用于治疗性治疗肿瘤疾病的来源于成体干细胞的微泡(MV)

摘要

本发明涉及肿瘤的治疗性治疗的领域。本发明人已经发现，当给予患有肿瘤疾病的患者时，来源于成体干细胞的微泡发挥显著的抗肿瘤作用。优选的微泡来源于骨髓间质干细胞、肾小球间质干细胞或非卵肝干细胞。

说明书

本发明涉及肿瘤疾病的治疗性治疗（治疗性处理，therapeutic  treatment）。

已知造血干细胞移植在患有实体瘤的患者中发挥肿瘤抑制作用，以及 在转移性乳腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌中发挥抗肿瘤作用。

证明了人类骨髓间质干细胞（BM-MSC）有助于多种器官的修复和组 织修复，且实验性研究表明，MSC的移植可对包括心脏、肝脏和肾的几 种器官的功能和结构恢复具有有益的作用。

干细胞微环境通过提供抑制增殖和促进分化的信号，似乎在预防癌发 生中起到重要作用。

然而，由于已经报道了这种干细胞治疗的潜在的致瘤的风险，干细胞 在治疗适应症中的应用是不太可取的（Amariglio N et al.Donor-derived  brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia  telangiectasia patient.PLoS Med.2009 Feb 17;6(2)）。

细胞来源的微泡（microvesicle，MV）是通过表达细胞特有的抗原的 细胞而释放的小泡，其中它们起源于细胞且携带细胞膜和细胞质成分，且 已经被描述为细胞通讯的新的机制。最近，本发明的发明人已经证明了， 来源于人类内皮祖细胞（endothelial progenitor cells）（EPC）、BM-MSC和 肝脏的肝干细胞的微泡可用作遗传材料（mRNA）的转移的媒介物，其中 所述遗传材料能重编程靶分化细胞，如内皮细胞、管状上皮细胞（小管上 皮细胞，tubular epithelial cell）和肝细胞（Deregibus MC et al.Endothelial  progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in  endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA.Blood.2007 Oct  1;110(7):2440-8;Bruno S et al.Mesenchymal stem cell-derived microvesicles  protect against acute tubular injury.J Am Soc Nephrol.2009  May;20(5):1053-67;Herrera MB et al.Human liver stem cell-derived  microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats.J Cell  Mol Med.2009Jul 24），且有助于组织再生和修复。

国际专利申请WO2009/087361公开通过将诱导物应用于未分化细胞 的第一群（落）而生产分化的细胞，然后从分化的细胞分离微泡。参见 WO2009/087361第30页上那个方面中的第一完整段落。未分化的细胞的 第一个群是例如骨髓间质干细胞。然而，WO2009/087361没有公开直接从 未分化的细胞获得微泡。

本发明的发明人现在已经发现，来源于成体干细胞，优选来源于骨髓 或肾小球间质干细胞（glomerular mesenchymal stem cell）或来源于非卵肝 干细胞（non-oval liver stem cells）的微泡，在体内和体外表现显著的抗肿 瘤活性，因此代表用于癌症的治疗性治疗的相应的整个干细胞范围内有利 的可替换物。在体外通过测量微泡在多种人类癌细胞系的增殖和凋亡上以 及它们在毛细管样结构的形成上的作用，证明依照本发明来源于成体干细 胞的微泡的抗肿瘤活性。在体内小鼠模型中通过测量MV治疗（处理）对 肿瘤生长的作用也证实了微泡的抗肿瘤活性。

在现有技术上，完全想不到来源于成体干细胞的微泡的观察到的抗肿 瘤活性。实际上已知间质干细胞（MSC）的制剂对某些组织发挥再生作用。 例如，已知骨髓来源的MSC通过分泌许多营养分子自然地支持造血作用， 所述营养分子包括可溶解的细胞外基质糖蛋白、细胞因子和生长因子。此 外，在WO2009/050742中显示来源于内皮干细胞的微泡在体外和体内促 进血管生成和抵抗凋亡。在WO2009/057165中，已知来源于干细胞的微 泡诱导受损的组织或器官的内皮和上皮再生。

在WO2009/105044中，推测性地说来源于间质干细胞的微泡适合于 用于多数和多种疾病的治疗。没有提供关于癌症治疗的实验证据、理论解 释和具体方法。

因此，本发明的第一方面是用于治疗性治疗（治疗性处理，therapeutic  treatment）肿瘤疾病的来源于成体干细胞的微泡。

关于这一点，应该理解，微泡不一定来源于应该将微泡给予他们的相 同患者的成体干细胞。更确切地，它们可来源于不同的受试者，以药剂的 形式制备和维持，然后给予需要其的患者。这是所谓的异源的途径。

在优选的实施方式中，成体干细胞是人类间质干细胞（human  mesenchymal stem cell）或人类肝干细胞。优选的人类肝干细胞是表达在 WO 2006/126219中公开的间质和胚胎干细胞标记的人类非卵肝干细胞 （human non-oval liver stem cell）（HLSC）。这种细胞系具体的表征是，它 是从成体组织分离的非卵人类肝多能性祖细胞系，其中所述成体组织表达 肝细胞标记且能够分化成成熟的肝细胞、胰岛素生产细胞、骨原细胞和上 皮细胞，且优选地表达选自包含白蛋白、α-胎蛋白、CK18、CD44、CD29、 CD73、CD146、CD105、CD90的组的标记，且优选不表达选自包含CD133、 CD117、CK19、CD34、细胞色素P450的组的标记。

在另一个优选的实施方式中，人类间质干细胞来源于人类成体骨髓 （BM-MSC）。在另一个优选的实施方式中，人类间质干细胞来源于人类 成体去被膜的肾小球（human adult decapsulated glomeruli）（Gl-MSC），如 欧洲专利申请号08425708.8中公开的。此外，这些细胞的表征是，它们是 CD133阴性的、CD146阳性的和CD34阴性的且它们能够分化成足细胞 （podocyte）、内皮细胞和系膜细胞（mesangial cell），且它们也优选表达 选自包含CD24、Pax-2、CD31、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、 CD166、nanog（一种干细胞转录因子）、musashi（一种转录抑制因子）、 波形蛋白、巢蛋白的组的标记，且优选地不表达选自包含α-SMA、Oct-4、 CD45、细胞角蛋白、CD80、CD86、CD40的组的标记。

依照本发明的一个实施方式，肿瘤疾病选自由肝肿瘤（例如，肝细胞 瘤）、上皮性肿瘤（例如，卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma））、乳腺肿瘤（breast  tumor）（例如，乳腺癌）、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤（gastric tumour）、 结肠肿瘤（colon tumour）和卵巢肿瘤组成的组。

本发明的另一个方面是如上述限定的来源于成体干细胞的微泡在制 备用于如上述定义的肿瘤疾病的治疗性治疗的药剂中的应用。

在一个实施方式中，治疗性治疗包括一种或多种细胞毒素剂或细胞抑 制剂的给予。适当的细胞毒素剂和细胞抑制剂包括，例如，紫杉醇、来那 度胺（Lenalidomide）、泊马度胺（Pomalidomide）、表柔比星（Epirubicin）、 5FU、舒尼替尼（Sunitinib）、拉帕替尼（La-patinib）、卡奈替尼（Canertinib）、 环磷酰胺、多柔比星（doxorubicin）、来那度胺/地塞米松 （Lenalidomiden/Dexamethason）、泊马度胺/地塞米松 （Po-malidomide/Dexamethasone）、卡铂（Carboplatin）、雷帕霉素 （Rapamycin）、米托蒽醌（mitoxantron）、奥沙利铂（oxaliplatin）、多西紫 杉醇（多西他赛，docetaxel）、长春瑞滨（vinorelbin）、长春新碱（vincristine） 和它们的任何组合。高度优选的是给予多柔比星和/或长春新碱与来源于成 体干细胞的MV的组合，因为已经显示了这样的组合发挥协同效应（参见 图13）。

局部地或系统地（全身性地，systemically）将微泡给予需要其的患者。 适于局部的和系统给药的药物剂型是例如可注射的剂型。借助于实例，在 实体瘤中通过局部的肿瘤内（i.t.）注射，或在实体瘤和转移性肿瘤的两种 情况中，通过静脉内注射或灌输给予微泡。待给予的适当的MV剂量取决 于多种因素，但是通常包含在0.1至200微克/kg接受者体重之间，优选 1-150微克/kg接受者体重，甚至更优选地3-120微克/kg接受体体重。

如本文中使用的表述“来源于成体干细胞的微泡（MV）”涉及至少 部分来源于成体干细胞的膜颗粒。依次，术语“成体干细胞”包括能够增 殖（自我更新（self-renewal））和分化（可塑性）的任何未分化或部分未 分化的细胞，因此替代已经达到它们的生命周期的末端的特定的细胞谱系 的成熟细胞。如本说明书中使用的术语“成体干细胞”包括具有无限的自 我更新能力和多能性可塑性的两种干细胞、和具有多能可塑性（multipotent  plasticity）且在某些情况中有限的更新能力能力的祖细胞。在优选的实施 方式中，具有多能性或多能可塑性的“成体干细胞”意味着，它们能够分 化成至少两个、更优选至少三个不同类型专门的完全分化的成熟细胞。

在本说明书的背景内，与从胚泡的内细胞团分离的“胚胎干细胞”形 成对比，表述“成体干细胞”用于指从成体组织分离的干细胞。成体干细 胞（adult stem cell）也称为“体干细胞（somatic stem cell）”。

在本说明书的背景内，表述“来源于成体干细胞的微泡（MV）”用 于指微泡直接来源于未分化的干细胞。

在本说明书的背景内，表述“直接”是指微泡来源于在获得微泡之前 没有进行或发生任何分化步骤的未分化的成体干细胞。

本发明中使用的来源于成体干细胞的微泡在外形上通常是球形且具 有在100nm至5μm范围内的直径，更典型地在0.2至1μm之间的直径。 如果颗粒在外形上不是球形，则上述提及的值是指颗粒的最大尺寸。

如本说明书的实验部分中描述的，可以分离从其获得用于本发明中微 泡的干细胞。然后，例如，如本说明书的实验部分中公开的通过超速离心 法，可从分离的干细胞的上清液获得微泡（MV）。然后，在具有一种或多 种低温防护剂（cryoprotecting agent）的悬浮液中，在非常低的温度下，例 如，在-80°C下，通过冷冻存储分离的MV，直到使用。适当的低温防护 剂是例如二甲亚砜（DMSO）和甘油。使用细胞悬浮液的体积的1%的浓 度的DMSO保证细胞的良好的保存、和对再灌输患者的有限的毒性作用。 可称作低温防护剂的其他物质是细胞外低温防护剂，即，在细胞表面上担 当形成减少细胞内脱水作用的紧密屏障（tight barrier）的高分子量物质。

从下列实施例将更加清晰地看出本发明的进一步的目的和优势，所述 实施例仅为了说明而提供。在实施例中，参考下列附图。

图1A和B显示，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用不 同剂量的微泡（MV）对HepG2细胞（图1A）和KS细胞（图1B）的孵 育显著地抑制了增殖。在利用经RNA酶（RNase）预处理或不经RNA酶 预处理的来自BM-MSC或来自G1-MSC的不同剂量的MV（1、10和 30μg/ml）孵育48小时之后，通过BrdU掺入法（BrdU incorporation assay） 评价HepG2和KS细胞的增殖。以3次实验的平均值±SD表示结果。

图2A和B显示，与利用单独的媒介物和以同样方式的多柔比星刺激 孵育对照相比，利用MV对HepG2和KS细胞的孵育显著地促进凋亡。以 在利用（经RNA酶预处理或不经RNA酶预处理的）来自BM-MSC或 Gl-MSC的不同剂量的MV的孵育24小时和/或48小时后，凋亡细胞的百 分数，通过Tunel法评价HepG2和KS细胞的凋亡。以3次实验的平均值 ±SD表示结果。

图3A和3B显示，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用 来自BM-MSC的30μg/ml MV对MCF-7细胞（图3A）和SKOV-3细胞（图 3B）孵育48小时显著地抑制增殖。在利用来自BM-MSC或来自Gl-MSC 的30μg/ml MV孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价MCF-7和SKOV-3 细胞的增殖。以3次实验的平均值±SD表示结果。

图4显示，来自BM-MSC的MV诱导G0/G1阶段细胞的增加，特别 是SKOV-3细胞。在利用10%FCS、耗尽FCS（饥饿（缺乏，starvation）） 和在有30μg/ml的MV存在的情况下培养24小时的SKOV-3细胞中测量 DNA含量。观察在有MV存在的情况下G0/G1阶段中的细胞数目的增加。

图5A和5B显示进行评价MV对体外血管生成的作用的实验结果。 评价HUVEC和TEC在基质膜（基质胶，Matrigel）内形成毛细管样结构 的能力。

图6显示进行评价MV对体外凋亡的作用的实验结果。以在利用不 同剂量的MV孵育48小时之后凋亡细胞的百分比，通过Tunel法评价 HUVEC和TEC的凋亡。

图7显示进行评价MV对TEC的增殖作用的实验结果。在利用经RNA 酶预处理或不经RNA酶预处理的来自BM-MSC的不同剂量的MV（10 和30μg/ml）孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价TEC的增殖。以2 次实验的平均值±SD表示结果。

图8显示，肿瘤内给予具有HepG2异种移植肿瘤的SCID小鼠，经 RNA酶处理或不经RNA酶处理的MV的体内抗肿瘤活性。通过植入物的 两个垂直的直径的测径法每周测定肿瘤块（tumor mass）。以肿瘤块的增量 的百分比显示结果：按照惯例将在第一次治疗的肿瘤块（在HepG2注射 之后的1周）固定为100%值。

图9显示来源于BM-MSC的MV减少体内肿瘤生长。A）利用（右 侧）或不利用（左侧）来自BM-MSC的MV治疗的具有HepG2肿瘤的小 鼠的典型实例。B）利用（右侧）或不利用（左侧）来自BM-MSC的MV 治疗的离体的HepG2肿瘤的典型实例。C）利用（右侧）或不利用（左侧） 来自BM-MSC的MV治疗的HepG2肿瘤的苏木精和曙红染色。

图10显示具有RNA酶的MV的预处理取消来源于BM-MSC的MV 的抗肿瘤活性。A）利用MV-RNA酶处理的离体的HepG2肿瘤的典型实 例。B）利用MV-RNA酶处理的HepG2肿瘤的苏木精和曙红染色。

图11是显示HepG2上的BrdU-基础的增殖实验的结果的图。在单独 的DMEM中或利用来源于HLSC的不同剂量的MV补充的DMEM中培 养HepG2。在3天后，利用BrdU掺入法量化HepG2增殖。

图12是显示在HepG2细胞上凋亡实验的结果的图。在只有DMEM 中，或在具有10%FCS和利用长春新碱（100ng/ml）、或MV-HLSC （30μg/ml）、或MV-HLSC（利用RNA酶预处理的，30μg/ml）补充的DMEM 中培养HepG2细胞。在24小时之后进行分析。

图13是显示在基础条件下的HepG2细胞，或利用长春新碱、多柔比 星、MV-HLSC、或利用长春新碱加MV-HLSC以及多柔比星加MV-HLSC 处理的HepG2细胞上凋亡实验的结果的图。

图14是显示在MV-HLSC（n＝3）、媒介物（n＝2）或MV-HLSC（n ＝3）RNA酶处理、i.t.处理之后，在小鼠处死时，通过测量重获的HepG2 肿瘤的肿瘤体积获得的数据的图。每周通过利用测径器测量植入物的两个 垂直直径来测定肿瘤体积。

图15显示了示出通过HLSC-MV治疗的体内肿瘤生长的抑制和诱导 的肿瘤内凋亡的显微照片。A）显示在4周之后重获的HepG2肿瘤的凋亡、 PCNA和苏木精和曙红染色的典型的显微照片。B）显示来自MV治疗的 小鼠重获的HepG2肿瘤的凋亡、PVNA和苏木精和曙红染色的典型的显 微照片。C）显示来自MV-RNA酶处理的小鼠重获的HepG2肿瘤的凋亡、 PVNA和苏木精和曙红染色的典型的显微照片。

图16是显示通过利用不同浓度的HLSC-MV孵育MCF-7细胞进行体 外增殖试验的结果的图。在利用来源于HLSC细胞的2、10、15和30μg/ml 的MV孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价MCF-7细胞的增殖。一 式三份进行实验。P<0.05。

图17显示通过利用不同浓度的HLSC-MV孵育卡波西细胞（Kaposi  cell）（KS）进行体外增殖试验的结果的图。在利用来源于HLSC细胞的2、 10、15和30μg/ml的MV孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价卡波 西细胞的增殖。一式三份进行实验。P<0.05。

图18是显示通过利用HLSC-MV孵育MCF-7细胞和卡波西细胞进行 体外凋亡试验的结果的图。以在利用不同剂量的MV（2；10；15；和30μg/ml 和30μg/ml的RNA酶处理的MV）孵育48小时之后凋亡细胞的百分比， 通过TUNEL法评价凋亡。多柔比星用作凋亡诱导的阳性对照。在阴性对 照中，利用单独的媒介物处理MCF-7细胞和卡波西细胞。一式三份进行 实验。P<0.05。

1.来自间质干细胞（MSC）的微泡（MV）

1.1MSC的分离和表征

在蔗聚糖（Ficoll）梯度上将骨髓细胞分层（密度：1022g/ml； Sigma-Aldrich,St.Louis,MO），且在1500rpm下离心30分钟。在有间质 干细胞基础培养基（MSCBM,Lonza）存在的情况下培养单核的细胞。在 培养5天后，更换培养基。为了展开分离的细胞，在37°C下通过胰酶处 理5分钟分离粘连的单层，在15天用于第一次传代和每隔7天用于后续 的传代。以10,000个细胞/cm²的密度接种细胞，且使用不晚于传代6次的 细胞。

如在Bruno S et al.Isolation and characterization of resident  mesenchymal stem cells in human glomeruli.Stem Cells Dev. 2009;18:867-880中描述的，从外科去除的肾的皮层的正常部分获得来自肾 小球的MSC群（Gl-MSC）。在皮层解剖之后，利用标准建立的技术收集 肾小球悬浮液：在通过分级系列的网眼（60目和120目）之后，在120 网眼筛的顶部重获肾小球。然后在通过自发的沉淀（室温下10分钟）在 圆锥管的底部收集肾小球，且通过利用10ml吸液管吸入/排出的几个循环 机械地且通过利用胶原酶I（Sigma,St.Louis,MO）消化2分钟酶促地剥 离肾小囊（Bowman’s capsule）的脏层。然后在通过自发沉淀以便去除细 胞和肾小囊的圆锥管的底部收集肾小球，和将其转移到纤连蛋白涂覆的 T25烧瓶中（Falcon,BD Bioscience,Two Oak Park,Bedford,MA）。在有间 质干细胞基础培养基（MSCBM,Lonza）存在的情况下培养肾小球。使细 胞静置，以便在传代之前达到汇合；传代之间的间隔不同（3-7天）直到 传代4次，从那时起其在约7天建立。

在每一次传代，对细胞计数且通过细胞荧光测定分析（cytofluorimetric  analysis）和免疫荧光对免疫表型进行分析。利用下列抗体进行细胞荧光测 定分析，结合：抗-CD105、-CD29、-CD31、-CD146、-CD44、-CD90 （Dakocytomation,Copenhagen,Denmark）；-CD73、-CD34、-CD45、-CD80、 -CD86、-CD166、HLA-I（Becton Dickinson Biosciences Pharmingen,San Jose, CA）；-CD133（Miltenyi Biotec,Auburn）；KDR（R&D Systems,Abington, U.K.）；-HLA-II（Chemicon International Temecula,CA）；-CD40（Immunotech, Beckman Coulter）、-CD154（Serotec,Raleigh,NC USA）单克隆抗体的所 有的藻红蛋白（PE）或异硫氰酸荧光素（FITC）。小鼠IgG同型对照来自 Dakocytomation。在4°C上，在含有0.1%牛血清蛋白和0.1%叠氮化钠的 100μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行所有的孵育。对于每一个样品，在 FACSCalibur细胞计数器（BD Biosciences Pharmingen）上分析10,000个 细胞。基于阴性对照构造选通（gating）且所有进行的分析中都包括补偿 对照。利用Cell Quest软件（BD Biosciences Pharmingen）产生关于每次实 验的选通群的群百分比和数目。

在腔室载玻片（Nalgen Nunc International,Rochester,NY，USA）上培 养的、在含有2%蔗糖的4%多聚甲醛中固定的且如果需要利用 Hepes-Triton X 100缓冲液（Sigma,St.Louis,MO）渗透的MSC上进行间 接的免疫荧光。使用下列抗体：小鼠单克隆抗波形蛋白（Sigma）和兔多 克隆抗血管假性血友病因子（anti-von Willebrand factor） （Dakocytomation）。在适当的情况下，排除初级抗体或利用非免疫的兔或 小鼠IgG的代替用作对照。Alexa Fluor 488抗兔和抗小鼠德克萨斯红 （Texas Red）（Molecular Probes,Leiden，荷兰）用作第二抗体。利用Zeiss  LSM 5 Pascal Model Confocal Microscope（Carl Zeiss International, Germany）进行共聚焦显微镜法分析。添加Hoechst 33258染料（Sigma）， 用于核染色。

BM-MSC和GL-MSC制剂不表达造血标记如CD45、CD14和CD34。 它们两者都不表达共刺激分子（co-stimulatory molecules）（CD80、CD86 和CD40）和内皮标记（CD31、血管假性血友病因子、KDR）。在培养的 不同传代上的所有的细胞制剂表达典型的MSC标记：CD105、CD73、 CD44、CD90、CD166和CD146。它们也表达HLAI类。

如在Pittenger MF,Martin BJ.Mesenchymal stem cells and their  potential as cardiac therapeutics.Circ.Res 2004;95:9-20中描述的测定MSC 的脂肪形成、成骨形成和软骨形成的分化能力。简单地说，利用Adipogenic  Medium（Lonza）培养MSC 3周。为了评价分化，利用4%多聚甲醛在室 温下固定细胞20分钟，且利用在甲醇（Sigma）中的0.5%Oil Red O（Sigma） 在室温下将细胞染色20分钟。

通过在Osteogenic Medium（Lonza）中培养的MSC评估成骨形成的 分化。每周更换培养基两次持续3周。为了评价分化，利用4%多聚甲醛 固定细胞20分钟，且利用Alizarin Red，pH 4.1（Lonza）在室温下染色细 胞20分钟。

对于成骨形成分化，在15-ml圆锥形的聚丙烯管（Falcon BD  Bioscience）中，以150g将2.5×10⁵MSC离心5分钟，且利用DMEM洗 涤两次。在利用10ng/ml转移生长因子β3（Lonza）补充的软骨形成培养 基（Chondrogenic medium）（Lonza）中培养（细胞）球粒（沉淀物，pellets）。 每隔3天更换培养基，持续28天。在4%多聚甲醛中固定粒料过夜，和利 用0.1%番红精O（Sigma）对石蜡包埋的切片（paraffin-embedded section） 染色糖胺聚糖，和利用1%阿尔蓝（alcian blue）染色硫酸化蛋白多糖。

1.2来源于MSC的MV的分离和表征

从BM-MSC或GL-MSC的上清液中获得微泡（MV），其中在缺少 FCS的RPMI和利用0.5%的BSA（Sigma）补充的RPMI中培养如上述描 述获得的BM-MSC或GL-MSC。以2,000g离心过滤20分钟以便去除碎片 之后，以100,000g（Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机）在4°C 下将无细胞的上清液离心1小时，在含有N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸 （N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid）（HEPES）25mM （Sigma）的无-血清的培养基199中洗涤，且在相同的条件下进行第二次 离心。通过鲎试验（Limulus test）根据制造商的说明（Charles River  Laboratories,Inc.,Wilmington,MA,USA）排除MV的内毒素污染物，且将 MV贮藏在-80°C。

在选择性实验中，利用1U/ml RNA酶（Ambion Inc.,Austin,TX,USA） 在37°C将MV处理1小时，通过添加10U/ml RNA酶抑制剂（Ambion Inc.） 终止反应，且通过超速离心洗涤MV。

1.3利用来源于MSC的MV进行的体外实验

癌细胞系培养。在含有10%的胎牛血清（FCS,Euroclone）、100U/ml 青霉素、100mg/ml链霉素和1%谷氨酰胺（所有的都来自Sigma）的低葡 萄糖DMEM（Euroclone）中培养人肝癌细胞系（HepG2）、人乳腺癌细胞 系（MCF-7）和人卵巢癌细胞系（SKOV-3），且维持在具有5%CO₂的潮 湿气氛的37°C的培养箱中。从在免疫抑制治疗下的具有肾异源移植的患 者的皮肤伤口中获得卡波西肉瘤细胞（KS细胞）的初级培养，且在利用 10%FCS、100μg/ml青霉素、和100μg/ml链霉素补充的RPMI 1640培养 基中培养。

肿瘤内皮细胞(TEC)：分离和培养。利用MACS系统（Miltenyi Biotec, Auburn,CA,USA），使用通过磁性细胞分选耦合到磁性珠上的抗-CD105 Ab，从透明细胞类型肾细胞癌的样本中分离TEC。建立TEC细胞系，且 维持在利用表皮生长因子（10ng/ml）、氢化可的松（1mg/ml）、牛脑提取 物（所有的都来自Lonza）和10%FCS补充的内皮基础完全培养基（EBM） 中。通过形态学、关于vWF抗原、CD105、CD146和血管内皮细胞钙依 粘连蛋白（血管内皮钙黏蛋白，vascular endothelial-cadherin）的阳性染色、 和关于细胞角蛋白和结蛋白阴性染色将TEC表征为内皮细胞（Bussolati B  et al.Altered angiogenesis and survival in endothelial cells derived from renal  carcinoma.FASEB J 2003;17:1159-1161）。

人脐静脉内皮细胞(Humbelical Vein Endothelial Cells）(HUVEC)： 分离和培养。如先前描述的（Bussolati B et al.Vascular endothelial growth  factor receptor-1 modulates vascular endothelial growth factor-mediated  angiogenesis via nitric oxide.Am J Pathol.2001Sep;159(3):993-1008），从脐 静脉获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），且维持在EBM和10%FCS中。 在第二次或第三次传代的HUVEC上进行实验。

细胞增殖。以2,000或4,000个细胞/孔将HepG2、MCF-7、SKOV-3、 KS细胞或HUVEC接种到96孔板中，其中所述96孔板处在具有经RNA 酶预处理或不经RNA酶预处理的不同浓度的微泡的缺乏FCS的DMEM （Sigma）中。在培养48小时之后以将5-溴-2’-脱氧-尿苷（BrdU）掺入到 细胞DNA中的方式，探测DNA合成。然后利用0.5M乙醇/HCl固定细胞 和利用核酸酶孵育，以便消化DNA。利用抗BrdU过氧化物酶-结合的mAb 探测到DNA的BrdU掺入，且利用可溶解的发色体基质（Roche Applied  Science,Mannheim,Germany）显现。利用ELISA读取器在405nm处测量 光学密度。

细胞周期分析。利用30μg/ml的MV的不同制剂刺激人类癌细胞系 24小时，通过胰酶分离且在冷的80%乙醇中固定。将细胞维持在-20°C至 少24小时，然后在PBS中洗涤。然后，在含有RNA酶（200μg/ml）（Sigma） 和0.5%的诺乃洗涤剂P40（Nonidet P40）（Sigma）的溶液中，利用碘化丙 啶（50μg/ml）（Sigma），在室温下孵育细胞1小时，以便染色DNA。对 于每个样品，在FACSCalibur血细胞计数器（BD Biosciences Pharmingen） 上分析50,000个细胞。

凋亡试验。将HepG2、MCF-7、SKOV-3、KS细胞、HUVEC或TEC 以8,000个细胞/孔接种到96孔板中，其中所述96孔板处在具有10%FCS 和存在多柔比星（100ng/ml，Sigma）或经或不经RNA酶预处理的不同浓 度的MV（10和30μg/ml）的DMEM（Sigma）中。通过TUNEL法评估 凋亡（ApopTag Oncor,Gaithersburg,MD,USA）。在处理24小时或48小时 后，利用PBS洗涤细胞，在pH 7.41%多聚甲醛中在4°C下将细胞固定15 分钟，在PBS中洗涤两次，然后在预冷的乙醇-乙酸2:1在-20°C下将细胞 后固定5分钟。利用酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）处理样品。然后利 用热的结合荧光素的抗地高辛（anti-digoxigenin）处理细胞，且在室温下 孵育30分钟。在含有1μg/ml的碘化丙啶的培养基中制作样品，且通过免 疫荧光分析细胞。以绿色荧光发射细胞（凋亡的细胞）相对于红色荧光发 射细胞（总的细胞）的百分比表示结果。

体外血管形成。在4°C下利用生长因子-诱导的基质膜（BD  Biosciences）涂覆24孔板，且在37°C，5%CO₂，潮湿的气氛中孵育30分 钟。以5×10⁴个细胞/孔的密度，在存在或在缺少经RNA酶处理或不经RNA 酶处理的不同浓度的MV的情况下，将HUVEC或TEC接种在处在具有 5%FCS的RPMI或EBM中的基质膜涂覆的孔上。在孵育6小时之后，在 尼康倒置的显微镜（Nikon）下观察细胞，且记录实验结果。以利用缩微 图像分析系统（Cast Imaging）测量，以任意单位表达且在3个不同实验 的副本孔中20×放大倍率下在5个不同的视场中评价的管状长度的平均值 表示结果。

统计分析。以平均值±SD表示不同的实验进程的所有数据。在适当 的情况下，通过具有Newmann-Keuls多重比较试验的ANOVA进行统计分 析。

1.4体外结果

1.4.1来源于肿瘤细胞系上的BM-MSC和GL-MSC的MV的体外生物学效应

在体外通过测量它们对于HepG2、MCF-7、SKOV-3和KS细胞系的 抑制增殖和诱导凋亡的能力，评估来源于人类BM-MSC的MV的抗肿瘤 活性。

图1显示了与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比利用不同剂量 的MV对HepG2细胞（图1A）和KS细胞（图1B）孵育48小时显著地 抑制增殖。

图2显示了与利用单独的媒介物和以相同方式的多柔比星刺激的孵 育对照细胞相比利用MV对HepG2细胞（图2A）和KS细胞（图2B）孵 育24小时和48小时显著地促进凋亡。

当利用RNA酶孵育MV以便诱导有MV运输（shuttle）的RNA的 完全的降解时，减少由MV引出的对HepG2和KS细胞的抗增殖和促凋亡 作用（图1和图2）。MV的RNA酶的处理本身不干扰由多柔比星诱导的 癌细胞系的凋亡（图2）。

相反，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用来自BM-MSC 的30μg/ml MV对MCF-7细胞和SKOV-3细胞孵育48小时显著地抑制增 殖（图3A和3B），但是不促进凋亡。在这两种肿瘤细胞系中，发明人还 已经利用碘化丙啶染色技术研究了细胞周期，以便与S和G2阶段中的细 胞的比较，评价G0/G1阶段中的细胞百分比。发明人已经观察到，来自 BM-MSC的MV诱导G0/G1阶段中的细胞的增加，特别是在SKOV-3细 胞中（图4），其可解释利用BrdU掺入观察的增殖的抑制。

发明人还检验了来源于Gl-MSC的MV对肿瘤细胞系的增殖和凋亡 的作用。Gl-MSCs不影响HepG2细胞系的增殖和凋亡。相反，来源于 Gl-MSC的MV抑制KS细胞的增殖和诱导凋亡（图1和图2）。此外，与 利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用来源于Gl-MSC的30μg/ml MV对MCF-7和SKOV-3细胞孵育48小时抑制增殖（图3），但是不促进 凋亡。

1.4.2来源于人成纤维细胞的MV

来源于人成纤维细胞的MV不抑制不同的癌细胞系的增殖且不诱导 凋亡（数据没有示出）。

1.4.3来源于BM-MSC的MV对内皮细胞的体外作用

发明人也已经研究了，来源于BM-MSC的MV对HUVEC和肿瘤内 皮细胞（TEC）的增殖、凋亡和毛细管样（capillary-like）形成的体外作用。

MV处理不影响HUVEC的增殖（数据没有示出）和毛细管样形成能 力（图5A）。另外，利用不同剂量的MV对HUVEC孵育48小时不诱导 凋亡（图6）。

相反，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用不同剂量的 MV对TEC孵育48小时显著地抑制增殖（图7）和促进凋亡（图6）。在 利用经RNA酶预处理或不经RNA酶预处理的来自BM-MSC的不同剂量 的MV（10和30μg/ml）孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价TEC 的增殖。以2次实验的平均值±SD表示图7中的结果。

当利用RNA酶孵育MV时，显著地减少通过MV引出的对TEC的 凋亡作用。利用不同剂量的MV，对接种在基质膜上的TEC的孵育显著地 抑制TEC在体外形成管状结构的能力。利用RNA酶的MV的预处理取消 了MV对细管形成的抑制作用（图5B）。

1.5利用来源于MSC的MV的体内试验

肿瘤形成。收集3×10⁶个HepG2细胞且皮下地植入SCID小鼠（Charles  River,Jackson Laboratories,BarHarbor,ME）。利用胰酶-EDTA收获的培养 细胞，利用PBS洗涤，在微型血细胞计数器腔室中计数，且在100μl DMEM 和100μl基质膜基质（Matrigel Matrix）（Becton Dickinson）中重悬。在冰 上冷冻细胞，且通过26号针利用1-ml注射器皮下地注入SCID小鼠的左 后方。每天监视动物的活性和身体状态，且每隔3天进行体重的测定和肿 瘤块的测量。以植入物的两个垂直的直径通过测径器测量法测定肿瘤块， 且利用式1/2ax b²计算肿瘤块，其中a是长直径，和b是短直径（Hou J et  al.Experimental therapy of hepatoma with artemisin and its derivatives:in vitro  and in vivo activity，chemosensitization and mechanism of action.Clin Cancer  Research.2008;14:5519-5530)）。在1周后，当植入的肿瘤达到大约15mm³体积时，发明人开始每周一次的MV的肿瘤内注射。第一次治疗利用100 μgMV（经或不经RNA酶处理），以20μl的最大体积进行；随后的肿瘤 内注射利用50μg的MV（经或不经RNA酶处理），以20μl的最大值进行。 在对照小鼠中，发明人肿瘤内注射相同体积的单独的媒介物。将小鼠随机 化分成三个治疗组：a）利用MV肿瘤内注射的组（n＝8）；b）利用经RNA 酶处理的MV肿瘤内注射的组（n＝8）；和c）利用相同体积的单独的媒 介物注射的对照组（n＝5）。在基质膜注射三周之后，处死小鼠，且重获 肿瘤，且处理肿瘤用于组织学。

1.6体内结果

1.6.1来源于BM-MSC的MV对HEPG2肿瘤生长的体内生物学效应

在SCID小鼠中，通过来源于BM-MSC的MV抑制肿瘤形成和生长。 为了测定来源于BM-MSC的MV在体内对肿瘤形成和生长的作用，在有 基质膜存在的情况下利用HepG2皮下地注射SCID小鼠。在注射后一周， 当肿瘤的体积大约是15mm³时，发明人开始利用MV（经RNA酶处理或 不经RNA酶处理），以20μl的最大体积，每周一次地对小鼠肿瘤内注射。 第一次治疗利用100μg的MV；随后的肿瘤内注射利用50μg的MV。在 对照的小鼠中，发明人肿瘤内注射20μl单独的媒介物。

在基质膜注射三周后，重获所有的肿瘤且进行分析。在HepG2异种 移植模型中，MV肿瘤内注射显示对肿瘤生长的抑制剂作用（图8）。在利 用MV治疗的SCID小鼠中肿瘤的大小和体积显著更小（图9A和B），组 织学分析显示利用MV治疗的HepG2肿瘤中的坏死的区域（图9C）。利 用经RNA酶预处理的MV注射的肿瘤在大小和组织学方面与对照肿瘤没 有不同（图10A和B）。

2.来自肝干细胞的微泡（MV）

2.1成人肝干细胞（HLSC）的分离和表征

从来自Cambrex Bio Science Verviers S.p.r.l.（Verviers,Belgium）获得 的人类冷藏保存的正常肝细胞分离HLSC，将其培养在利用L-谷氨酰胺（5 mM）、Hepes（12mM，pH 7.4）、青霉素（50IU/ml）、链霉素（50μg/ml） （所有都来自Sigma，St.Louis）、FCS（10%）补充的最小的基本培养基/ 内皮细胞基础培养基-1中（α-MEM/EBM）（3:1）（Gibco/Cambrex）。将展 开的细胞转移到T-75烧瓶中，且当它们接近汇合（confluence）时进行分 析。

在含有10%胎牛血清（FBS）的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM） （低葡萄糖）中培养肝瘤细胞系HepG2。

2.2来源于HLSC的MV的分离

从在利用2%胎牛血清（FBS）补充的MEM-α中培养的HLSC的上 清液中获得MV。通过台盼蓝拒染法（trypan blue exclusion）探测在没有 血清的情况下孵育过夜的细胞的生存能力。在以2000g离心20分钟以便 去除碎片后，以100,000g（Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机） 在4°C下将无细胞的上清液离心1h，在含有N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸 （HEPES）25mM（Sigma）的无血清培养基199中洗涤，且在相同的条件 下进行第二次超速离心。为了跟踪在体外和体内通过荧光显微镜法或 FACS分析的MV，利用插入脂质双分子层PKH26染料（Sigma）的红色 荧光脂肪族发色团标来自干细胞的MV。在标记之后，洗涤MV，且以 100,000g在4°C下超速离心1h。在培养基199中悬浮MV粒料，且通过 布拉德福德方法（BioRad,Hercules,CA）量化蛋白质含量。通过鲎试验根 据制造商的说明（Charles River Laboratories,Inc.,Wilmington,MA）排除 MV的内毒素污染物，且将MV贮藏在-80°C。在利用碘化丙啶着色之后， 在MV悬浮液上进行形态学分析，不显示凋亡小体的存在。

在选择性试验中，利用1U/ml RNA酶（Ambion Inc.,Austin,TX），在 37°C将来自HLSC的MV处理1h，通过加入10U/ml RNA酶抑制剂 （Ambion Inc.）来终止反应，且通过超速离心洗涤MV。在利用TRIZOL 试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA）进行RNA提取之后，通过总的抽出的RNA 的分光光度计分析评价RNA酶处理的功效（未处理的：1.3±0.2μg RNA/ mg蛋白质MV；RNA酶处理的：<0.2μg RNA/mg蛋白质MV）。另外， 通过寡dT驱动的逆转录（retrotranscription）标记从经RNA酶处理的和未 经RNA酶处理的MV提取的RNA，且在0.6%琼脂糖凝胶上分析，以便 显示通过RNA酶处理的RNA的完全的降解。作为对照，利用1U/ml DNA 酶（Ambion Inc.）在37°C将MV处理1h。

2.3利用从HLSC分离的MV进行的体外实验

增殖分析。根据制造商的说明，利用酶联免疫吸附测定试剂盒 （Chemicon,Temecula,CA），以将5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入到细胞 DNA中的方式，探测DNA合成。简要地，在洗涤之后，利用10mol/l BrdU 在37°C、5％CO₂、潮湿的气氛中将细胞孵育6至12小时，利用0.5mol/L 乙醇/HCl固定细胞，且利用核酸酶孵育以便消化DNA。利用抗BrdU过 氧化物酶结合的单克隆抗体探测掺入到DNA中的BrdU，且利用可溶解的 发色基质显现。利用酶联免疫吸附测定读取器在405nm下测量光学密度。

凋亡分析。利用终端dUTP缺口末端标记实验（terminal dUTP nickend  labeling assay）（ApoTag;Oncor,Gaithersburg,MD）评价凋亡。在96孔板 中培养细胞（8×10³/孔），在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中悬浮细胞，且在pH 7.4的PBS中的1%多聚甲醛中在4°C将细胞固定15分钟，接着通过预冷 却的乙醇/乙酸（2:1）在-20°C下固定5分钟。利用终端脱氧核苷酸转移酶 处理细胞，且在潮湿的腔室中在37°C下孵育1小时，然后利用加温的异 硫氰酸荧光素-结合的抗地高辛（antidigoxigenin）在室温下处理30分钟。 在洗涤之后，在含有1g/ml的碘化丙啶的培养基中制作样品，且通过免疫 荧光法分析细胞。

统计分析。以平均值±SD表示不同的实验进程的所有的数据。在适 当的情况下，通过具有Newmann-Keuls多重比较检验的ANOVA进行统计 分析。

2.4体外结果

2.4.1来源于HLSC的MV对HepG2肝瘤细胞系增殖的影响

发明人评价来源于HLSC的MV对HepG2增殖的影响。简要地，利 用原样或经RNA酶处理3天的不同剂量（10、20和30μg/ml）的HLSC 来源的MV孵育HepG2细胞。在孵育的最后，对HepG2培养物计数，或 在0.5M乙醇/HCl中固定，且利用核酸酶孵育以便消化DNA。利用抗-BrdU 过氧化物酶-结合的mAb探测掺入到DNA中的BrdU，且利用可溶解的发 色基质显现。利用ELISA读取器在405nm下测量光学密度。如图11显示 的，来源于HLSC的MV能够显著地抑制HepG2增殖。这也适用于RNA 酶处理的MV。

2.4.2来源于HLSC的MV对HepG2肝瘤细胞系凋亡的影响

评价HLSC来源的MV诱导HepG2凋亡的能力。简要地，以8,000 个细胞/孔的密度将HepG2接种到处在具有10%FCS的DMEM中的96孔 板中，且在没有FCS的情况下通过培养，通过利用长春新碱（100ng/ml）， 或多柔比星（50ng/ml），在癌症化学疗法中使用的两个有丝分裂抑制剂处 理，或通过MV处理（30μg/ml）诱导凋亡。作为对照，也利用1U/mlRNA 酶18（Ambion,Austin,TX）在37°C将MV处理1小时，以便评价对于癌 细胞生长的抑制的贡献是否依赖于通过MV传递给癌细胞的mRNA的横 向转移。在24和72小时下，利用TUNEL法分析评价凋亡。如图12显示 的，与通过长春新碱诱导的相比，来源于HLSC的MV能够诱导HepG2 凋亡。相反，RNA酶处理不能诱导凋亡。另外，如图13示出的，利用长 春新碱加MV-HLSC或多柔比星加MV-HLSC的HepG2的处理导致累加效 应（additive effect）。

2.5利用从HLSC分离的MV进行体内实验

细胞培养。在利用10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、和100μg/ml链 霉素补充的DMEM中培养人类肝瘤细胞HepG2，且维持在37°C下具有 5%CO₂的潮湿气氛的培养箱中。

在利用10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、和100μg/ml链霉素补充的 α-MEM/EBM(3:1)中培养人类肝干细胞（HLSC）。利用hEGF（人类上皮 生长因子）、氢化可的松（Hydrocortisone）、GA（庆大霉素）、BBE（脑牛 提取物）重新构建EBM。

来自HLSC的微泡(MV）的分离。从在利用2%胎牛血清补充的 α-MEM培养基中培养的HLSC的上清液中获得MV。以2,000g离心20分 钟以便去除碎片后，以100,000g在4°C下将无细胞的上清液离心1h，在 含有N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）25mM的无血清培养基199 中洗涤，且在相同的条件下经受第二次超速离心。在0.1%的DMSO中的 培养基199中悬浮MV粒料，且利用布拉德福德（Bradford）方法量化蛋 白质含量。

实验设计。从Charles River实验室获得雌性4至5个月大的SCID小 鼠。所有的小鼠都住在干净的设施中且保持1周，以便使其适应新环境。 在第0天，进行3×10⁶个HepG2肿瘤细胞的两次注射，其中所述肿瘤细胞 重悬在1:1的比率的具有基质膜基础膜基质的无血清的DMEM中。将细 胞悬浮液以0.2ml的总体积注入SCID小鼠的左腹股沟区域。将所有的小 鼠随机地分成三个治疗组：20μl肿瘤内（i.t.）MV注射（n＝3）；20μl i.t.PBS 注射（n＝2）和20μl i.t.MV-RNA酶处理的注射（n＝3）。在第7天，开始 后肿瘤细胞移植处理。从第7天时起肿瘤成为可觉察的；在肿瘤移植之后 7、12、14、和18天，注射悬浮在利用0.1%DMSO补充的M199中的50 或100μgMV。当肿瘤漂洗大约15mm³的体积时开始处理。每天监视动物 的行动和身体状态，且每隔3天做出体重的测定和肿瘤块的测量。

利用测径器测量肿瘤。通过测径器探测肿瘤块，在移植物的两个垂直 的直径中测量，且利用式1/2a x b²计算，其中a是长直径和b是短直径。 在第28天处死动物，且收集肿瘤用于进一步的分析。

形态学研究。在10%缓冲的中性福尔马林中固定肿瘤，常规地进行 处理，包埋在石蜡中，以5μm切割，且利用H&E染色，以便微观检查。 利用抗PCNA单克隆抗体进行用于增殖探测的免疫组织化学。封闭切片且 利用抗小鼠HRP二抗（1:300稀释）标记。省略初级抗体或利用非免疫的 小鼠IgG的取代用作对照。在石蜡包埋的肿瘤切片中通过TUNEL评价凋 亡。在630X放大倍率下计算十个非连续的切片的凋亡阳性的肿瘤细胞。 添加Hoechst 33258染料，用于核染色。

统计分析。以平均值±SD表示不同的实验进程的所有的数据。在适 当的情况下，通过具有Newmann-Keuls多重比较检验的ANOVA进行统计 分析。

2.6体内结果

2.6.1通过来源于SCID小鼠中肝细胞瘤异体移植模型中的HLSC的MV抑制肿瘤生长和增殖

为了确定来源于HLSC的MV对体内肿瘤生长的作用，利用人类肝 癌细胞系HepG2皮下植入SCID小鼠。在注射HepG2后的一周和两周， 当肿瘤体积是大约15mm³时，利用MV的肿瘤内注射（50或100μg），以 最大量20μl的体积治疗小鼠。在对照小鼠中，利用20μl单独的媒介物对 肿瘤注射。在HepG2注射的三周和四周之后，重获所有的肿瘤且进行分 析。在这种异体移植模型中，MV的肿瘤内注射（图14）显示对肿瘤生长 的抑制剂作用。另外，组织学分析显示利用MV治疗的肿瘤中坏死的区域 （图15B），和利用PCNA染色观察抗增殖作用（图15B）。

2.6.2通过来源于SCID小鼠中的肝细胞瘤异体移植模型中的HLSC的MV的凋亡的诱导

为了确定在肿瘤内凋亡中的作用，通过TUNEL分析来自利用MV治 疗的肿瘤的石蜡切片。与利用单独的媒介物处理的肿瘤相比，MV治疗诱 导凋亡（图15A）。

2.7来源于HLSC的MV对MCF-7乳腺癌和卡波西肉瘤（KS）细胞的体外生物学效应

2.7.1材料和方法

细胞培养。在利用10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉 素补充的α-MEM/EBM（3:1）中培养人类非卵肝干细胞（HLSC）。利用 hEGF（人上皮生长因子）、氢化可的松、GA（庆大霉素）、BBE（脑牛提 取物）重新构建EBM。

从American Type Culture Collection（Manassas,VA）获得MCF-7乳 腺癌细胞系，且在利用10%FCS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素补 充的DMEM中培养MCF-7乳腺癌细胞系，且维持在37°C下具有5%CO₂的潮湿的气氛的培养箱中。

从在免疫抑制力治疗下的具有肾异源移植的患者的皮肤伤口中获得 卡波西肉瘤细胞（KS细胞）的初级培养，且在利用10%FCS、100μg/ml 青霉素和100μg/ml链霉素补充的RPMI 1640培养基中培养。

MV的分离。从在利用2%胎牛血清（FBS）补充的MEM-α中培养 18个小时的HLSC的上清液中获得MV。在选择性的实验中，在没有FBS 存在的情况下收集MV。通过台盼蓝拒染法探测在2%的FBS和没有血清 时过夜孵育的细胞的生存能力（大于90%，数据没有显示）。在以2,000g 离心20分钟以便去除碎片后，以100,000g（Beckman Coulter Optima L-90K 超速离心机）在4°C将无细胞的上清液离心1h，在含有N-2-羟乙基哌嗪 -N′-2-乙磺酸（HEPES）25mM的无血清培养基199中洗涤，且在相同的 条件下进行第二次超速离心。在培养基199中悬浮MV粒料，且通过布拉 德福德方法量化蛋白质含量。将MV贮藏在-80°C。在利用碘化丙啶染色 之后，在MV悬浮液上进行形态学分析，不显示凋亡小体的存在。

RNA酶处理。在选择性实验中，利用1U/ml RNA酶在37°C下将来 自HLSC的MV处理1h。通过加入10U/ml的RNA酶抑制剂而终止反应， 且通过超速离心法洗涤MV。

细胞增殖。为了研究来源于HLSC的MV是否对来源于各种肿瘤的 细胞系发挥它们的抗肿瘤活性，将MCF-7乳腺癌细胞和卡波西肉瘤细胞 以8,000个细胞/孔接种到分别处于DMEM和RPMI中的96孔板中，具有 不同的MV浓度（2；10；15；和30μg/ml和30μg/ml RNA酶处理的MV）。 在培养48小时之后以将5-溴-2’-脱氧-尿苷（BrdU）掺入到细胞DNA中 的方式，探测DNA合成。然后利用0.5M乙醇/HCl固定细胞和利用核酸 酶孵育，以便消化DNA。利用抗BrdU过氧化物酶-结合的mAb探测到 DNA的BrdU掺入，且利用可溶解的发色基质显现。利用ELISA读取器 在405nm处测量光学密度。

凋亡实验。将MCF-7和KS细胞以8,000个细胞/孔接种到处于具有 10%FCS的低葡萄糖DMEM中且在存在多柔比星（100ng/ml）或不同浓 度的MV（2；10；15；和30μg/ml和30μg/ml的RNA酶处理的MV）的 96孔板中。利用TUNEL法评价凋亡。

2.7.2结果：来源于HLSC的MV抑制MCF-7细胞和KS细胞的体外增殖

与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用2、10、15和30μg/ml 的来源于HLSC-6B细胞的MV（图16和17），对MCF-7乳腺癌细胞和卡 波西肉瘤细胞孵育48小时显著地抑制细胞增殖。这些结果显示，组织固 有的干细胞的抗肿瘤作用并非特异性地对抗来源于相同组织的肿瘤。此 外，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用2、10、15和30μg/ml 的来源于HLSC-6B细胞的MV（图18），对MCF-7乳腺癌细胞和卡波西 肉瘤细胞孵育48小时可诱导凋亡，具有类似于多柔比星，一种化学治疗 药物的作用。这进一步证实，组织固有的干细胞的抗肿瘤作用并非特异性 地对抗来源于相同组织的肿瘤。