法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-09-10
授权
授权
2013-01-23
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K36/484 申请日:20100526
实质审查的生效
2012-11-28
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种用于促进血液循环和血管健康的包含豆类提取物的组合物。
背景技术
随着饮食习惯的改变，现代人摄取更多的脂肪。但他们倾向少量运动并承受不同的压力。随着饮食生活的改变，包括高血压，动脉硬化和血液循环障碍的不同疾病正在上升。特别低，血液循环障碍被认为会引起记忆下降，困倦，注意力不集中，慢性疲劳等症状。
血液循环是指身体内的血流以特定方向流动，而血液循环障碍指血管变得缺乏弹性，且胆固醇等沉积在血管的内壁，导致血管变窄以及血液循环的中断。
由于血液循环障碍引起的疾病包括心血管疾病，例如高血脂，动脉硬化，心肌梗死，脑血栓等。在心血管疾病当中，高血压，动脉硬化，心脏病和中风被认为是引起年轻人群死亡的主要原因之一。
如果血液循环障碍没有得到治疗，将会导致维持日常生活中的困难，以及在严重的情况下，导致不同的疾病和死亡。因此，对于血液循环障碍引起的疾病，防止被认为比治疗更为重要。虽然目前使用临床的心血管疾病药物，但这些药物昂贵并可能引起不同的副作用。
发明内容
技术问题
本发明在于提供一种用于改善血液循环的组合物。
本发明同样在于提供一种用于改善血管健康的组合物。
本发明同样在于提供一种用于改善血液循环的药物组合物。
本发明同样在于提供一种用于改善血管健康的药物组合物。
本发明同样在于提供一种用于促进血液循环的健康食品组合物。
本发明在于提供一种用于促进血管健康的健康食品组合物。
技术方案
本发明在总体上提供一种包含豆类提取物作为有效成分的组合物，该提取物通过低浓度，低级醇或其馏分进行提取。
有益效果
本发明的组合物在改善血液循环上具有优越的效果，并有效地用于包括肥胖症，糖尿病，高血脂等心血管疾病的防治，改善或治疗。
附图说明
图1展示了不同浓度大黄豆提取物的血小板凝聚抑制作用。
图2展示了口服大黄豆提取物的凝血抑制作用。
图3展示了长时间口服大黄豆提取物的凝血抑制作用。
图4展示了不同浓度大黄豆提取物的乙酸乙酯馏分的血小板凝聚抑制作用。
图5展示了口服大黄豆提取物的乙酸乙酯馏分的凝血抑制作用。
图6概要展示了大黄豆提取物的乙酸乙酯馏分的分离和提纯过程。
图7~9展示了针对大黄豆提取物的乙酸乙酯馏分进行的血小板凝聚检测结果。
图10展示了不同浓度大黄豆提取物的最终提纯乙酸乙酯馏分与不同浓度的腺苷对血小板凝聚的影响的比较结果。
图11展示了不同浓度的大黄豆提取物对血小板凝聚的影响的测定结果。
图12展示了不同浓度的腺苷对血小板凝聚的影响的测定结果。
图13展示了经过或未经大黄豆提取物治疗时，因溶血磷脂酸（LPA）和磷脂酸（PA）引起的磷脂酰丝氨酸（PS）暴露的程度。
图14展示了经过或未经大黄豆提取物治疗时，因溶血磷脂酸（LPA）和磷脂酸（PA）引起的的微泡（MV）产生的程度。
图15展示了经过或未经大黄豆提取物治疗时，因溶血磷脂酸（LPA）和磷脂酸（PA）引起的凝血酵素产生的程度。
图16和17展示了用不同浓度的大黄豆提取物治疗后，前凝血酶时间(PT) 和部份活化凝血活酶时间（aPTT）的测定结果。
图18比较了分别用大黄豆提取物、阿司匹林或氯吡格雷治疗时的出血时间。
具体实施方式
对豆类的在先研究主要集中在从豆类中分离和提纯具有药物学活性的有效成分，而对豆类本身的药物用途的研究却不充足。此外，一般使用的提取方式为使用高浓度有机溶剂。
豆类提取物包含许多还未被认识的成分，其中某些成分对人体展现出有用的药理作用。与天然产品或草药提取所使用的普通方法不同，本发明的发明人已经获得一种使用低浓度，低级醇作为提取溶剂的豆类提取物，这种豆类提取物比使用高浓度有机溶剂来提取的豆类提取物展现出更高的抗血栓形成的效果。
本发明的组合物包括使用低浓度有机溶剂进行提取的豆类提取物或所提取的豆类提取物的馏分。在一个实施例中，有机溶剂可以为C1-C5醇，但不限于此。C1-C5醇可以为例如：甲醇，乙醇，异丙醇，正丙醇，正丁醇和异丁醇中的至少一种，特别是乙醇。在另一个实施例中，C1-C5醇的浓度可以为1-70% (v/v)， 特别为1-40% (v/v)，更特别为5-25% (v/v)，更特别为7-20% (v/v)。例如，溶剂可以为10% 或20% (v/v)的乙醇。
本发明的组合物通过使用低浓度，低级醇对豆类进行提取来获得。通过不同的研究和重复的实验，本发明的发明人认识到使用不同有机溶剂中的低级醇，例如，乙醇，尤其是低浓度的乙醇来提取得到的豆类提取物在促进血液循环和血管健康上都具有效果，并因此在肥胖，糖尿病或高血脂的减缓以及治疗上都非常有用。
豆类提取物的馏分指一种从豆类提取物中进一步分馏而隔离出来的组合物。在一个实施例中，豆类提取物的馏分可以为C1-C5醇提取物中的乙酸乙酯或丁醇馏分，特别是乙酸乙酯馏分，本申请的发明人已经获得从使用低浓度乙醇提取的豆类提取物而来的不同馏分。结果，乙酸乙酯或丁醇馏分比水的馏分展示出更好的促进血液循环效果。特别地，乙酸乙酯馏分展示出更优越的效果。
本发明的包含豆类提取物或豆类提取物的馏分的组合物具有通过抑制血小板凝聚而阻止血凝以及通过抑制血管收缩而引起血管舒张的功效。此外，该组合物通过抑制胆固醇的增加而具有降低血液和肝脏脂肪的效果。因此，该组合物在促进血液循环和血管健康上具有功效，并可以有效地用于治疗或阻止肥胖，糖尿病，高血脂等疾病。
在一个实施例中，豆类提取物或该提取物的馏分可以包括作为标记或功能性成分的腺苷。本申请的发明人分离并提纯豆类提取物或该提取物的馏分。在测量该分离或提纯的产物的活性后，证实包含有腺苷。在一个实施例中，所含有腺苷的含量占豆类提取物或该提取物馏分总重量的0.01-1.0 wt%，更特别为0.1-0.6 wt%。也就是说，本发明的使用低浓度，低级醇提取得到的豆类提取物包含相对高含量的活性成分，如：腺苷。
只要豆类提取物或其馏分具有促进血液循环的功效，所采用的豆类并非受到限制。在一个实施例中，豆类可以为黑豆或彩豆。在另一个实施例中，豆类可以选自大黄豆（Glycin max MERR)，鹿豆(Rhynchosia Nolubilis)，黑大豆(Glycine max(L.) Merr. )，蓝豆（Glycime max MERR），黄豆(Glycime max MERR)，蚕豆(Vicia faba)，四季豆（Phaseolus vulgaris），黑白斑豆(Phaseolus vulgaris L. )，赤小豆（Vigna angulari），赤豆（Phaseolus angularis .F.WIGHT.），豆芽(Glycine max (L.) Merr. )和大豆(Glycine max)的至少一种。更特别地，豆类可以为大黄豆或蚕豆。
在此使用的术语“黑豆”广泛地指代一种谷粒展现出黑色的豆类。该黑豆并非受到特别限制。例如，可以为黑大豆(Glycine max)，大黄豆(Glycin max MERR)，鹿豆(Rhynchosia Nolubilis)，黑大豆(Glycine max(L.) Merr. )等。黑豆在不同的区域叫法不一样。而术语“黑豆提取物”广泛地指代从黑豆中提取的物质。例如，包括从有机溶剂中提取出来的物质并同样包括该提取物不同的馏分。
同样，在次使用的术语“彩豆”广泛地指代其谷物展现深颜色的豆类，不止是黑色，还有红色，黄色或蓝色。彩豆的实施例包括：大黄豆(Glycin max MERR)，鹿豆(Rhynchosia Nolubilis)，黑大豆(Glycine max(L.) Merr. )，蓝豆(Glycime max MERR)，黄豆(Glycime max MERR)， 蚕豆(Vicia faba)，四季豆(Phaseolus vulgaris)，黑白斑豆(Phaseolus vulgaris L. )，赤小豆(Vigna angularis)，赤豆（Phaseolus angularis .F.WIGHT.），豆芽(Glycine max (L.) Merr. )和大豆(Glycine max)，但不限于这些种类。该彩豆在不同的地区可以有不同的叫法。而术语“彩豆提取物”则广泛指从彩豆中提取的物质。例如，包括从有机溶剂提取的物质，且包括不同的提取物的馏分。
本发明提供了一种包括上述组合物的药物组合物。在一个实施例中，该药物组合物可以为用于促进血液循环，防止心血管疾病，或减轻或治疗相关症状的药物组合物。本发明的药物组合物具有防止凝血，抑制血管收缩和/或减少胆固醇的效果。特别地，该药物组合物为通过抗血栓形成的功效来促进血液循环，或减轻或治疗包括肥胖，糖尿病，高血脂等疾病的药物组合物。心血管疾病可以包括，例如，肥胖，糖尿病，中风，脑出血，动脉硬化，心绞痛，心肌梗塞，高血压，贫血，头痛，高血脂等疾病。
本发明的组合物作为药物使用时，通过加入普通使用的用于口服或肠胃外服用的有机或无机载体以固体，半固体或液体的形成来制备。
口服的配方可以药片，药丸，颗粒，软/硬胶囊，粉，细化颗粒，粉末，乳液，糖浆，药球等。肠胃外用药的配方可以为注射，点滴，药膏，洗液，喷雾，悬浮液，乳状液，栓剂等。本发明的有效成分可以通过普通的方式，使用常用的佐剂，如：表面活性剂，赋形剂，着色剂，香料，防腐剂，稳定剂，缓冲剂，悬浮剂等制成上述配方。
该药物组合物可以口服或肠胃外服用，例如，直肠给药，局部给药，经皮渗透给药，静脉注射，肌肉或皮下注射。
有效成分的服用取决于个体的年龄，性别和体重，尤其是疾病或有待治疗的病理状态，疾病或病理状态的严重性，用药途径或医生的决定。基于这些因素的服用剂量的确定在本领域技术人员的知识范围内。一般的用量为0.001-2000 mg/kg/d，更确定地为0.5-1500 mg/kg/d。
在一个实施例中，本发明提供了一种食品添加剂，一种包含本发明的组合物的功能性食品或健康食品。确切地，该组合物可以为用于促进血液循环，或减轻或治疗包括肥胖，糖尿病，高血脂等疾病的健康食品组合物。心血管疾病包括例如：肥胖，糖尿病，中风，脑出血，动脉硬化，心绞痛，心机梗死，高血压，贫血，偏头痛，高血脂等疾病。
本发明提供了包含本发明上述组合物的不同的食品添加剂或功能性食品。该组合物可以加工成发酵牛奶，芝士，酸奶，果汁，益生菌，食品补充剂或其他食品添加剂。
在一个实施例中，该组合物还可以包括在不负面影响本发明主要功效范围内的具有协同功效的其它成分。例如，还可以包括用作香料，天然色素，消毒剂，抗氧化剂，防腐剂，湿润剂，增稠剂，矿物质，乳化剂，合成聚合物等添加物来用于改善物理特性。此外，还可以包括水溶性维生素，油溶性维生素，多肽，多糖，海藻提取物等的辅助成分。本领域技术人员在考虑配方种类或用途目的时能轻易地选择并混合这些成分，而这些成分可以在不负面影响本发明的作用和功效的情况下来确定使用。例如，这些成分的加入量可以占组合物总重量的0.01-5 wt%，更确定地为0.01-3 wt%。
本发明的组合物可以具有不同形式，包括：溶液，乳液，不同的混合物，药片，粉末等，并以不同方式进行服用，包括：饮用，注射，喷雾，挤榨等。
实施例
以下将结合非限制性实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：10%乙醇的大黄豆(Glycin max MERR)提取物的制备：
将干的大黄豆(1 kg)在50℃下浸入10%的乙醇溶液(10 L)中。在5小时的回流条件下进行3次提取后，并在室温下停留12小时之后过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为7-20%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例2：20%乙醇的大黄豆(Glycin max MERR)提取物的制备：
将干的大黄豆(1 kg)在50℃下浸入20%的乙醇溶液(10 L)中。在5小时的回流条件下进行3次提取，并在室温下停留12小时之后过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为7-20%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例3：50%乙醇的大黄豆(Glycin max MERR)提取物的制备：
将干的大黄豆(1 kg)在50℃下浸入50%的乙醇溶液(10 L)中。在5小时的回流条件下进行3次提取，并在室温下停留12小时之后过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为7-20%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例4：70%乙醇的大黄豆(Glycin max MERR)提取物的制备：
将干的大黄豆(1 kg)在50℃下浸入70%的乙醇溶液(10 L)中。在5小时的回流条件下进行3次提取，并在室温下停留12小时之后过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为7-20%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例5：20%乙醇的鹿豆(Rhynchosia Nolubilis)提取物的制备：
将干的鹿豆(1 kg)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例6：20%乙醇的四季豆(Phaseolus vulgaris)提取物的制备：
将干的四季豆(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例7：20%乙醇的黑白斑豆(Phaseolus vulgaris L.)提取物的制备：
将干的黑白斑豆(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在的回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例8：20%乙醇的豆芽(Glycine max (L.) Merr.)提取物的制备：
将干的豆芽(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例9：20%乙醇的黄豆(Glycime max MERR)提取物的制备：
将干的黄豆(1 kg)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(5 L)中。在3小时的回流条件下进行2次提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例10：20%乙醇的蓝豆(Glycime max MERR)提取物的制备：
将干的蓝豆(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例11：20%乙醇的蚕豆(Vicia faba)提取物的制备：
将干的蚕豆(1 kg)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例12：20%乙醇的大豆(Glycine max)提取物的制备：
将干的大豆(1 kg)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例13：20%乙醇的赤豆(Phaseolus angularis .F.WIGHT.)提取物的制备：
将干赤豆(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，将提取物进行过滤，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例14：20%乙醇的赤小豆(Vigna angularis)提取物的制备：
将干的赤小豆(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例15：20%乙醇的黑大豆(Glycine max(L.) Merr.)提取物的制备：
将干的Heuktae黑大豆(300 g)在60℃下浸入20%的乙醇溶液(1.5 L)中。在回流条件下进行3小时的提取，并在室温下停留预定时间，过滤提取物，在减压的条件下浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为3-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例16：大黄豆(Glycin max MERR)丁醇提取物的制备：
将从实施例2而来的20%乙醇的大黄豆提取物(25 g)溶解在蒸馏水(250 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(250 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例17：鹿豆(Rhynchosia Nolubilis)丁醇提取物的制备：
将从实施例5而来的20%乙醇的鹿豆提取物(1 g)溶解在蒸馏水(10 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(10 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例18：蚕豆(Vicia faba)丁醇提取物的制备：
将从实施例11而来的20%乙醇的蚕豆提取物(25 g)溶解在蒸馏水(250 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(250 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例19：蓝豆(Glycime max MERR)丁醇提取物的制备：
将从实施例10而来的20%乙醇的蓝豆提取物(1 g)溶解在蒸馏水(10 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(10 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例20：黄豆(Glycime max MERR)丁醇提取物的制备：
将从实施例9而来的20%乙醇的黄豆提取物(1 g)溶解在蒸馏水(10 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(10 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例21：豆芽(Glycine max (L.) Merr.)丁醇提取物的制备：
将从实施例8而来的20%乙醇的豆芽提取物(1 g)溶解在蒸馏水(10 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(10 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例22：大豆(Glycine max)丁醇提取物的制备：
将从实施例12而来的20%乙醇的大豆提取物(25 g)溶解在蒸馏水(250 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(250 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例23：四季豆(Phaseolus vulgaris)丁醇提取物的制备：
将从实施例6而来的20%乙醇的四季豆提取物(1 g)溶解在蒸馏水(10 mL)中。通过分液漏斗用正丁醇(10 mL)提取2次，所获得的丁醇层在减压条件下进行浓缩，并冻干以制备粉末样品。制备产率为5-15%，所制备的粉末在低温下保存直到使用。
实施例24：大黄豆(Glycin max MERR)提取物的馏分的制备：
将干燥的大黄豆在50℃下（1 kg）浸入20%的乙醇溶液中。在5小时的回流条件进行3次提取，并使其在室温下停留12小时，过滤提取物并在减压条件下浓缩。
往浓缩过滤液中加入5倍体积的乙酸乙酯溶液，并在室温下停留，使得在乙酸乙酯层和水层之间发生分离，仅取乙酸乙酯层，并冻干以制备馏分。所制备的粉末在使用前存放在低温条件下。
对比实施例：使用水来制备大黄豆(Glycin max MERR)提取物
将干燥的大黄豆(1 kg)在100℃下浸入20%的水中。在5小时的回流条件下进行3次提取，并在室温下停留12小时，过滤提取物并在减压条件下浓缩以制备粉末样品。产率为7-20%，而所制备的粉末在使用前存放在低温条件下。
测试实施例1：大黄豆(Glycin max MERR)提取物对胶原引起的人体血小板凝聚的抑制。
进行如下实验以比较取决于乙醇浓度的提取物的活性。
为了分离人体富含血小板的血浆(在此称为：PRP)，使用作为抗凝血剂的3.2%柠檬酸钠，从超过2周不吃药的健康人的静脉中取得血液。将该血液（150 g）进行15分钟离心。在分离上层清液（在此称为：PRP）后，剩余物再次进行离心以分离去血小板血浆（在此称为：PPP）。用光学显微镜对分离的PRP进行计算，并用PPP对PRP进行稀释，使得每1mL中包括3×108的血小板。
通过使用生物发光凝集测定仪(Chrono-Log Co., USA)来测定吸收的改变以鉴定血小板的凝聚活性。在加入100 μg/mL的大黄豆提取物至PRP后，在恒温混匀器中进行10分钟的培养，经培养的PRP(495 μL)置于硅涂层试管中以对血小板凝聚进行测量，并进一步潜伏达1分钟直到温度达到37℃。随后，加入浓度为5 μg/mL（获得最大凝聚）的引发血小板凝聚的胶原后，对反应进行5分钟的观察。结果展示在表1。在表1中，抑制血小板凝聚的数值为相对于用0%胶原处理的对照组的数值。
表1
如表1所示，10%和20%乙醇的提取物比其他提取物展示出更好的抑制血小板凝聚效果。特别地，10%的乙醇提取物展示出最好的效果。
同样，通过实验来鉴定20%乙醇提取物对血小板抑制效果的浓度依赖性。首先，在加入浓度为10, 25, 50 和100 μg/mL的提取物后进行如上所述的同样实验。对血小板凝聚抑制的评价是相对于用0%胶原处理的对照组的血小板凝聚的抑制进行的。如图1所示，20%乙醇的提取物表现出依赖浓度的抑制血小板凝聚的效果，并展现出抗血凝的优越效果。
测试实施例2：蚕豆(Vicia faba)提取物对胶原引起的人体血小板凝聚的抑制
进行如下实验来以对依赖乙醇浓度的提取物的活性进行对比。
为了分离人体PRP，使用作为抗凝血剂的3.2%柠檬酸钠，从超过2周没有服用药物的健康人的静脉中取得血液。将血液(150 g)进行15分钟的离心。在分离上层清液(PRP)后，对剩余物再进过离心以分离PPP。在所分离的PRP中计算血小板的数量，而该PRP用PPP进行稀释，使得每1 mL包含3×108的血小板。
通过使用生物发光凝集测定仪(Chrono-Log Co., USA)测定吸收的改变以鉴定血小板的凝聚活性。在加入200 mg/mL的蚕豆提取物至已经在37℃的恒温混匀器中培养了2分钟的PRP后，再进行7分钟的培养，将所培养的PRP（500 μL）置于硅涂层的试管中以测定血小板的凝聚，并进一步培养3分钟。随后，在加入浓度为1-3 μg/mL（获得最大凝聚时的最低浓度）的引发血小板凝聚的胶原后，对反应进行6分钟的观察。结果展示在表2。在表2中，抑制血小板凝聚的数值为相对于用0%胶原处理的对照组的数值。
表2
从表2中，10%和20%的乙醇提取物比其它提取物展示出更好的抑制血小板凝聚的效果。特别地，20%的乙醇提取物展示出最好的抑制血小板凝聚的效果。
测试实施例3：不同豆类对人体血小板凝聚的抑制效果
在20%乙醇提取的条件下展示了最好的活性，为了研究黑豆对血小板凝聚的效果而进行以下实验。在该实验中所使用的豆类都是产自韩国。
对大黄豆，鹿豆和黑大豆进行实验。用实施例2的相同的方式进行提取。为了研究抑制血小板的凝聚效果。为了研究血小板凝聚的抑制效果，在测试实施例1的相同条件下使用100 μg/mL豆类提取物来进行实验。
表3
从表3可以看出，大黄豆，鹿豆，黑大豆展示出较高的抑制血小板凝聚的功效。因此，大黄豆，鹿豆和黑大豆的低浓度醇提取物具有良好的抑制血小板凝聚的效果。
测试实施例4：不同豆类对人体血小板凝聚的抑制效果
在20%乙醇提取的条件下展示了最好的活性，为了研究黑豆对血小板凝聚的抑制而进行以下实验。在该实验中所使用的豆类全部产自韩国。
对赤豆，大豆，大黄豆，鹿豆，蚕豆，四季豆，赤小豆，蓝豆，豆芽和黄豆进行实验。这些豆类都以上述相同的方式进行提取。为了研究血小板凝聚的抑制效果，本实验与测试实施例2的条件相同，使用200 μg/mL的豆类提取物来进行。
表4
从表4可以看出，大黄豆，鹿豆和蚕豆展示了优越的血小板凝聚的抑制功效。
测试实施例5：对不同原因引起的血小板凝聚的抑制专一性
在20%乙醇提取的条件下，对大黄豆是否针对不同原因的血小板凝聚产生特定的抑制效果进行研究。
众所周知，血小板凝聚是由于血管破坏而暴露于血流的胶原，血小板所分泌的ADPs，血流的压力（切变应力，在此称为, SS)以及凝血酵素所引起的。因此，对于20%低浓度乙醇的大黄豆提取物是否针对胶原，ADP，凝血酵素以及切变应力(SS)具有抑制专一性而进行研究。该评价以测试实施例1的相同方式进行。用ADP，血凝酵素或切变应力来替代胶原。其结果展示在表5中。
表5
如表5所示，20%乙醇大黄豆提取物专门抑制由胶原所引起的血小板凝聚，而对由其它刺激物，即：ADP，血凝酵素或切变应力引起的血小板凝聚没有效果。
测试实施例6：血小板凝聚之后的活性物质的表达和分泌物的抑制效果。
当血小板通过例如胶原的刺激物而凝聚时，它们在其表面上表达特定的蛋白质或在细胞外分泌特定的物质。因此，对20%低浓度乙醇的大黄豆提取物是否可以通过抑制血小板凝聚而降低血小板选择素（P-selectin）的表达和进入血流的血清素分泌物进行研究。
如测试实施例1一样往PRP中加入样品，接着在培养皿中培养10分钟并在加入10 μg/mL的胶原后反应6分钟，将提取物与抗-CD42b-PE和抗-CD62P-FITC一起加入试管中，并在阴凉处反应20分钟。随后，加入蒂罗德缓冲液（Tyrode’s buffer，500 μL）以终止反应。
使用激发荧光细胞分离器 (FACS; BD Bioscience, USA)来测量。血小板选择素表达的程度通过对荧光的减少进行测量，该荧光的减少是由于血小板选择素表达而造成的。该结果展示在表6中。血小板选择素表达的抑制为相对于无处理提取物组100的荧光性而作出的。
表6
从表6可以看出，20%乙醇的大黄豆提取物以依赖的方式降低了血小板表面上的血小板选择素的表达。
通过放射性同位素方法来测量血清素的分泌物。如测试实施例1一样往同样的PRP中加入0.5 μCi/mL的14C-血清素（Amersham Bioscience, CFA170）后，在37℃下处理45分钟，并在加入提取物之后在37℃下反应10分钟，加入2 μg/mL的胶原并反应6分钟。在用EDTA终止反应之后，在12000 x g下离心2分钟。通过液体闪烁计数器(Wallac 1409, Perkin Elmer, USA)测量上层清液中[14C]-血清素的分泌物量。对血清素分泌物的抑制值是相对于对无处理提取物组100而计算出来的。
表7
图表7所示，20%乙醇的大黄豆提取物以依赖浓度的方式降低了进入血流当中的血清素分泌物。
测试实施例7：白化大鼠（SD rat）静脉的血凝抑制
对20%乙醇的大黄豆提取物在活体内对血凝抑制效果进行如下研究。所使用的雄性白化大鼠（在此称为：SD鼠）体重为220-250 g。
给SD鼠口服溶解在生理盐水(300 μL)中的0. 50 或100 μg/mL的大黄豆提取物。一小时之后，腹部注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)，SD鼠基本麻醉。在切开腹部之后，去除脂肪组织以看清尾腔静脉。在去除脂肪组织的时候需要小心以免对附近血管的损伤。在尾腔静脉处放置一张浸泡有5%FeCl3溶液的过滤纸，然后移开。30分钟之后，包括血凝的尾腔静脉在12mm长度处绑扎并随后切开。在将血凝转移到盐水中后，去掉水并称重。结果展示在图2中。
在图2中，可以看到口服100 mg/kg的大黄豆提取物能显著地抑制血凝。
同样，口服50或100 mg/kg的提取物14天，结果显示在图3中。与服用1小时后的结果不同，服用50和100 mg/kg 的提取物显著地抑制了血凝。因此，可以看到使用低浓度乙醇进行提取的大黄豆提取物为良好的抗凝血剂。
测试实施例8：大黄豆提取物对人体血小板凝聚的抑制效果
在20%乙醇提取物的条件下，对于使用哪种馏分能展现优越的活性进行研究。
首先，以实施例25的相同方式制备乙酸乙酯，丁醇和水的馏分。以测试实施例1的方式对每种馏分(100 μg/mL)的血凝抑制效果进行。结果展示在表8中。
表8
从表8中可以看到，乙酸乙酯馏分展示了最好的抑制血小板凝聚效果，接下来是丁醇和水的馏分。因此，可以认为低浓度乙醇提取物的血小板凝聚抑制效果是来自包含在乙酸乙酯馏分中的活性成分。
在展示出良好效果的乙酸乙酯馏分中，其活性依赖于浓度，如图4所示。也就是说，血小板凝聚的抑制效果按照乙酸乙酯浓度10, 25, 50 和 100 μg/mL的顺序递增。
测试实施例9：不同豆类的丁醇馏分对血小板凝聚的抑制效果
进行如下实验，以鉴定不同豆类的丁醇馏分对血小板凝聚的抑制效果。
以测试实施例2的相同方法对大豆，鹿豆，大黄豆，蚕豆，四季豆，蓝豆，豆芽和黄豆的丁醇馏分对血小板凝聚的抑制效果进行评定。结果显示在表9中。
表9
从表9中可以看出，所有豆类的丁醇馏分展示出优越的血小板凝聚的抑制效果。
测试实施例10：乙酸乙酯馏分对不同成因的血小板凝结的抑制专一性
以测试实施例5的方式进行实验，以研究乙酸乙酯馏分(50 和 100 μg/mL)对不同成因的血小板凝结的抑制专一性。结果展示在表10。
表10
如表10所示，乙酸乙酯馏分以依赖浓度的方式抑制胶原的活性。
测试实施例11：乙酸乙酯馏分在血小板凝聚后对活性物质的表达和分泌物的抑制效果。
为了研究血小板凝聚后大黄豆的乙酸乙酯提取物对血小板选择素，血清素分泌物以及凝血氧烷产生的减少，以测试实施例6的相同方式对血小板选择素和血清素进行实验。通过往测试实施例1中使用的PRP加入乙酸乙酯馏分来评定凝血氧烷产生的抑制，在37℃下培养10分钟，加入胶原(10 μg/mL)，然后再培养6分钟。将某些样品加入包含EDTA和茚甲新的试管中以中止反应。在进行2分钟12000 x g的离心之后，将上层清液通过酶免疫测定来对所产生的凝血氧烷进行量化。
乙酸乙酯馏分对血小板选择素的抑制展示在表11中，对血清素分泌物的抑制展示在表12，而对产生凝血氧烷的抑制展示在表13。
表11
表12
表13
从表11,12和13中可以看出，大黄豆的乙酸乙酯馏分以依赖浓度的方式减少了血小板选择素的表达，抑制了血清素分泌物，并抑制凝血氧烷的生成。
测试实施例12：乙酸乙酯馏分对SD鼠静脉血凝的抑制。
以测试实施例7的相同方式进行实验，以研究在活体内服用乙酸乙酯馏分是否会提供抑制凝血的效果。实验的口服用量为10，25和50 mg/kg，在服用1小时候后测定血凝产生的量。该结果展示在图5中。
从图5中可以看到，乙酸乙酯的口服以依赖浓度的方式抑制血凝。
测试实施例13：对SD鼠而来的血小板凝聚的抑制效果
以测试实施例1的相同方式是进行实验，以研究大黄豆的低浓度乙醇提取物和乙酸乙酯馏分是否对从SD鼠而来的血小板凝聚具有抑制效果。处理浓度为10，25，50和100 μg/mL，结果展示在表14中。
表14
如表14所示，不只是乙醇低浓度提取物，还有乙酸乙酯馏分以依赖浓度的方式展示出良好的抑制SD鼠血小板凝聚的效果。
测试实施例14：使用血管环来观察血管收缩的抑制效果
从Daehan Biolink（韩国首尔）而来的用于实验的雄性SD鼠重量为250-300 g，这些鼠处于温度为22±2℃，湿度为45-55%，12/12小时/光照/黑暗循环的环境下，并在1周的时间内自由地喂食和饮水。
通过放血结束鼠的生命，切开胸腔，将胸主动脉快速取出并转移到充满95% O2/5% CO2混合气体的KR缓冲溶液[成分(mM)：NaCl 115.5, KCl 4.6, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, CaCl2 2.5, NaHCO3 25.0, Ca2+ EDTA 0.026, 葡萄糖 11.1; pH 7.4]中。通过去除血管中的血液，邻近的脂肪和连接的组织来预备一个3-4mm长得血管环。在开始的30分钟逐渐对血管环施加压力直到达到平衡后，用10-6 M的苯肾上腺素来收缩血管，并用10-6 M的乙酰胆碱使其膨胀。使用血管舒张达到80%或以上的血管。通过将水浴中的缓冲剂替换为KR缓冲剂来引起最大的血管收缩，该KR缓冲剂包含充满95% O2/5% CO2混合气体的90 mM KCl。通过用不同浓度的大黄豆提取物对血管进行30分钟的预处理后，在水浴中，用浓度逐渐增加的苯肾上腺素来引起血管收缩。由苯肾上腺素和90 mM KCl引起的血管收缩展示在表15和表16中。
表15
从表15中可以看到，血管收缩随着苯肾上腺素浓度而增加。用100 μg/mL大黄豆提取物的处理导致了依赖浓度的血管收缩抑制效果。
表16
从表16可以看出，用25和50 μg/mL的大黄豆提取物的使用导致了依赖浓度的血管收缩的抑制功效。因此，可见20%乙醇的大黄豆提取物提供了良好的血管收缩抑制效果。
测试实施例15：降低动物中的血清和肝脏的油脂水平。
将重量为250-300 g的8岁雌性鼠置于聚碳酸脂的笼子里，每个笼子里面装8只，并保持在温度为22±2℃，相对湿度为55±15%的12/12小时的光照/黑暗循环环境下。对这些鼠提供正常或高胆固醇的喂食和自由饮用的水。
将用于治疗高血脂的非诺贝酸(200 mg/kg)置于1%的甲基纤维素(MC)中并进行用于口服来作为正面对照。连续4星期每天口服大黄豆提取物(200 mg/kg)。在禁食12小时后，从眼球后血管从取出血液样品并在10000 rcf（相对离心力）下离心10分钟。在离心之后，对所获得血清中的总胆固醇，LDL-胆固醇，HDL-胆固醇和甘油三酯水平进行评定。
该分析通过使用自动血液分析仪和罗氏诊断套件进行。结果展示在表17（血清油脂）和表18（肝脏油脂）中。
表17
从表17中可以看出，4周喂食高胆固醇的对照组中的鼠其总胆固醇含量为正常组的2倍，而LDL-胆固醇水平为正常组的4.4倍。这结果表明高血脂由高胆固醇饮食所引起的。与对照组相比，喂食大黄豆提取物和高胆固醇组的总胆固醇水平(156.42 mg/dL)比对照组要低28%，而LDL-胆固醇比对照组也低28%。
表18
表18展示了肝脏总胆固醇和甘油三酯水平。经证实，对照组中高胆固醇的饮食引起脂肪肝。食用大黄豆提取物的组其胆固醇水平下降52%，而甘油三酯水平下降25%。因此，大黄豆提取物被证实具有改善活体中血清和肝脏脂肪水平。
测试实施例16：大黄豆提取物的馏分中有效成分的分析
为了分析大黄豆提取物中的活性成分，对乙酸乙酯的馏分进行分析导向分馏方法。整个乙酸乙酯馏分中活性成分的分离和提纯方案展示在图6中。
在图6中，对实施例25获得的20%乙醇的大黄豆提取物的乙酸乙酯馏分A-2进行固相提取。在固相提取中，使用50-100% (v/v)的甲醇(MeOH)溶液作为提取溶剂。固相提取的提取物分馏为A-3至A-9。对该提取物的血小板凝聚进行评定，结果展示在图7。从图7中可以看到，提取物A-3和A-4展示出相对低的血小板凝聚。
将展示出相对较低血小板凝聚的提取物A-3和A-4进行柱层析法(Sephadex LH 20 柱层析)对组分进行分离。所分离的组分从A-3-1至A-3-10进行编号，并对其进行血小板凝聚评定，结果展示在图8中。如图8所示，在A-3-1至A-3-10当中，A-3-1展示出最低的血小板凝聚。
将展示出最低血小板凝聚的样品A-3-1经过高效液相色谱法(制备柱,十八烷基硅烷 HPLC)分离有效成分。所分离的成分从A-3-1-1至A-3-1-7进行编号。对这些成分进行血小板凝聚的评定，结果展示在图9中。从图9中可以看出，A-3-1-3展示出最低的血小板凝聚。因此，A-3-1-3展示出最好的血小板凝聚抑制活性。
将A-3-1-3对血小板凝聚的抑制活性与标准腺苷相比，结果展示在图10中。从图10中可以看出，A-3-1-3展示出和腺苷相当的效果，这表明了A-3-1-3具有腺苷。腺苷的化学式如下所示：
(1)
测试实施例17：包含在20%乙醇大黄豆提取物中腺苷的检测。
将20%乙醇的大黄豆提取物的活性与标准腺苷相比，结果展示在图11和12。在图11和12中，与标准腺苷相比，20%乙醇的大黄豆提取物中腺苷的含量计算为0.35~0.5%。也就是说，使用低浓度，低级醇的大黄豆提取物具有相当高的腺苷含量。此外，大黄豆提取物要比单纯的腺苷更能抑制血凝。因此，相对于单纯使用腺苷来说，大黄豆提取物被认为对血凝具有更稳定的抑制作用。
测试实施例18：20%乙醇的豆类提取物中腺苷含量的测定
对包含大黄豆的不同豆类的20%乙醇提取物中腺苷含量的测定。结果展示在表19中。
表19
从表19中可以看出，在不同的豆类中，腺苷的含量为15%或更高。特别是大黄豆和蚕豆，展示出相对较高的腺苷含量。
测试实施例19：大黄豆(Glycin max MERR)提取物在血红细胞中对血凝的抑制活性。
对于豆类提取物是否会影响血红细胞对磷脂酰丝氨酸（在此称为：PS）的暴露和微泡的产生进行研究，其中该血红细胞对磷脂酰丝氨酸的暴露和微泡(在此称为：MV)的产生是由于炎症中生成的溶血磷脂酸（在此称为：LPA）和磷脂酸（在此称为：PA）而引起的。
一般来说，当血红细胞暴露于PS或产生MV时容易产生血凝。当在炎症部位使用大黄豆提取物之后，测定对由于LPA和PA引起的PS暴露和MV产生的抑制。特别地，在加入大黄豆提取物(100 μg/mL)1小时之后，加入50 μM LPA或25 μM PA15分钟来引发PS暴露和MV产生。随后，在使用大黄豆提取物处理(+)和未使用大黄豆处理(-)的两种情况下，对它们的PS暴露和MV产生的程度进行比较。PS暴露的程度展示在图13中，而MV产生的程度展示在图14中。
从图13和图14中可以看出，大黄豆提取物抑制了由于LPA和PA引起的PS暴露和MV产生。
此外，凝血酵素的产生程度通过使用凝血酶原酶分析，从PS暴露调节的促凝血活性的改变来进行测定。在图中， (+)代表使用大黄豆提取物处理的情况，(-)代表没有用大黄豆提取物进行处理的情况。从图15中可以看出，使用大黄豆提取物处理的情况能抑制由LPA和PA产生的凝血酵素。
测试实施例20：大黄豆提取物对血凝的抑制
凝结是血块形成为凝血因子的过程，该过程中酵母质有序地被激活以将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。同样称为接触系统的内部路径和通过组织因子激活而引发的外部路径导致血块的产生。
对20%乙醇的大黄豆提取物在阶式凝固器的外部路径或内部路径的效果进行评定，该评定是通过前凝血酶时间(PT)以及部份活化凝血活酶时间（在此称为：aPTT）来进行。
PT通过以下方式测定：从鼠中取出血液，并用3.8%的柠檬酸钠作为抗凝血剂来离心。在加入重组组织因子（RecombiPlasTin）置上层清液后，使用纤维蛋白测定仪来检测纤维蛋白的形成时间。越长时间表明越好的血凝抑制。
aPTT通过以下方式进行测定：从鼠中取出血液，并用3.8%的柠檬酸钠作为抗凝血剂来离心。在加入20 mM的氯化钙(CaCl2)溶液至上层清液后，取出100 μL的血清，使用纤维蛋白测定仪来检测纤维蛋白的形成时间。
PT检测结果展示在图16中，而aPTT测量结果展示在图17中。
从图16和图17中可以看出，20%乙醇的大黄豆提取物对PT或aPTT并没有效果。因此，由于大黄豆提取物并没有影响正常的血液凝结，将不会导致已知抗凝血剂（即：阿司匹林）的副作用，例如：止血中断或过量出血。
测试实施例21：大黄豆(Glycin max MERR)提取物对出血时间的效果
对于分别使用20%大黄豆提取物，阿司匹林以及氯吡格雷的出血时间进行比较。结果展示在图18中。
从图18中可以看出，阿司匹林和氯吡格雷导致出血时间显著的增加，其中大黄豆提取物并没有导致出血时间的变化。即使使用量增加5倍，从100 mg/kg 增加到 500 mg/kg，出血时间也几乎没有改变。因此，可以看出即使增加服用或使用剂量，并没有发生如增加出血时间的这类副作用。
本发明的包含豆类提取物的配方实施例组合物在此将详细说明。以下实施例仅限于说明，并非限制本发明那个的范围。
配方实施例1：软胶囊
将大黄豆提取物(100 mg)与大豆提取物(50 mg)，大黄豆油(180 mg)，红参提取物(50 mg)，棕榈油(2 mg)，氢化棕榈油(8 mg)，蜂蜡(4 mg)和卵磷脂(6 mg)混合，根据一般使用的方法装入软胶囊中。
配方实施例2：药片
将蚕豆提取物(100 mg)与大豆提取物(50 mg)，葡萄糖(100 mg)，红参提取物(50 mg)，淀粉(96 mg)，和硬脂酸镁(4 mg)混合。通过加入30%乙醇(40 mg)形成微粒后，在60℃下干燥，使用药片制造机器制造药片。
配方实施例3：微粒
将大黄豆提取物(100 mg)与大豆提取物(50 mg)，葡萄糖(10 g)，红参提取物(50 mg)，和淀粉(600 mg)混合，通过加入30%乙醇(100 mg)形成微粒后，在60℃下干燥，将微粒装入小袋。使其最后重量为1g。
配方实施例4：饮品
将大黄豆提取物(100 mg)与大豆提取物(50 mg)，葡萄糖(10 g)，红参提取物(50 mg)，柠檬酸(2 g)和纯净水(187.8 g)混合，并装入瓶子。其最后体积为200 mL。
配方实施例5：健康食品
大黄豆提取物 1000 mg
维生素
维生素A醋酸酯 70 μg
维生素E 1.0 mg
维生素B1 0.13 mg
维生素B2 0.15 mg
维生素B6 0.5 mg
维生素B12 0.2 μg
维生素C 10 mg
生物素 10 μg
烟酰胺 1.7 mg
叶酸 50 μg
泛酸钙 0.5 mg
矿物质
硫酸亚铁 1.75 mg
氧化锌 0.82 mg
碳酸镁 25.3 mg
磷酸二氢钾 15 mg
磷酸氢钙 55 mg
柠檬酸钾 90 mg
碳酸钙 100 mg
氯化镁 24.8 mg
健康食品中的维生素和矿物质的实施例成分可以根据需要改变。根据用于健康食品组合物的常用的健康食品制作方法，混合以上成分并制成微粒。
配方实施例6：健康饮品
蚕豆提取物 1000 mg
柠檬酸 1000 mg
低聚糖 100 g
浓缩梅提取物 2 g
牛磺酸 1 g
制备纯净水 900 mL
根据制备健康饮品的一般方法，将上述成分混合并在85℃下搅拌加热1小时。所得的溶液置于消毒的2L容器内，密封并消毒，随后保存在冰箱以用于健康饮品组合物的制备。
该健康饮品的成分可以根据地区或地方喜好而改变，例如：特定的消费者，国家，使用目的等。
本发明的组合物可以广泛地应用于药物，食品以及其它领域。
机译： 包含用于改善血液循环和增加血管健康的豆类提取物的组合物
机译： 包含用于改善血液循环和增加血管健康的豆类提取物的组合物
机译： 包含用于改善血液循环和增加血管健康的豆类提取物的组合物
