水果可溶性糖快速测定方法

摘要

一种可溶性糖快速测定方法，按如下七个步骤进行：一是样品可溶性糖提取，用水果50～150mg果肉，加入500～1000μL纯水研磨成匀浆，加热杀灭糖代谢酶活性，离心后取上清液。二是样品提取物预处理，用固相萃取柱吸附去除果实中的花青素和叶黄素等杂质。三是高纯度标准溶液的制备，称取单糖、双糖、三糖标样，制成不同浓度系列糖标准溶液。四是用ESI-MS进行提取物纯净度测定，必要时需再次去杂。五是MALDI-TOF检测，进行质谱扫描，读取并记录峰面积。六是糖标准曲线制作，用于糖定量分析。七是样品糖定性定量分析。采用本方法测定水果可溶性糖的组分与含量，步骤少、灵敏、快速，还可用于水果发育过程中糖动态监测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖类的定性定量测定方法。

背景技术

水果可溶性固形物指能溶于水的糖、酸、维生素、矿物质等。利 用折射仪可以大致估计可溶性固形物含量，但是糖组分即不同糖的组 成比例无法通过该方法检测出，而糖组成比例是种植者和科研人员共 同关心的问题，因其直接关系到水果的食用品质及商品品质。果实可 溶性糖主要为己糖和双糖，提取方法一直沿用有机溶剂法：利用甲醇 /氯仿提取果实中的糖，然后用萃取法去除氯仿，用旋转蒸发仪使甲 醇挥发，定容后用再将提取液中的色素等杂质去除。虽然这种方法分 离到的糖溶液中杂质较少，纯度较高，适用于高效液相色谱即HPLC 分析，但是该方法步骤繁多，不仅试验耗时耗力，最终的试验数据重 复间变异度也较大，试验效率及精确度均不高。利用HPLC测定糖组 分是近年来一直沿用的方法，不同糖及不同仪器检出限有一定差异。 HPLC已在医学、化学等领域广泛应用，但是在利用HPLC测定糖时耗 时较长，通常单个样品的测定时间约需20分钟，1小时一般至多只 能测3个样品；而且需要使用乙腈、甲醇等有毒有害试剂作流动相， 对操作人员会造成潜在健康威胁。质谱法是将样品离子化，变为气态 离子混合物，并按质荷比即m/z分离的分析技术，现已广泛用于蛋白 质、核酸、糖结构等的分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水果可溶性糖快速测定方 法。

解决上述技术问题采用如下技术方案，本水果可溶性糖快速测定 方法按如下步骤进行：

(1)样品可溶性糖的提取：用不锈钢小样品勺挖取少量待测水 果的果肉，放入试管中，每个样品准确称取50～150mg，记录所取样 品名及其重量；用移液枪吸取500～1000μL纯净水加入到试管中，用 试管研磨棒将样品迅速充分匀浆，然后将装有匀浆液的试管置于微波 炉中，低火加热10～40s至其沸腾即停止加热；或用水浴锅100℃加 热5～10min使糖代谢酶完全失活；试管稍冷却后涡旋混匀，5000rpm 常温离心3～5min，将上清液即含有可溶性糖的溶液移入新试管中， 用移液枪取上清液时尽量避免碰到沉淀物；在离心后的沉淀物中加入 500～1000μL纯净水，涡旋、离心后移取上清液至新试管，如此重复 2～3次以充分提取样品中的糖；合并所有上清液；样品经糖代谢酶 灭活处理后相对稳定，若提取多个样品，可先将样品逐一处理完成后 再进行批量离心及提取等工作；

(2)样品提取物预处理：步骤(1)提取的液体中若含有少量固 体物质，则先用滤纸过滤，无固体物质就直接用固相萃取柱吸附技术 进行去除果实中花青素、叶黄素诸杂质的预处理；不同水果成分差异 较大，需进行预备实验以确定最佳吸附条件；

(3)高纯度的标准溶液制备：准确称取单糖、双糖、三糖标样 各1.00g，用纯水定容至50mL，摇匀得20mg/mL的糖标准母液；再用 纯水将糖标准母液分别稀释成2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mg/mL 的系列糖标准溶液，分装于各试管中；

(4)用电喷雾质谱即ESI-MS进行提取物的纯净度检测：ESI-MS 检测条件为负极电喷雾状态，正离子扫描，扫描范围为100～2000质 量/电荷比，进样流速为20μL/min；若检测到杂质较多，则需要将样 品用固相萃取柱进行再次或多次过柱去杂；

(5)样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱即MALDI-TOF MS检测：将标准样品和经过预处理的样品提取物分别与上样基质即 matrix各1μL等量混合，点样于靶板即Target Plate上，室温下自 然结晶后开启MALDI-TOF MS进行质谱扫描，扫描范围为100～2000 质量/电荷比，读取并记录峰面积；

(6)糖标准曲线制作：根据一系列糖标准样品的质谱扫描结果 以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作糖标准曲线， 用于样品中糖含量的定量分析；

(7)样品糖的定性和定量分析：将样品提取物质谱扫描结果与 标准品质谱扫描结果进行比对，确定样品中的糖成分，实现定性分析； 根据标准品测定结果制作的标准曲线和样品质谱扫描结果对样品中 的糖进行定量分析。

本发明的有益效果是对水果中的己糖、双糖、三糖等可溶性糖进 行定性、定量检测，步骤少，灵敏度高，样品消耗少，重复性好。本 方法不仅可以利用极少量样品检测成熟水果中的糖组分及含量，同时 也可以用于水果发育过程中糖的动态监测。

附图说明

图1蔗糖的电喷雾质谱图。

图2单糖的电喷雾质谱图。

图3单糖和蔗糖的飞行时间质谱图。

图4香蕉果实提取物的电喷雾质谱图(实例)。

图5蔗糖标准曲线。

具体实施方式

本发明下面结合实施例并参照附图作进一步详述：

(1)样品可溶性糖的提取：用不锈钢小样品勺挖取少量待测水 果的果肉，放入试管中，每个样品称取约50～100mg，记录所取样品 名及其重量；用移液枪吸取500～1000μL纯净水加入到试管中，用试 管研磨棒将样品迅速充分匀浆，然后将装有匀浆液的试管置于微波炉 中，低火加热10～40s至其沸腾即停止加热；或用水浴锅100℃加热 5～10min使糖代谢酶完全失活；试管稍冷却后涡旋混匀，5000rpm常 温离心3～5min，将上清液即含有可溶性糖的溶液移入新试管中，用 移液枪取上清液时尽量避免碰到沉淀物；在离心后的沉淀物中加入 500～1000μL纯净水，涡旋、离心后移取上清液至新试管，如此重复 2～3次以充分提取样品中的糖；合并所有上清液；样品经糖代谢酶 灭活处理后相对稳定，若提取多个样品，可先将样品逐一处理完成后 再进行批量离心及提取等工作；

(2)样品提取物预处理：步骤(1)提取的液体中若含有少量固 体物质，则先用滤纸过滤，无固体物质就直接用固相萃取柱吸附技术 进行去除果实中花青素、叶黄素诸杂质的预处理；不同水果成分差异 较大，需进行预备实验以确定最佳吸附条件；

(3)高纯度的标准溶液制备：准确称取单糖、双糖、三糖标样 各1.00g，用纯水定容至50mL，摇匀得20mg/mL的糖标准母液；再用 纯水将糖标准母液分别稀释成2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mg/mL 的系列糖标准溶液，分装于各试管中；

(4)用电喷雾质谱即ESI-MS进行提取物的纯净度检测：ESI-MS 检测条件为负极电喷雾状态，正离子扫描，扫描范围为100～2000质 量/电荷比，进样流速为20μL/min；若检测到杂质较多，则需要将样 品用固相萃取柱进行再次或多次过柱去杂；

(5)样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱即MALDI-TOF MS检测：将标准样品和经过预处理的样品提取物分别与上样基质即 matrix各1μL等量混合，点样于靶板即Target Plate上，室温下自 然结晶后开启MALDI-TOF MS进行质谱扫描，扫描范围为100～2000 质量/电荷比，读取并记录峰面积；

(6)糖标准曲线制作：根据一系列糖标准样品的质谱扫描结果 以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作糖标准曲线， 用于样品中糖含量的定量分析；

(7)样品糖的定性和定量分析：将样品提取物质谱扫描结果与 标准品质谱扫描结果进行比对，确定样品中的糖成分，实现定性分析； 根据标准品测定结果制作的标准曲线和样品质谱扫描结果对样品中 的糖进行定量分析。

参见图1，该蔗糖样品电喷雾质谱图中显示了蔗糖与钾离子相结 合，在电喷雾质谱图中为单峰，信噪比即S/N较高，检测效果较好。

图2显示了己糖与钠离子相结合，在电喷雾质谱图中为单峰，信 噪比即S/N较高，检测效果较好。

图3显示了己糖和蔗糖样品的飞行时间质谱图，在质谱扫描结果 中可见己糖和蔗糖表现为各自的独立峰，区分效果较好。

图4显示了香蕉果实提取物的电喷雾质谱扫描结果，在质谱扫描 结果中可见香蕉果实中的己糖、双糖、三糖分离效果较好，杂峰少。

图5显示了以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制 的标准曲线。需要说明的是不同仪器、不同上样板及不同批次样品间 差别较大，每批样品均需单独绘制标准曲线。

利用简便快捷的热水-微波法提取了苹果、草莓、枇杷、葡萄、 猕猴桃、香蕉果实中的可溶性糖，利用ESI-MS联合MALDI-TOF MS分 析了这些果实中的单糖、多糖组成及动态变化。结果表明，ESI-MS 联合MALDI-TOF MS可以检测到样品中微量多种糖含量，灵敏度极高， 样品消耗少，本方法还可用于果实发育过程中的糖动态监测。下表为 上述六种水果提取物质谱扫描结果：

从上表反映的数据可见：除香蕉和枇杷未检测出山梨醇，其他四 种水果均检测出山梨醇；葡萄和枇杷果实中未检测到棉子糖；香蕉果 实中的蔗糖主要以钾离子形式存在。