50,000个细胞的密度将MDA-MB-231细胞涂布 在96孔微量滴定板的完全生长培养基中。为了检测待测化合物对基础pERK1/2抑制 的作用，第二天将MDA-MB-231细胞转移到含0.1％BSA的DMEM中并与0.1％ DMSO中1∶3稀释成终浓度3μM到12nM的待测化合物孵育。细胞与待测化合物孵 育2小时、清洗、并在Bio-Plex全细胞裂解缓冲液A中裂解。样品用缓冲液B按1∶1(体 积比)稀释并直接转移到检测平板或在-80℃冷冻备用。50微升稀释的MDA-MB-231 细胞裂解液与约2000个与抗ERK1/2抗体偶联的5微米的Bio-Plex小珠在振荡器上 室温孵育过夜。第二天进行生物素化的磷酸ERK1/2的夹心免疫检测，小珠在每次孵 育过程中清洗3次并随后将50微升PE-链亲和素用作显色试剂。pERK1/2的相对荧 光单位通过高灵敏度下对25个含Bio-Plex流式细胞(探针)的小珠计数进行检测。通 过将来处理的细胞作为最大值以及无细胞(仅有小珠)作为本底使用基于Excel电子表 格的程序计算IC50。

在这一检测中本发明所述化合物表现出显著的抑制作用。

实施例8：Flk-1(小鼠VEGFR-2)生化检测

在96孔不透明平板(Costar3915)中以TR-FRET方式进行本项检测。反应条件如 下：10μMATP、25nM聚GT-生物素、2nM铕标记的磷酸酪氨酸抗体(PY20Perkin Elmer)、10nM APC(Perkin Elmer)、7nM Flk-1(激酶结构域)、1％DMSO、50mM HEPES pH7.5、10mM MgCl₂、0.1mM EDTA、0.015％BRIJ、0.1mg/mL BSA、0.1％ 巯基乙醇。添加酶启动反应。每孔中的最终反应体积是100微升。反应起始后约1.5 到2.0小时后在Perkin Elmer Victor V Multilabel计数器上615和665纳米处检测平板。 每孔的信号按照比率：(665nm/615nm)×10000进行计算。本发明所述化合物表现出 对VEGFR2激酶的显著抑制。

实施例9：小鼠PDGFR FRET生化检测

本项检测在96孔黑色平板(Costar3915)中进行。使用了以下试剂：铕标记的抗磷 酸酪氨酸抗体pY20(Perkin-Elmer)和Perkin Elmer的链亲和素-APC(目录号 CR130-100)；CIS US的聚GT-生物素以及Protein Biosciences的PDGFR。反应条件 如下：1nM小鼠PDGFR与20μM ATP，7nM聚GT-生物素，1nM pY20抗体，5nM 链亲和素-APC以及1％DMSO在检测缓冲液(50mM HEPES pH7.5，10mM MgCl₂， 0.1mM EDTA，0.015％BRIJ35，0.1mg/mL BSA，0.1％巯基乙醇)中混合。添加酶 启动反应。每孔中的最终反应体积是100微升。90分钟后，通过每孔添加10微升5 μM星形孢菌素(staurosporine)终止反应。反应终止约1小时后在Perkin Elmer VictorV Multilabel计数器上615和665纳米处检测平板。每孔的信号按照比率：(665nm/615 nm)*10000进行计算。本发明所述化合物表现出对PDGFR激酶的显著抑制。

为了计算对于PDGFR和Flk-1的IC₅₀，在酶启动反应之前加入化合物。用在50％ DMSO/50％去离子水中1∶3连续稀释的化合物制备50倍的保存液平板。向检测系统 添加2微升保存液使得1％DMSO中的化合物终浓度介于10μM-4.56nM。数据用 抑制百分比表示：抑制％＝100-((含抑制剂的信号-本底)/(不含抑制剂的信号-本底)) ×100。

实施例10：MDA-MB231增殖检测

人乳癌细胞(MDA MB-231，NCI)在补充了10％高温灭活FBS的常规培养基 (DMEM)中在5％CO₂(体积比)的湿润培养箱中37℃培养。细胞以每孔3000个细胞 的密度接种在96孔培养皿90微升生长培养基中。为了测定T_0h CTG值，接种24小 时后，每孔添加100微升CellTiter-Glo发光试剂(Promega)并室温孵育30分钟。在 Wallac Victor II装置上记录发光值。CellTiter-Glo试剂导致细胞裂解以及产生与所存 在的ATP数量成正比的发光信号，而ATP是与所存在的细胞数量直接成正比的。

待测化合物溶解在100％DMSO中以制备10mM保存液。保存液进一步在生长 培养基中1∶400稀释以获得0.25％DMSO中25μM待测化合物的工作液。待测化合 物在含0.25％DMSO的生长培养基中连续稀释以保持所有孔中恒定的DMSO浓度。 每个培养孔中加入60微升稀释的待测化合物以形成180微升的最终体积。含有及不 含单独待测化合物的细胞孵育72小时并如先前所述检测ATP依赖的发光值以得到 T72h值。任选使用化合物浓度对抑制百分比的最小二乘分析程序可以确定IC₅₀值。

抑制％＝[1-(T_72h待测-T_0h)/(T_72h对照-T_0h)]x100，其中

T_72h待测＝存在待测化合物情况下72小时的ATP依赖发光值

T_72h对照＝不存在待测化合物情况下72小时的ATP依赖发光值

T_0h＝零时间的ATP依赖发光值

使用本项检测，本发明所述化合物表现出对增殖的显著抑制作用。

实施例11：AoSMC细胞中的pPDGFR-b夹心ELISA检测

使用常规细胞培养技术将100K P3-P6Aortic SMC(Clonetics，CC-2571)细胞接种 在每孔1000微升SGM-2(Clonetics，目录号CC-3182)的12孔平板上。第二天，将细 胞用1000微升D-PBS(Gibco)冲洗一次，随后在500微升含0.1％BSA(Sigma，目录 号A9576)的SBM(Clonetics)(平滑肌细胞基础培养基)中无血清培养过夜。化合物在 DMSO中通过10倍稀释步骤稀释成浓度介于10uM to1nM(最终DMSO浓度为 0.1％)。通过在水槽中快速倒置去除旧的培养基，随后在每个对应的细胞孔中添加100 微升每种稀释度的化合物并37℃孵育1小时。随后用10ng/mL PDGF BB配体 (Leinco)37℃刺激细胞7分钟。倒出培养基并添加150微升含蛋白酶抑制剂片剂(完 整的，不含EDTA)和0.2mM钒酸钠的等压裂解缓冲液(M-PER，Pierce)。细胞在振 荡器上4℃裂解15分钟。裂解液移至离心管，添加15微升琼脂糖偶联的抗PDGFR-b 抗体(Santa Cruz，sc-339)并4℃孵育过夜。第二天，将琼脂糖小珠用50倍体积的PBS 冲洗3次并在1x LDS上样缓冲液(Invitrogen)中煮沸5分钟。样品在3-8％的梯度Tris- 醋酸凝胶(Invitrogen)上分离并转移到硝酸纤维素上。膜在1％BSA/TBS-T中封闭1 小时，随后在封闭缓冲液(1∶1000稀释)中与抗磷酸PDGFR-b(Tyr-857)抗体孵育1小时。 用TBS-T清洗3次后，膜在羊抗兔HRP IgG(Amersham，1∶25000稀释)中孵育1小时。 再清洗3次，随后添加ECL底物。膜对Hyperfilm-ECL底片曝光。随后，将膜剥离 并于抗PDGFR-b抗体(Santa Cruz，SC-339)杂交以检测总PDGFR-b。

表1说明了p38激酶、PDGFR激酶和VEGFR2激酶的体外激酶生化检测结果。 这三个目标激酶都参与了间质激活和内皮细胞增殖，这导致血管生成和向肿瘤组织 供血。

表1

表2说明了raf激酶活性的两种细胞检测结果，它们是(i)MDA-MB231细胞中 pERK的抑制，这是raf激酶活性的机械读数；以及(ii)MDA-MB231细胞的增殖检测， 这是raf激酶活性的功能检测。此外，表2说明了动脉平滑肌细胞中PDGFR驱动的 PDGFRβ磷酸化的结果，这是PDGFR激酶抑制的机械读数。

表2

总而言之，本发明所述化合物提供了对血管生成和肿瘤细胞增殖进行抑制的独特 组合。它们也对诸如raf、p38、PDGFR和VEGFR-2等多个关键的激酶靶点具有改 善的抑制特点，上述分子都是对于治疗骨质疏松症、炎性疾病以及包括肿瘤在内 的过度增殖性疾病而言感兴趣的分子靶点。

相信精通本领域的人员通过使用上述信息以及本领域内可以利用的信息能够 在最完整的范围内采用本发明。对于本领域一般技术人员而言显而易见的是，对 本发明可以加以改变和改进而没有超越如这里所述的本发明的精神或范围。上下 文中所引用的所有出版物、申请书和专利通过参考组合在本说明书中。

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