基于顶复虫Ferlin、Ferlin样蛋白和其它含有C2结构域的蛋白的疟疾疫苗

摘要

本发明涉及用作疫苗的肽，所述肽含有至少一种顶复虫Ferlin、Ferlin样蛋白和/或另外的含有C2结构域的蛋白的抗原决定簇或表位。本发明还涉及含有所述肽的组合物以及该组合物作为疟疾疫苗的应用。

说明书

本发明涉及用作疟疾疫苗的肽，所述肽含有至少一种顶复虫Ferlin、Ferlin样蛋白和/或另外的含有C2结构域的蛋白的抗原决定簇或表位。本发明进一步涉及含有所述肽的组合物以及该组合物作为疟疾疫苗的应用。

发明背景

疟疾每年导致超过2百万人死亡，主要在非洲。然而，可持续控制该疾病所必需的有效疫苗仍未出现。抗疟疾预防接种的可行性已经通过使用辐射减毒子孢子(RAS)得到了充分地证明，RAS通过靶向子孢子(由叮咬的按蚊接种于皮肤内)和随后的寄生虫肝期来保护啮齿类动物、非人灵长类动物和人类。RAS的发育在肝内中断，因此这些寄生虫没有发展到诱导疾病的血液期感染(图1)。然而，尽管由经γ-辐射的寄生虫提供了灭菌免疫，实践中的问题(包括大规模生产和确保最终产品的一致性)使得该疫苗不太可能被允许用于人体。然而，RAS是实验室研究较好的实验预防接种模型。RAS模型中最占优势的免疫应答是由环子孢子表面蛋白(CSP；图2)所激活的。这些发现促进了基于CS蛋白的RTS,S疫苗的发展。迄今为止RTS,S是市场上最先进的疟疾疫苗，目前已处于临床III期。对健康志愿者和生活在发病地区的非洲儿童的研究显示了该疫苗的良好耐受性及安全性。然而，RTS,S和不同佐剂系统的有效性仅为40-60%。此外在CS转基因小鼠中的观察结果表明，在耐受CSP的小鼠内也观察到了保护作用，这提示了有其它的诱导宿主免疫应答的抗原存在。研究RAS诱导的免疫应答总受这样的事实所限制：注入的子孢子的遗传学背景在子孢子个体以及不同批次的子孢子之间高度变化，这也导致了不同表达的抗原。基因靶向技术的最新发展促进了基因减毒寄生虫(GAP)的产生，所述GAP在对寄生虫发育所必需的基因内带有确定的突变。类似于RAS，GAP也在肝内减弱，并且赋予阶段特异性的灭菌免疫，但是GAP在感染开始后的特定的时间点(~24小时)以及很特定的分化阶段被阻滞(图1)。作为对比，RAS带有多个非均一的突变并且生长阻滞发生在多个阶段。因此，明确的基因减毒寄生虫(uis3(-)和/或uis4(-))成为进一步表征对肝期寄生虫的保护性免疫应答的理想工具。基因敲除小鼠的研究表明，产生γ-干扰素的T淋巴细胞介导GAP诱导的免疫，而B细胞并不重要。进一步的研究甚至披露了CD8+ T细胞是主要的参与者。然而，涉及该免疫的抗原特异性和效应子机制仍未被了解。

本发明的目的在于提供有效的疟疾疫苗的手段。更特别地，本发明的目的在于鉴定对免疫很重要的新抗原。

本发明优选实施方式的描述

在下面更详细描述本发明之前，需要理解的是，本发明不限于本文描述的特定的方法学、方案和试剂，因为这些可变化。还需要理解的是，本文所用的术语仅仅为了描述特定的实施方式，而非用于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅受所附的权利要求所限制。除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本领域一般技术人员所通常理解的相同含义。为了本发明的目的，本文引述的所有参考文献以全文参照的方式结合于此。

按照本发明，上面的目的通过用作疟疾疫苗的含有至少一种顶复虫蛋白的抗原决定簇或表位的肽来解决，所述的顶复虫蛋白选自：

Ferlin，

Ferlin样蛋白家族的成员，和

其它含有C2结构域的蛋白。

本文使用的术语“肽”是指肽，在其长度或尺寸方面没有限制。因此，在一个实施方式中，所述肽是顶复虫蛋白本身或其(较大的)片段。在另外的实施方式中，所述肽具有5－50个氨基酸，更优选8－25个氨基酸，更优选8－15个氨基酸。

本文使用的术语“顶复虫蛋白”是指来自顶复虫生物的蛋白。顶复虫生物(也称作apicomplexa或apicomplexia)是一个大的原生生物群，它们中的大部分都具有独特的被称为顶质体(apicoplast)的细胞器以及涉及穿透宿主细胞的顶端复合结构。它们是形成孢子的单细胞哺乳动物寄生虫。优选地，所述顶复虫生物选自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。优选地，所述顶复虫蛋白为疟疾顶复虫蛋白，即它来自引起哺乳动物疟疾的顶复虫生物，优选恶性疟原虫和伯氏疟原虫，更优选恶性疟原虫。

C2-结构域是一种将蛋白靶向细胞膜的蛋白结构域。它是一种由8条β-链构成的β-夹心结构，使2－3个钙离子共定位在胞膜结合面上，钙离子结合在由结构域的第一个环(loop)和最后一个环所构成的腔内。基于它们的氨基酸序列，本领域的技术人员可容易地鉴定含有C2-结构域的蛋白。

在一个实施方式中，其它的含有C2-结构域的蛋白选自：伯氏疟原虫的含有C2-结构域的蛋白(Pb C2CP)、恶性疟原虫中的其直向同源物、以及与这些蛋白至少有80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%的同一性的蛋白。

本发明的疟疾疫苗优选亚单位疫苗。

在一个实施方式中，所述顶复虫蛋白选自：

伯氏疟原虫Ferlin(Pb FER),

恶性疟原虫Ferlin(Pf FER),

约氏疟原虫Ferlin(Py FER),

刚地弓形虫Ferlin(Tg FER),

伯氏疟原虫Ferlin样蛋白(Pb FLP),

恶性疟原虫Ferlin样蛋白(Pf FLP),

约氏疟原虫Ferlin样蛋白(Py FLP),

刚地弓形虫Ferlin样蛋白(Tg FLP),

伯氏疟原虫含有C2结构域的蛋白(Pb C2CP)，以及

与上述任一种蛋白至少有80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%的同一性的蛋白。

Pb FER指的是PBA KA_131930　　　　(SEQ ID NO.26)，

Pf FER指的是PF14_0530　　　　　　　　　(SEQ ID NO.27)，

Py FER指的是PY05745　　　　　　　　　　(SEQ ID NO.28)，

Tg FER指的是TGVEG_073920　　　　　　　(SEQ ID NO.29)，

Pb FLP指的是PBANKA_122440　　　　　　(SEQ ID NO.30)，

Pf FLP指的是MAL8P1.134　　　　　　　　(SEQ ID NO.31)，

Py FLP指的是PY04695　　　　　　　　　　(SEQ ID NO.32)，

Tg FLP指的是TGVEG_093560　　　　　　　(SEQ ID NO.33)，以及

Pb C2CP指的是PB402109.00.0　　　　　　　(SEQ ID NO.34)，

其中上面的登录号为PlasmoDB/GeneDB的登录号(www.plasmodb.org, version: 7.1, November 22, 2010; www.genedb.org, version: November, 2010)。

本文使用的术语“同一性百分数(%)”指的是两个氨基酸序列之间的序列同一性。同一性可通过比较两个为比较目的而排列的序列的位置来确定。如果在被比较的序列中的相同位置被相同的氨基酸所占据，则这两个分子被认为在那个位置相同或同一。

通常，本领域的技术人员知晓在蛋白质或肽的氨基酸序列中的某些氨基酸交换对该蛋白质或肽的(二级或三级)结构、功能和活性没有任何影响。与本文披露的氨基酸序列相比，具有这种“中性的”氨基酸交换的氨基酸序列落入本发明的范围内。还包括允许或促进所述肽(尤其是顶复虫蛋白本身或其较大片段)在非顶复虫生物(例如大肠杆菌(E. coli))中产生的原始氨基酸序列中的突变。

在优选的实施方式中，所述顶复虫蛋白选自：Pf FER、Pf FLP、和与Pf FER或Pf FLP有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%的同一性的蛋白。

在一个实施方式中，抗原决定簇或表位是CD8+ T细胞表位、CD4+ T细胞表位或B细胞表位。优选CD8+ T细胞表位。优选地，所述CD8+ T细胞表位是恶性疟原虫特异性的CD8+ T细胞表位，例如HLA-A 0201限制性CD8+ T细胞表位，或者是伯氏疟原虫特异性CD8+ T细胞表位，例如H2b限制性CD8+ T细胞表位。本领域的技术人员知道如何鉴定/预测给定氨基酸序列的以上表位，例如通过表位预测程序，例如SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)。

在一个实施例中，所述抗原决定簇或表位来自Ferlin、Ferlin样蛋白家族成员或其它的含有C2结构域的蛋白的结构域，其中所述结构域选自：

C2结构域，

ATP酶结构域，

外切酶(exo)结构域。

在一个实施方式中，所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列具有至少8个氨基酸的长度。优选地，所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列具有8个、9个或10个氨基酸的长度。

在一个实施方式中，所述顶复虫蛋白是伯氏疟原虫Ferlin(Pb FER)，且所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列选自：

(P8L)　　　PNPNFSYL　　　[SEQ ID NO.1]，

(V8L)　　　VPIEYRPL　　　[SEQ ID NO.2]，和

(L8L)　　　LNTCFLQL　　　[SEQ ID NO.3]。

在一个实施方式中，所述顶复虫蛋白是恶性疟原虫Ferlin(Pf FER)，且所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列选自：

(N9V)　　　NLLDPLVVV　　　[SEQ ID NO.4]，

(Y9I)　　　YLYVNIHKI　　　[SEQ ID NO.5]，

(L9L)　　　LLLEGNFYL　　　[SEQ ID NO.6]，

(K9L)　　　KLIPVNYEL　　　[SEQ ID NO.7]，

(Y9L)　　　YLYEKQQEL　　　[SEQ ID NO.8]，和

(I9I) 　　　ILIPSLPLI　　　　　[SEQ ID NO.9]。

在一个实施方式中，所述顶复虫蛋白是伯氏疟原虫Ferlin样蛋白(Pb FLP)，且所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列选自：

(S8L)　　　SRYFFRAL　　　 [SEQ ID NO.10]，

(L8V)　　　LNYVYSKV　　　[SEQ ID NO.11]，

(I8M)　　　IGYTYIDM　　　 [SEQ ID NO.12]，和

(V8L*)　　　VGTAYITL　　　[SEQ ID NO.13]。

在一个实施方式中，所述顶复虫蛋白是恶性疟原虫Ferlin样蛋白(Pf FLP)，且所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列选自：

(T9L*)　　　TLNPLLPWL　　　[SEQ ID NO.14]，

(I9L) 　　　ILIKSEAEL　　　　[SEQ ID NO.15]，

(N9V*)　　　NILEPYVKV　　　[SEQ ID NO.16]，

(Y9L*)　　　YLYGGRIFL　　　[SEQ ID NO.17]，

(L10V)　　　LLVAFELVPV　　 [SEQ ID NO.18]，

(L10L)　　　LLIGTAYITL　　　 [SEQ ID NO.19]，

(D10L)　　　DLMPIELRSL　　　[SEQ ID NO.20]，和

(A10L)　　　ALIGKCSFGL　　　[SEQ ID NO.21]。

在一个实施方式中，所述顶复虫蛋白是伯氏疟原虫含有C2结构域的蛋白(Pb C2CP)，且所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列选自：

(A9I) 　　　AYIAPHTII　　　 [SEQ ID NO.22]，

(T9L) 　　　TIRSFYKRL　　　[SEQ ID NO.23]，

(S8V) 　　　SPYLFNIV　　　 [SEQ ID NO.24]，和

(A8I) 　　　AIYRFNAI　　　 [SEQ ID NO.25]。

在一个实施方式中，所述抗原决定簇或表位的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1至25，优选选自SEQ ID NO.4至9和SEQ ID NO.14至21。

在一个实施方式中，按照本发明的肽进一步含有至少两种上面所限定的顶复虫蛋白的抗原决定簇或表位。

在进一步的实施方式中，本发明的肽含有3个、4个、5个或更多这样的抗原决定簇或表位。

在一个实施方式中，按照本发明的肽还含有至少一种顶复虫蛋白的抗原决定簇或表位，其中这些顶复虫蛋白与下述的蛋白不同

Ferlin，

Ferlin样蛋白家族成员，和

其它的含有C2结构域的蛋白。

不同于上面所列蛋白的顶复虫蛋白可以是已知的潜在亚单位疫苗的候选者，例如MSP1、CSP(先导疫苗候选者RTS,S, GSK)，或者是一个或多个源自发明人SSH筛选的候选肽。

在一个实施方式中，所述肽含有一种或多种其他成分，例如一种或多种标记物、一种或多种N末端和/或C-末端修饰或一种或多种其它药物或试剂。技术人员能够选择合适的其它成分。

本发明的目的还可通过编码上面所限定的至少一种肽的核酸分子得以解决。所述目的进一步可通过含有至少一个这样的核酸分子的质粒得以解决。

在一个实施方式中，提供所述核酸分子或质粒以用作疟疾疫苗。

本发明的目的还可通过针对上面所限定的肽的抗体来解决。

本发明的目的进一步通过一种组合物来解决，所述组合物含有

(i)至少一种上面所限定的肽，

(ii)任选的载体，

(iii)任选的佐剂。

在一个实施方式中，所述组合物含有至少两种肽(i)。在进一步的实施方式中，本发明的组合物含有3种、4种、5种或更多种上面所限定的肽。

在一个实施方式中，所述组合物还含有至少一种肽，该肽含有至少一种顶复虫蛋白的抗原决定簇或表位，其中所述顶复虫蛋白与下述的蛋白不同：

Ferlin，

Ferlin样蛋白家族成员，和

其它的含有C2结构域的蛋白。

因此，在所述组合物中，本发明的一种或多种肽可与来自已知的潜在亚单位疫苗候选者(例如MSP1、CSP(先导疫苗候选者RTS,S, GSK))的其它肽(片段)相结合，最终与一个或多个源自发明人SSH筛选的候选肽相结合。

在一个实施方式中，所述载体(ii)与所述肽相融合。

在一个实施方式中，所述载体(ii)是病毒颗粒或其部分、病毒载体或病毒颗粒的包膜蛋白、或纳米载体。

在一个实施方式中，所述病毒颗粒是乙肝病毒颗粒或其部分。

在这样的实施方式中，所述载体(ii)，例如乙肝病毒颗粒或其部分，适用于本发明的一种或多种肽的肝定位。

在一个实施方式中，所述纳米载体是细胞靶向的纳米载体，例如可由Rodos BioTarget GmbH, Hannover (www.biotargeting.org)获得的纳米载体，例如TargoSphere?传递系统。这些纳米载体可与所需的肽相结合，然后被特异性地导向抗原呈递免疫细胞(如APC、DC、巨噬细胞等)。

在一个实施方式中，通常所述佐剂(iii)触发CD8 T细胞应答。优选地，所述佐剂是商业可获得的佐剂系统，例如IC31 (Intercell company, Vienna)，因为该佐剂系统触发CD8 T细胞应答而非抗体介导的免疫。

在一个实施方式中，提供上面限定的组合物以用作疟疾疫苗。

本发明的目的还可通过生产上面所限定的组合物的方法来解决，所述方法包括混合至少两种上面所限定的肽的步骤。

本发明的目的还可通过预防疟疾的方法来解决，所述方法包括给需要的人施用上面所限定的肽、或者上面所限定的核酸分子或质粒，或者上面所限定的组合物的步骤。

附图

图1显示了使用辐射减毒子孢子(RAS)或基因减毒寄生虫(GAP)对抗疟疾的两种预防接种策略，它们都基于减毒的肝期(LS)发育。应用RAS仍然是预防接种的“金标准”。

图2显示了环子孢子表面蛋白(CSP)的一级结构以及由免疫荧光染色所显示的其细胞定位(疟原虫子孢子的表面染色)。还显示了其单一主要组织相容性复合体(MHC) I类(H2Kd)限制性CD8+ T细胞表位(伯氏疟原虫的SYIPSAEKI和约氏疟原虫的SYVPSAEQI)的大致位置。

图3显示了用于比较疟疾WT、GAP和RAS寄生虫在肝期发育20小时后的转录物的改良抑制消减杂交(SSH)的试验设计。

图4显示了通过抑制消减杂交(SSH)鉴定的与WT序列相比较，基因减毒(GAP特异性)或辐射减毒(RAS特异性)寄生虫的200个分析序列中的某些肝期转录物的百分数。序列分析使用PlasmoDB (http://plasmodb.org)和GeneDB (www.genedb.org)主页的BLAST检索来进行。

图5A和B显示了有标注的顶复虫Ferlin和Ferlin样蛋白(FLP)以及伯氏疟原虫含有C2结构域的蛋白(Pb C2CP)的一级结构。显示了恶性疟原虫Ferlin和伯氏疟原虫Ferlin和FLP的侧向同源物(paralog)，以及刚地弓形虫直向同源物(B)。伯氏疟原虫和恶性疟原虫Ferlin直向同源物具有约20%的氨基酸(AA)同一性。特征性的C2结构域参与Ca²⁺传感和其它所述Ferlin蛋白中的Ca²⁺信号转导。除了这些结构域外，SMART分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)揭示了Pb C2CP内的具有预测的外切酶(exo)和ATP酶活性的结构域。还显示了预测的N-末端的信号肽以及标注的跨膜结构域(atd)和预测的C-末端的跨膜跨度(pts, predicted transmembrane span)。

图6显示了以分离自20小时伯氏疟原虫肝期的总RNA为模板使用基因特异性寡核苷酸引物对进行的定量实时RT-PCR，其中伯氏疟原虫来自野生型(WT)、辐射减毒的(RAS)或基因减毒的(GAP)寄生虫。显示了伯氏疟原虫C2CP的转录物水平。转录物的量以拷贝数(+/- SD)来表示，与基因特异性质粒所产生的外部标准曲线相比较。

图7A显示了由数个程序，包括表位预测程序SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)所预测的Pb C2CP的H-2b限制性CD8+ T细胞表位。一级结构上方显示的条带指示预测的T细胞表位的大致定位。图7B是初次免疫-两次增强(prime-two-boost)免疫方案的示意图。在第0天给C57B1/6小鼠静脉注射伯氏疟原虫RAS或GAP。第一次增强通常在14天之后给予，第二次增强在此后14天给予。增强免疫的剂量通常低于初次免疫的剂量。在最后一次增强后7天，动物或者用WT子孢子(spz)进行攻击(challenge)，或者器官经解剖用于免疫学研究(在攻击前收获)。经攻击的小鼠在WT攻击后7天处死(在攻击后收获)。

图8显示了基于免疫动物体内经Pb C2CP脉冲处理的靶细胞的裂解的体内细胞毒性测定。给未经实验的脾细胞加载Pb C2CP衍生的表位池，并用2 μΜ CFSE(CFSE^high)(5-(和-6)-羧基荧光素双醋酸酯，琥珀酸亚胺酯，Invitrogen)标记。对照细胞群用0.2μΜ CFSE (CFSE^low)标记。细胞群以相等的数量(1:1)混合，导致CFSE终浓度分别为1μΜ或0.1μΜ。在细胞分离前18个小时将混合群的1x10⁷细胞静脉注射入经免疫动物或未经实验的对照动物的尾静脉内。在脾和肝内的CFSE标记的细胞经流式细胞术检测。特异性的裂解以CFSE^high细胞和CFSE^low细胞的比值来计算，并与在未经实验的动物中测得的比值相比较。显示了每组3-5个小鼠的三个独立试验的裂解细胞的平均百分数。

图9显示了在用GAP和RAS免疫小鼠(n=5)后肝内的CD8⁺CD44^highCD62L^low细胞的平均百分数，表明肝内的效应子记忆T细胞群(CD8⁺CD44^highCD62L^low)在经GAP和RAS免疫后增长。将肝淋巴细胞与BMDC和Pb C2CP衍生肽T9L共同孵育过夜。使用抗CD8a-PacBlue结合抗体(1:100, BD biosciences)、抗CD44-FITC (1:100, BD biosciences)、抗CD62L-PE (1:200, BD biosciences)以及抗CD25-Alexa647 (1:50, BD biosciences)进行表面染色。经流式细胞术使用FACSCanto系统(BD biosciences)分析染色的细胞。得到的数据进一步使用flowjo分析软件(http://www.flowjo.com)进行分析。

图10显示了测量来自RAS和GAP免疫的小鼠的效应子T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)应答的基于细胞因子的ELISpot测定。来自免疫动物的培养淋巴细胞使用1μΜ的Pb C2CP衍生肽T9L再次刺激过夜，或者不经刺激而孵育。随后细胞被转移至包被有5μg/ml IFN-γ抗体的MultiScreen过滤板。检测到的IFN-γ应答以每百万培养细胞的计数的点来表示。未经实验的对照动物的计数被减去。显示了五个动物为一组的三次实验的平均计数。

图11A显示了通过表位预测程序SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)预测的Pf FER的HLA-A 0201限制性的CD8+ T细胞表位。一级结构上方显示的条带指示表示预测的T细胞表位的大致定位。图11B显示了以分离自野生型(WT)或者辐射减毒(RAS)寄生虫的恶性疟原虫肝期的总RNA为模板，使用基因特异性寡核苷酸引物对的定量实时RT-PCR。显示了恶性疟原虫Ferlin(Pf FER)相对的转录物水平。

图12A显示了10天的培养ELISpot测定，用于检测经Pf Ferlin特异性表位再刺激后CD8+ T细胞的活化。每一个表位都单独测试和以表位池测试，其概述于该图中。用Pf Ferlin表位刺激来自暴露于疟疾和未暴露于疟疾(未经实验的)的个体的血液中新鲜分离的PBMC。IFN-γ的分泌用ELISpot分析。Pf AMA1－已知的疟疾血液期抗原，被用作阳性对照(图12B)。

图13显示了伯氏疟原虫Ferlin(FER)和Ferlin样蛋白(FLP)的敲除(A)和互补(B)的策略。取代构建体(A)含有侧翼为TgDHFR/TS选择标记的伯氏疟原虫FER或FLP可读框的5'和3'的非翻译区。野生型(WT)基因组的基因座由线性化的KpnI/XbaI寻靶载体来定位。双交换事件分别用选择标记取代内源性FER或FLP的可读框。互补对照构建体(pCONT) (B)含有伯氏疟原虫FER或FLP可读框(fer/flp)的5’截断形式以及TgDHFR/TS选择标记。经XbaI线性化的质粒分别靶向FER或FLP野生型基因组基因座，并且插入选择标记以及附加的截断型fer或flp拷贝。伯氏疟原虫Ferlin(FER)和Ferlin样蛋白(FLP)敲除或互补的转染子的基因分型PCR分别由C和D显示。对ORF、测试物和附加体(epi, episomal)特异性寡核苷酸对进行标准PCR。作为模板，提供不同转移转染子(Δflp/Δfer/flpCONT/ferCONT)的gDNA以及伯氏疟原虫野生型gDNA(WT)或者作为PCR对照的各自的寻靶构建体(v)。通过琼脂糖凝胶电泳分离特异性的DNA片段。

图14显示了贯穿疟疾生命周期的伯氏疟原虫Ferlin(A)和对照酶醛缩酶(B)的转录概况的RT-PCR分析(BS=血液期、GA=配子母细胞、Sg Spz=唾液腺子孢子、LS=肝期)。

现在通过参考下面的实施例来进一步描述本发明，这些实施例用于说明而不是限制本发明。

早期疟原虫肝期的比较分析鉴定出保护性免疫的潜在靶标。

基因减毒寄生虫(GAP)在肝期(LS)发育中停滞，因此并不是在LS发育中正常表达的所有基因都会得到表达。由野生型(WT)子孢子(而不是GAP)的LS所表达的任何基因可被认为不是保护性免疫应答的启动所必需的。因此，对由uis3(-) LS所表达的所有基因组成成分进行分析，将允许缩小作为前红细胞免疫的非常重要的靶标的抗原的范围。

抑制消减杂交在减毒寄生虫中产生一组被特异性地上调的转录物。

本发明人使用抑制消减杂交(SSH)比较了LS发育20小时后的WT、GAP和RAS寄生虫的转录物(图3)。这种高度有效的方法允许鉴定两种不同cDNA群中差异表达的转录物(Diatchenko,1996)。疟原虫寄生虫的LS发育在培养的肝细胞中实现。已有描述伯氏疟原虫子孢子进入人肝细胞瘤细胞并且在人肝细胞瘤细胞内转化(Hollingdale,1983)。因此，人肝细胞瘤细胞系Huh7被用作LS发育的合适的宿主。这种体内培养允许提高寄生虫相对宿主细胞的比值，并且因此可获得足够的RNA材料用于随后的消减。对于GAP、RAS或WT的LS期的一个cDNA群，接种了2－3个8孔腔式载玻片(8-well chamber slide)，每孔接种25,000个Huh7细胞和25,000－35,000个子孢子，LS期在20小时后终止。选择这一时间点是因为uis3(-)寄生虫在肝内24小时后经历发育阻滞，因此这些在这一时期已经表达的早期基因对于前红细胞免疫必定是重要的。收集的细胞经0.05 %的毛地黄皂苷处理，毛地黄皂苷选择性地透过宿主细胞质膜而不影响细胞内的寄生虫，因此减少了宿主细胞RNA的污染。寄生虫特异性的RNA随后使用RNAeasy Mini Kit (Qiagen)进行分离。获得的RNA在40μl的体积中的浓度达到约150-250μg/ml，这意味着总RNA的最终量为6-10μg。使用实用的SMART方法(Clontech; SMART? PCR cDNA Synthesis Kit, Protocol No. PT3041-1)进行的cDNA合成需要0.05-1μg总RNA，因此当起始的材料有限时该技术尤其适用于这种方法。大约0.5μg总RNA用于使用SMART技术进行cDNA合成，随后该cDNA用于消减。消减程序按照厂商手册(Clontech; PCR-Select? cDNA Subtraction Kit, Protocol No. PT1117-1)进行。得到的cDNA片段直接克隆进入pGEMT-easy T/A-克隆载体(Promega)并使用传统方法进行测序。

使用PlasmoDB数据库(http://plasmodb.org)经BLAST搜索来自SSH筛选的序列。大多数显著的上调基因在这两个减毒寄生虫系中是共同的(图4)。由SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)鉴定的Ferlins、Ferlin样蛋白和含有C2结构域的蛋白在这些最为显著的基因里。

顶复虫Ferlins、Ferlin样蛋白和Pb C2CP(PB402109.00.0)的一级结构如图5A和B所示。有伯氏疟原虫Ferlin样蛋白(PbANKA_122440)和一个Pb Ferlin侧向同源物(PBANKA_131930)。在恶性疟原虫基因组内，有一个Ferlin(PF14_0530)和一个Ferlin样蛋白(MAL8P1.134)有注释。数个Ferlin在约氏疟原虫基因组中有注释(未显示)。还在顶复虫寄生虫－刚地弓形虫内发现Ferlin和Ferlin样蛋白(图5B)。

Ferlin和Ferlin样蛋白是具有不同数量的特征性C2结构域的膜蛋白。这些结构域通常参与Ca²⁺依赖性脂质加工事件。Ferlin家族成员共享调节细胞型特异性膜融合事的保守机制(Mc Neil等的综述, 2005)。在疟原虫中，该蛋白家族的功能仍未明确。除了一个特征性C2结构域外，伯氏疟原虫的含有C2结构域的蛋白(C2CP)还含有一个具有预测的外切酶活性的结构域以及一个预测的ATP酶结构域。此外，所有的Ferlin和Ferlin样蛋白都含有跨膜结构域，并且在Pf Ferlin和Pb C2CP中发现了N-末端信号肽。

伯氏疟原虫C2CP (实施例1)

伯氏疟原虫含有C2结构域的蛋白(C2CP)在GAP和RAS肝期的上调通过定量实时PCR(qRT-PCR)使用基因特异性引物来确认和定量。作为模板，提供在肝期(LS)发育20小时后由肝期分离的伯氏疟原虫GAP、RAS和WT RNA，然后将其转录成cDNA。图6显示了在GAP、RAS和WT LS的Pb C2CP的mRNA的拷贝数。

当在数个预测程序(包括表位预测程序SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de))的帮助下检测出四个预测的H-2b限制性CD8+ T细胞表位时，Pb C2CP作为抗原参与者的可能性变得清晰了(图7A)。预测的Pb C2CP的CD8+ T细胞表位A9I、T9L、S8V和A8I的氨基酸序列如表1所示。

表1：预测的Pb C2CP的CD8+ T细胞表位。

为了进行免疫学研究，按照初次免疫-两次增强方案(图7B)用GAP (uis3(-))和RAS免疫小鼠。

进行了体内细胞毒性测定，以便了解经GAP和RAS免疫的动物识别并杀死表面携带有Pb C2CP衍生表位的细胞的能力。将四种预测的CD8+ T细胞表位A9I、T9L、S8V和A8I的池加载在CFSE-标记的脾细胞上，连同对照细胞群一起注入免疫小鼠内，该对照细胞群不携带表位并且经较低浓度的CFSE标记。18小时后处死小鼠并且分离肝淋巴细胞和脾细胞。这些细胞中的一些直接经流式细胞术进行检测，其中可在BD FACSCalibur (激发488nm，发射517nm)的FL1通道内观察到CFSE-标记的细胞。通过下面的数学公式计算被特异性裂解的细胞的百分数。

在随后的WT攻击后7天经RAS和GAP免疫小鼠的脾和肝内被特异性裂解的细胞的百分数如图8所示。在经免疫的小鼠的脾内没有检测到特异性的细胞毒性裂解。然而，在经RAS和GAP免疫小鼠的肝内分别有11.8%和19.6%的Pb C2CP特异性细胞被裂解。这显著高于未经实验对照动物中的所述裂解，在未经实验对照动物中平均少于0.001%的荧光标记的Pb C2CP特异性细胞被裂解。在WT攻击小鼠中也有10.5%的Pb C2CP特异性细胞被杀死。但是与已经发展到血液期感染的经免疫小鼠形成对比的是，这些小鼠之前已经观察到伯氏疟原虫野生型(WT)的肝期。这些结果证明：Pb C2CP特异性细胞在经免疫或暴露的动物体内被真正地识别和杀死。可以检测到针对Pb C2CP衍生表位的免疫机制。

为了更详细地解释RAS和GAP免疫动物中的Pb C2CP特异性免疫应答，用单独的肽T9L在下面试验中进行再刺激。选择T9L是因为它对H2b具有最高的预测结合亲和力。对来自GAP和RAS免疫小鼠的再刺激淋巴细胞的表面活化标记的染色表明，与未经实验小鼠相比，效应子记忆T细胞群(T_EM; CD8⁺CD44^highCD62L^low)明显增强(图9)。未经实验小鼠肝中的平均T_EM细胞的平均百分数为42.4 %，RAS免疫动物中显著增加到71.5 %，在GAP免疫动物中显著增加到65.1 % (p＜0.0001和p=0.058，非配对t检验)。此外T_EM细胞群还表达了表面标记CD25(未显示)。这进一步表明了在经RAS和GAP免疫的动物中存在着针对Pb C2CP的特异性效应子机制。

ELISpot (酶联免疫吸附剂斑点)是一种高度敏感的测定，允许在单细胞水平上检测细胞因子，应用ELISpot以测量RAS和GAP免疫小鼠的肝和脾内的低IFN-γ应答。用Pb C2CP衍生肽T9L过夜再刺激来自免疫小鼠的纯化肝淋巴细胞或总脾细胞。在将经再刺激的细胞转移至包被IFN-γ的MultiScreen过滤板之前，用新鲜的培养基替换该培养基以稀释培养上清液中分泌的IFN-γ和减少背景的干扰。在将经刺激的细胞在过滤板上孵育24小时后，使用生物素化抗IFN-γ第二抗体检测斑点。在膜上出现的每一个斑点都代表单个反应细胞。斑点在解剖显微镜下进行计数。作为来自免疫动物的经刺激细胞的对照是在无刺激情况下孵育的细胞和分离自未经实验动物的细胞。阳性对照(用抗CD3抗体激活的未经实验的淋巴细胞)一起进行测试，以证实该测定是有效的。

在经GAP和RAS免疫后经再刺激的脾细胞的IFN-γ应答非常低(图10)。遗憾的是，抗CD3阳性对照也出乎意料地低，每百万个总脾细胞中仅有平均168个斑点。然而，当经Pb C2CP-衍生肽T9L再刺激后，在经GAP免疫的C57B1/6小鼠的脾中IFN-γ应答显著提高(p = 0.0346；非配对t检验)。纯化的肝淋巴细胞的IFN-γ应答总体高于脾细胞的IFN-γ应答，提示寄生虫感染发生时更多的活化T细胞在肝内。如果用Pb C2CP-衍生肽T9L特异性地再刺激来自GAP免疫动物的肝淋巴细胞，则每百万个细胞中检测到622个反应细胞，而来自经RAS免疫的动物，每百万个细胞中甚至检测到了825个反应淋巴细胞。作为对照，用抗CD3抗体非特异性地刺激未经实验的细胞，导致每一百万个肝淋巴细胞中平均681个反应细胞。遗憾的是，未经刺激的背景也相当高，所以经再刺激后的显著增长仅在来自RAS免疫小鼠的肝中可检测到(p =0.0446；非配对t检验)。这些结果表明：来自经GAP和RAS免疫的C57B1/6小鼠的T细胞可真正地被至少一个Pb C2CP-衍生的表位所特异性地再刺激。

恶性疟原虫Ferlin(实施例2)

在RAS肝期的恶性疟原虫Ferlin(Pf FER)的上调经定量实时PCR(qRT-PCR)使用基因特异性引物来证实和定量。图11B显示了恶性疟原虫Ferlin(Pf FER)的相对转录物水平。

通过数个预测程序(包括表位预测程序SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de))的帮助，检测到了六种预测的HLA-A 0201-限制性CD8+ T细胞表位(图11A)。

为了调查在暴露于疟疾的个体中Pf Ferlin-特异性T细胞是否存在，与Britta Urban博士在肯尼亚医学研究所-Wellcome Trust研究计划(KEMRI)合作，在半免疫的肯尼亚成年人中测试了对Pf Ferlin肽(NLLDPLVVV、YLYVNIHKI、LLLEGNFYL、KLIPVNYEL、YLYEKQQEL、ILIPSLPLI)的T细胞应答。所有的成年人都居住在肯尼亚海岸蒙巴萨(Mombasa)以北约60公里的Junju地区(Junju District)。该地区有两个高传染季节，但是整年都有低水平的传染发生(每年感染性的叮咬：23-53次) (Mwangi等, 2005)。

为了检测活化的外周血单核细胞(PBMC)的抗原特异性IFN-γ产生，在暴露于疟疾的成年人以及未暴露于疟疾的个体进行了为期10天的培养的ELISpot分析。令人感兴趣的是，可检测到活化的Ferlin特异性T细胞(图12)。而且，当研究12个暴露于疟疾的成年人和5个未暴露于疟疾的个体中活化外周血单核细胞(PBMC)的抗原特异性IFN-γ产生时，在12个暴露于疟疾的成年人中的4个中检测到针对至少一种肽的Pf Ferlin特异性T细胞，在12个暴露于疟疾的成年人中的3个中检测到针对多于一种肽的Pf Ferlin特异性T细胞(表2)。

表2：所有测试的个体以及他们对每一个Pf Ferlin的肽片段的应答的总结。IFN-γ应答高于SFC 500的患者被确定为应答者。

Ferlin和Ferlin样蛋白的功能鉴定

为了功能性地鉴定伯氏疟原虫Ferlin(FER)和Ferlin样蛋白(FLP)，进行了目标基因的缺失，因为得到的缺失表现型可提示该蛋白的潜在功能。疟原虫目标基因的缺失在血液期寄生虫中进行。因此在血液期发育中必需的基因不能作为目标。然而，寻靶构建体的整合失败也可归因于基因组基因座同源重组的可达性较差。因此，产生了针对Pb FER和Pb FLP的敲除构建体和互补构建体，它们在相同试验中分别进行转染。

图13A和B显示了不同的遗传学策略。对于敲除寻靶构建体，对来自各自基因的5'和3'非翻译区(UTR)的两个片段使用特异性的寡核苷酸进行扩增。预期的片段尺寸经琼脂糖凝胶电泳得到确认。Pb FER片段是分别为676bp和773bp的5'和3'的UTR片段，Pb FLP片段的长度分别为678bp和612bp(未显示)。该两个相应的片段被克隆到所述的寻靶载体b3D内，其侧翼为7gDHFR/TS选择标记，得到了构建体pΔfer和pΔfip。对于对照互补构建体，包括终止子的C-末端片段以两个部分扩增，以插入在转染前线性化所必需的独特限制性位点。尺寸为952bp和744bp的Pb FER互补物以及尺寸为497bp和481bp的Pb FLP互补物分别再次经琼脂糖凝胶电泳得到确认(未显示)。将两个相应的片段依次克隆入克隆载体b3D+内，得到互补构建体pferCONT和pflpCONT。

按照描述的AMAXA转染方案，用经KpnI/XbaI消化的Δfer和Δflp构建体，以及经XbaI线性化的构建体ferCONT和flpCONT转染伯氏疟原虫的ANKA GFPcon株系(Franke-Fayard, 2004)。经转染的裂殖子直接静脉注射(i.v.)到NMRI小鼠体内。转染后第一天经吉姆萨染色的血涂片检查寄生虫血症。起始寄生虫血症在三个独立的试验中都相当低，为0.1%至0.3%。从第一天起乙胺嘧啶经饮用水送服给药以选择被转染的寄生虫。第二天寄生虫血症降低到吉姆萨染色血涂片无法检测的水平。在连续药物选择下抗性寄生虫在第7至9天首次出现于血中。对于Δflp，经敲除构建体转染的抗性寄生虫平均需9天才在薄的血涂片中出现，对于Δfer则需8.5天。经互补构建体pferCONT和pflpCONT转染的寄生虫血症要稍微快一些，各自小鼠的血液期阳性在转染后平均7.5天出现。一旦血液中的寄生虫水平增长到0.5%至1%，则处死小鼠。感染的血液存储为低温贮备液，并且将分离的寄生虫作为基因组DNA(gDNA)的亲本群保持。大约50－100μl的感染血液经腹膜内(i.p.)转移至未经实验的NMRI小鼠中，在药物压力下再次监测寄生虫血症。再次从感染的血液中收集即将出现的寄生虫并以转移群保存。通过特异性PCR核查了转染子的寻靶构建体整合(图13C和D)。

特异性的寡核苷酸对ORF I和ORF II扩增了Pb FER或Pb FLP可读框的不同部分。对于敲除基因型分型PCR，由ORF I寡核苷酸扩增的Pb FLP的DNA片段预期为978bp，Pb FER的DNA片段预期为1696bp。当使用WT gDNA或Δflp/Δfer gDNA作为PCR模板时，可在琼脂糖凝胶上观察到各自的条带(图13C)。正如所预期的，当寻靶敲除构建体被用作模板时，没有ORF I特异性的DNA片段被扩增。附加体特异性寡核苷酸对epi I和epi II扩增载体特异性片段。因此，当使用各自的寻靶构建体pΔflp和pΔfer作为模板以及使用抗性转染子Δflp和pΔfer(其携带所述质粒)的gDNA时，epi I特异性DNA条带(对于Pb FLP和Pb FER预期的尺寸分别为1165bp和1326bp)可在琼脂糖凝胶上检测到。测试寡核苷酸对－测试I和测试II，证实了寻靶构建体整合入寄生虫基因组，并且因此仅可由阳性转染子的gDNA来扩增。预期的尺寸为1301bp和1557bp的测试I特异性的DNA片段不能由转化子gDNA扩增，提示没有寻靶构建体pΔflp和pΔfer的整合，因此各自基因Pb FLP和Pb FER无缺失。对照互补基因分型PCR则不同(图13D)。当使用野生型gDNA或转染子flpCONT和ferCONT的gDNA作为模板时，尺寸为978bp或1068bp的ORF II特异性DNA片段可在琼脂糖凝胶上看见，并且不能由所述CONT互补构建体扩增。仅对于转染子的gDNA和载体对照，Epi II特异性DNA条带可在琼脂糖凝胶上检测到，尺寸分别为1478bp和2196bp。对于pflpCONT的尺寸为2879bp以及对于pferCONT的4304bp的测试II特异性DNA片段证明了对照互补构建体pflpCONT和pferCONT成功整合。由此可以证明两个基因组基因座的可达性。从三个独立的转染试验中获得了相同的基因型分型结果。

这些结果表明伯氏疟原虫Ferlin和Ferlin样蛋白是血液期发育所必需的，这些结果也通过对贯穿疟疾生活周期中的伯氏疟原虫Ferlin的转录概况的RT-PCR分析得到证实(图14)。

在上述说明书、权利要求书和/或附图中所披露的这些特征(独立地和任意组合)对于以不同的方式来实现本发明可能是很重要的。

参考文献

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