MAOA基因在肝癌治疗中的应用

摘要

本发明涉及肝癌治疗的新靶标以及单胺氧化酶（MAOA）基因在肝癌治疗中的应用。本发明发现MAOA基因在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织，提示干预MAOA基因表达可能成为肝癌治疗的新途径。为了验证这一设想，本发明构建了MAOA的慢病毒表达载体，并转染一株肝癌细胞，得到MAOA过表达的肝癌细胞株。在体外过表达MAOA可抑制去甲肾上腺素（NE）/肾上腺素（E）所诱导的肝癌侵袭转移和抗失巢凋亡；在体内过表达MAOA可显著减少肝癌细胞原位移植形成的病灶数并且减小肿瘤体积，并且显著抑制肝癌细胞的肺部转移。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及肝癌的治疗。

背景技术

单胺氧化酶A（monoamine oxidase A，以下简写为MAOA）是一种黄素蛋白 酶,存在于许多组织的细胞线粒体外膜上，催化单胺的氧化脱氨作用。MAOA除 了在神经元和星形神经胶质中表达以外，在肝脏、消化管道和胎盘中也有表达。 MAOA与神经递质分子之间有着密不可分的关系，它能使儿茶胺类神经递质（去 甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺等）失活，具有抗抑郁的作用^[1-2]。MAOA与人的 情绪和精神有密切关系，有资料表明MAOA基因启动子区的30bp-VNTR的多态性 可能使所编码的MAO的活性降低，不能充分降解外周组织中存在的5-羟色胺及 去甲肾上腺素（Noradrenaline，以下简写为NE），从而使两种递质在外周的浓 度升高，间接地增加人的冲动性和暴力犯罪倾向^[3]。此外MAOA的抑制剂1-异烟 酰-2-异丙基肼（iproniazid）、β-苯基异丙基肼（pheniprazine）等对MAOA 的活性有强烈的竞争性阻抑作用，经实验证明如果给动物，则可提高脑中 NE和5-羟色胺等单胺的浓度^[4]。

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上发生率和致死率较 高的恶性肿瘤之一，具有早期诊断难和复发转移率高的特点 [http://globocan.iarc.fr/]。HCC对于人类的健康危害巨大，我国每年死于肝癌约11 万人，占全世界肝癌死亡人数的45%^[5]。多项流行病学调查结果显示：精神压力 和忧郁对肿瘤发生、发展具有重要影响。这些流行病调查结果提示，神经系统， 尤其是神经递质及其受体可能在肿瘤的发生发展中起着重要的作用^[6-8]。

我们实验室的研究结果表明在人肝癌组织中，MAOA表达量显著下降， 目前国内外有关MAOA功能的相关报道主要是在神经系统中，而在癌症中的研究 则非常少，尤其是在肝癌中的作用尚无人报道。

发明内容

本发明的发明人发现，肝癌组织中单胺氧化酶A基因（MAOA）的表达， 显著低于周围的正常组织，提示干预MAOA基因表达可能成为肝癌治疗的新途径。 为了验证这一设想，本发明构建了表达MAOA的慢病毒载体，并转染肝癌细胞， 得到MAOA过表达的肝癌细胞株，用于评价MAOA过表达对肝癌细胞凋亡及侵袭转 移的影响。

本发明的第一方面，提供一种增强肝癌组织中单胺氧化酶A基因表达的化 合物的用途，用于制备治疗肝癌的药物。

所述的增强肝癌组织中单胺氧化酶A基因表达的化合物，可以是DNA、RNA、 蛋白质或其他有机、无机化合物，但是不包括单胺氧化酶A基因。对化合物的 来源及性质以及增强单胺氧化酶基因表达的机理无特别限制，只要能够增强肝癌 细胞中单胺氧化酶基因的表达即可。

本发明的第二方面，提供一种单胺氧化酶A基因的用途，用于制备治疗肝 癌的基因治疗的药物。所述的单胺氧化酶A基因与适合在人体内表达的载体相 连接，并导入患者肝组织病灶部位，增强肝癌组织中单胺氧化酶的表达。

所述的单胺氧化酶A基因可选自哺乳动物的单胺氧化酶A基因。优选地， 单胺氧化酶A基因选自人、牛、猪、大鼠、小鼠的单胺氧化酶A基因或其重组 体；更优选地，单胺氧化酶A基因为人的单胺氧化酶A基因；最优选地，单胺 氧化酶A基因具有SEQ NO.1的序列。

所述的适合在人体内表达的载体可选自逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病 毒载体或者非病毒载体；对表达载体没有特别限制，只要能够将单胺氧化酶A 基因导入肝癌细胞并表达单胺氧化酶A即可。优选地，所述的载体为慢病毒载 体。

本发明不拘泥于任何现有理论的限制。尽管单胺氧化酶A的功能研究主要 集中于神经系统，但本发明的研究者发现在人肝癌组织中，MAOA表达量显著 下降。我们构建了MAOA的过表达慢病毒载体，并选择MAOA表达背景低的肝癌 细胞（如SMMC-7721）作为目的细胞，用MAOA-慢病毒载体转染该目的细胞，筛 选得到过表达MAOA的SMMC-7721细胞，用于评价MAOA对肝癌细胞的影响。在体 外实验中，过表达MAOA可抑制去甲肾上腺素（NE）/肾上腺素（E）所诱导 的肝癌侵袭转移和抗失巢凋亡；在体内试验中，过表达MAOA可显著减少 SMMC-7721细胞原位移植形成的病灶数并且减小肿瘤体积；同样，过表达MAOA 也可以显著抑制静脉注射SMMC-7721细胞引起的肺部转移。综上所述，过表达 MAOA可抑制NE/E所诱导的肝癌侵袭转移和抗失巢凋亡，且过表达MAOA的 肝癌细胞在裸鼠体内侵袭转移能力也显著降低。以上结果说明上调肝癌组织 中MAOA基因的表达，可有效抑制肝癌的侵袭转移，有希望成为肝癌治疗的有效 靶标。

附图说明

图1.MAOA在肝癌组织中的表达量

a-c为肝癌组织200倍显微切片图

d-f为肝癌组织400倍显微切片图

其中图1d为图1a中方框部分的放大；图1e为1b中方框部分的放大；图 1f为1c中方框部分的放大。

图2.MAOA在肝癌癌旁组织中的表达量

g-i为癌旁组织200倍显微切片图

j-l为癌旁组织400倍显微切片图

其中图2j为图2g中方框部分的放大；图2k为2h中方框部分的放大；图 2l为2i中方框部分的放大。

图3.在肝癌组织、癌旁组织MAOA蛋白表达的Western blotting检测，共有 7对标本，T代表肝癌组织，N代表癌旁组织。MAOA代表单胺氧化酶，7对标本 中有6对肝癌组织较癌旁组织下调。G3PDH代表甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为对 照，在全部7对标本的肝癌组织和癌旁组织中没有明显差异。

图4.118对肝癌组织、癌旁组织标本MAOA差异表达的统计结果，肝癌组织 MAOA表达低于癌旁组织为下调，反之为上调。

图5.MAOA过表达SMMC-7721细胞失巢凋亡的流式细胞仪检测图。

5a为100nM的E处理SMMC-7721细胞的失巢凋亡的流式细胞仪检测结果；

5b为100nM的E处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的失巢凋亡的流式细胞 仪检测结果；

5c为100nM的NE处理SMMC-7721细胞的失巢凋亡的流式细胞仪检测结果；

5d为100nM的NE处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的失巢凋亡的流式细 胞仪检测结果。

图6.MAOA过表达SMMC-7721细胞失巢凋亡统计图。

6a为100nM的E处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的失巢凋亡统计图；

6b为100nM的NE处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的失巢凋亡统计图；

图7.MAOA过表达SMMC-7721细胞体外侵袭转移检测图。

7a为100nM的E处理SMMC-7721细胞的体外侵袭转移的检测结果；

7b为100nM的E处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的体外侵袭转移的检测 结果；

7c为100nM的NE处理SMMC-7721细胞的体外侵袭转移的结果；

7d为100nM的NE处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的体外侵袭转移的检测结 果。

图8.MAOA过表达SMMC-7721细胞体外侵袭转移统计图。

8a为100nM的E处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的体外侵袭转移统计图；

8b为100nM的NE处理MAOA过表达SMMC-7721细胞的体外侵袭转移统计 图；

图9.MAOA过表达SMMC-7721细胞裸鼠肝脏原位移植病灶检测图。

图10.MAOA过表达SMMC-7721细胞裸鼠肝脏原位移植病灶数统计图。

图11.MAOA过表达SMMC-7721细胞在裸鼠肝脏原位移植显微切片图:

a、对照组200倍显微切片图

b、MAOA过表达组200倍显微切片图

c、对照组400倍显微切片图

d、MAOA过表达组400倍显微切片图

其中图11c为图11a中方框部分的放大；图11d为图11b中方框部分的 放大。

图12.MAOA过表达SMMC-7721细胞在裸鼠肝脏原位移植显微切片病灶统计图。

图13.MAOA过表达SMMC-7721细胞在裸鼠静脉注射肺部转移显微切片图:

e、对照组200倍显微切片图

f、MAOA过表达组200倍显微切片图

g、对照组400倍显微切片图

h、MAOA过表达组400倍显微切片图

其中图13g为图13e中方框部分的放大；图13h为图13f中方框部分的 放大。

图14.MAOA过表达SMMC-7721细胞在裸鼠肺脏转移显微切片病灶统计图。

图15.慢病毒转移载体示意图。

图16.腺病毒表达载体构建示意图。

具体实施方式

生物标本和组织病理学研究

本发明收集了118位肝癌患者的肝癌组织标本和癌旁组织（正常组织）标本， 进行组织病理学研究。其中52对样本购自上海芯超生物科技有限公司，另外66 对样本由上海交通大学附属仁济医院提供。

本发明将肝癌组织和癌旁组织制成石蜡切片，采用单胺氧化酶（MAOA）特异 性抗体（一抗）、辣根过氧化物酶标记二抗（HRP-二抗）、二氨基联苯胺 （Diaminobenzidine,DAB）显色底物进行免疫染色。经免疫染色的成对标本切 片进行镜检，以癌旁组织切片为对照，肝癌组织切片染色较深者为高表达，较浅 者为低表达，进行组织病理学研究，并统计研究结果。

选取部分标本，采用单胺氧化酶（MAOA）特异性抗体（一抗）、辣根过氧化 物酶标记二抗（HRP-二抗）、二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）进行Western  blotting研究，用于和免疫组化结果进行验证。

MAOA基因

单胺氧化酶（Monoamine oxidase,MAO;E.C.1.4.3.4）是一类黄素蛋白酶，可 降解多种生物活性胺化合物，包括作为神经递质的去甲肾上腺素、多巴胺和5- 羟色胺。根据分子量、底物亲和力、抑制剂敏感性以及免疫特性的不同，单胺氧 化酶可以分为MAO-A、MAO-B两型，两种类型的酶在人体内具有不同的组织 特异性表达。在中枢神经系统，MAO-B主要在星型胶质细胞和5-羟色胺能神 经细胞中高水平表达，而MAO-A则主要在儿茶酚胺能神经细胞中高表达。在外 周组织中，在培养的皮肤成纤维母细胞和胎盘中检测到MAO-A的表达，而在血 小板和淋巴细胞中检测到MAO-A表达。

编码人MAO-A、MAO-B的基因定位于人X染色体p11.23-11.4区段(Ozelius  et al.1988;Lan et al.1989;Levy et al.1989)，Bach AWJ,et al报道了人MAO-A、 MAO-B全长cDNA克隆以及核酸和氨基酸序列，具体见Proc Natl Acad Sci USA 85:4934-4938(1988)。

其他哺乳动物的MAOA基因与人MAOA基因有很高的同源性，比如大鼠与 人之间MAOA基因有87.8%的同源性，小鼠与人之间有87.5%的同源性，猪与 人之间有88.6%的同源性，牛与人之间有88.0%的同源性等等。可以考虑将其他 动物的MAOA基因替换或者与人MAOA基因重组以用于本发明的基因治疗。

本发明采用人MAOA cDNA的完整编码区（开放阅读框）作为目的基因， 用于肝癌的基因治疗。序列参见Bach AWJ,et al,Proc Natl Acad Sci USA 85:4934-4938(1988)，以及序列表1。

表达载体

基因治疗的表达载体包括非病毒载体和病毒载体，其中病毒载体包括逆转录 病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体等。

慢病毒载体是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复 序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离而构建的载体系统，包括包装成分和 载体成分:包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作 用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;载体成分与包装成分互 补,含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，同时具有异源启动 子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

包装成分可分别构建在两个质粒上,即一个表达gag和pol、另一个表达 env，与载体质粒构成三质粒表达系统，具体参见Naldini L et al.Science, 1996;272:263，以及Kafri T et al.Nature Genet,1997;17:314的报 道。为了进一步降低同源重组形成有复制能力的病毒（RCV）的可能性,Dull et al等人将包装质粒中的辅助基因去除，将gag-pol的转运需要的rev构建到另 一个质粒上，构建成四质粒表达系统,具体参见J Virol,1998;72:8463-71 的公开。

本发明采用四质粒表达系统，转移载体pEZ-Lv105示意图见图15，包装质 粒为pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV-G，转移载体及包装质粒购于广州复能基因 有限公司。

除此之外，本发明也采用了腺病毒载体，构建了包含MAOA基因的腺病毒表 达载体，用于感染目的细胞，构建过程示意图见图16。

肝癌细胞及MAOA过表达肝癌细胞

SMMC-7721细胞是我国学者分离培养得到的原发性肝癌细胞株，参见董荣 春、周荣华等，SMMC-7721人体肝癌细胞株的建立及其生物学特性的初步观察， 第二军医大学学报，1980年01期，此后被广泛用于肿瘤癌生物学的研究。 SMMC-7721肝癌细胞株MAOA基因背景表达低，本发明将外源MAOA基因表达载体 导入SMMC-7721细胞，经筛选得到了过表达MAOA的SMMC-7721肝癌细胞株，用 于观察MAOA基因高表达对SMMC-7721细胞体外癌生物学特性以及体内成瘤、转 移等方面特性的影响。

肝癌组织标本和癌旁组织标本由上海芯超生物科技有限公司和上海交通大 学附属仁济医院提供。MAOA基因和慢病毒载体系统购自广州复能基因有限公司， 腺病毒载体系统购自上海吉凯基因化学技术有限公司，限制性内切酶及T4连接 酶购自NewEngland公司，293T细胞购于美国模式典型物收集中心（ATCC），上 述试剂和293T细胞用于目的基因、慢病毒载体的连接和重组慢病毒载体的包装。 目的细胞：肝癌细胞SMMC-7721细胞株由复旦大学附属中山医院提供。MAOA一 抗购自Protein tech公司，荧光二抗购自Biosciences公司，HRP二抗购自 Abmart公司，上述一抗和二抗用于免疫组化以及Western blotting检测MAOA 的表达量。real-time PCR试剂盒购自Takara公司；引物设计采用Primer 3软 件，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，MAOA real-time PCR 引物序列为：

Forward:5'-CCTTGACTGCCAAGATTCACTTC-3'

Reverse:5'-TGCACTTAATGACAGCTCCCAT-3'

上述PCR引物、试剂用于real-time PCR检测目的细胞转染后MAOA的表达 量。澳洲特级胎牛血清购自Gibco公司；高糖型DMEM和1640购自Gibco公司； 质脂体Lipofectamine^TMReagent购自Invitrogen公司；Transwell小室（内 径6.5mm，孔径8.0mm）购自Corning公司；Matrigel^TM购自Corning公司；其 余试剂均为国产分析纯。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件和分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring  Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的 条件。

实施例1．肝癌组织切片的免疫组化研究

标本来源

人肝癌组织、癌旁组织样本共118对，其中52对样本购自上海芯超生物科 技有限公司，另外66对样本由上海交通大学附属仁济医院提供。

免疫染色实验

上述肝癌组织、癌旁组织顺序编号，按常规方法制备石蜡切片。

将石蜡切片置于60℃烘片机上烘烤20分钟，然后按二甲苯（10min）x2 —1/2二甲苯（10min）—100%酒精（10min）x2—95%酒精（10min）—85%酒精 （10min）—75%酒精（10min）流程脱蜡。将脱蜡完毕的切片在流水中冲洗10 分钟，然后放置于0.01M柠檬酸钠缓冲液中在沸水浴中抗原复活10分钟。将切 片自然冷却至室温后，放置于37℃0.3%H₂O₂中去除内源过氧化物酶。用1xPBS 清洗一遍后用10%BSA室温封闭1小时，然后用1%BSA配置好的MAOA特异性一抗 4℃孵育过夜。第二天用1xPBS清洗3遍，用1%BSA配置的HRP二抗室温孵育1-2 小时。之后用1xPBS清洗3遍，用DAB显色液进行显色5-10秒。显色完毕后用 流水冲洗10分钟以上，然后再用苏木精染色1分半，在流水中冲洗5分钟。之 后按75%酒精（5min）—85%酒精（5min）—95%酒精（5min）—100%酒精（5min） x2—1/2二甲苯（5min）—二甲苯（5min）x2流程进行脱水。最后用中性树脂 封片。

结果

用显微镜观察肝癌组织样本中MAOA的表达的染色情况。以癌旁组织作为对 照，按照阳性反应的区域大小以及颜色的强弱将标本分组并进行统计。发现118 对标本中，大多数肝癌组织中MAOA表达显著下调（图1和2）。用Western  blotting检测7对标本到同样的结果，7对人肝癌组织蛋白中有6对MAOA表达 下调（图3）。经统计后发现，与癌旁组织相比70.6%的肝癌组织MAOA的表达量 都出现了下调（图4），23.5%保持不变，仅有5.9%出现了上调。

实施例2．MAOA基因-慢病毒表达载体的构建

MAOA基因-慢病毒转移载体的连接

MAOA基因合成、MAOA基因与慢病毒转移载体pEZ-Lv105的重组均由广州复 能基因有限公司完成，经重组的pEZ-Lv105-MAOA质粒由广州复能基因有限公司 提供。重组质粒pEZ-Lv105-MAOA中MAOA基因经测序鉴定，测序结果见序列表 SEQ.NO.1。

慢病毒包装

重组转移载体pEZ-Lv105-MAOA与慢病毒包装质粒pPACK-GAG、pPACK-REV 和pVSV-G按照1μg：5μg（包装质粒总量）的比例混合，加200μl无血清无 抗生素DMEM 11965培养液后室温孵育15分钟；同时将15μl Lipofectamine 2000^TM与200μl无血清无抗生素DMEM 11965培养液混合。然后将稀释的 Lipofectamine 2000^TM试剂缓慢滴注于慢病毒质粒混合液中，室温孵育15分钟。 之后将准备好的慢病毒质粒混合液加入无血清无抗生素的HEK293T细胞中，待8 小时后更换为10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素的DMEM 11965培养液。病 毒液分别在24/48/72小时等时间点收集，3000rpm/5min离心，并用0.22μm无 菌滤器过滤，共收获每个时间点的病毒液2ml，经检测滴度为1x10⁶IU，储藏于 -80℃冰箱中备用。

目的细胞转染

肝癌细胞SMMC-7721细胞培养到60%-70%密度后，加入6μg/μl的 polybrene（购自Millipore公司）进行预处理，然后将500μl收集好的病毒液 加入目的细胞中。12小时后撤去含有polybrene的培养液，更换为正常DMEM 11965培养液。待目的细胞第二个倍数生长期来到后加5μg/ml嘌呤霉素进行初 步筛选，并观察目的细胞的生长状态，并采用Western blotting或real-time PCR 检测MAOA的表达量。

单克隆细胞筛选

将待挑选目的细胞计数，按照10⁶/ml—10⁶/100μl—1/100μl的梯度稀释到 理论上每100μl DMEM 11965培养液中仅含1个细胞，并以每孔100μl的量接 种到96孔板中，在显微镜下观察并标记出仅有1个细胞的孔。待细胞贴壁后进 一步加以观察验证，确保单克隆细胞的准确性。培养2周后，将标记好的单克隆 细胞消化下来并接种到24孔板中，按24孔板-6孔板-6cm培养皿-10cm培养 皿的顺序进行扩增。期间采用1μg/ml浓度的嘌呤霉素进行维持筛选，并用 Western blotting检测单克隆细胞的MAOA阳性表达率。共筛选到3株高表达MAOA 的SMMC-7721细胞，储藏于液氮中备用。

实施例3．肝癌细胞失巢凋亡实验

为检测NE/E降解酶MAOA是否能够抑制NE/E所诱导的肝癌细胞变化，采用 流式细胞检测NE/E作用48h后MAOA过表达SMMC-7721细胞失巢凋亡的变化。将 用95%乙醇以20mg/ml浓度配置的poly-HEMA（购自Sigma公司）溶液按每孔800 μl的量加入12孔板中，在超净台中晾干过夜。然后将目的细胞按10⁶/ml接种 于12孔板中，并分别加入100nM的NE/E，处理48h后用流式细胞仪进行凋亡检 测。结果显示MAOA过表达加E处理组细胞失巢凋亡比例与对照（SMMC-7721细 胞）加E组相比明显增加（P＝0.007）；另外MAOA过表达加NE处理组细胞失巢凋 亡比例也明显增加（P＝0.011）（图5和6）。

实施例4．肝癌细胞侵袭转移实验

将matrigel（-20℃保存）置于4℃融化，同时将24孔板、Transwell小 室、200μl枪头置于4℃预冷。然后将matrigel以1:4比例稀释于无血清DMEM 11965培养液中，在24孔板中的Transwell小室中各加100μl 1:4的matrigel， 置于37℃凝固2小时以上。以上各步骤均在冰上进行。之后消化目的细胞并计 数，将5x10⁴细胞置于Transwell小室中，在小室下面的孔内各加500μl DMEM 11965培养液（含5%FBS、1%双抗），并分别加入100nM的NE/E，置于37℃培养。 在48h后观察目的细胞的胶穿状态，并终止目的细胞侵袭，吸去Transwell小室 中的matrigel后加600μl戊二醛进行固定。30分钟后吸去戊二醛并加600μl 结晶紫进行染色。30分钟后吸去结晶紫，用600μl 1xPBS清洗2-3次，最后上 显微镜观察。结果发现MAOA过表达加E组侵袭细胞数明显减少（P＜0.001）；另 外MAOA过表达加NE组侵袭细胞数也明显减少（P＜0.001）（图7和8）。以上结 果表明MAOA过表达可以抑制NE/E所诱导的肝癌细胞侵袭和抗失巢凋亡。

实施例5．动物体内实验

为了进一步验证MAOA在肝癌侵袭转移中的作用，采用裸鼠肝原位移植、静 脉注射模型来观察MAOA过表达SMMC-7721细胞在肝内（近端）、肺部（远端）的 转移情况。

肝原位移植实验

肝原位移植是取2x10⁶个对照或过表达组肝癌细胞重悬于40μl DMEM/matrigel 1:1的混合液中，将裸鼠深度麻醉后开腹，用微量进样针将细胞 接种于肝左叶上，然后缝合皮肤。6周后深度麻醉裸鼠，开腹观察肝癌细胞在裸 鼠肝内的侵袭转移情况，心脏取血后将肝脏标本置于10%福尔马林中，固定1-2 天后修剪标本并进行组织脱水[75%酒精（2h）—85%酒精（2h）—95%酒精（2h） —100%酒精（2h）x2—二甲苯（2h）x3—石蜡（2h）x2]、包埋和切片。肝原 位移植实验的结果显示7个MAOA过表达细胞移植鼠肝原位病灶和转移病灶数目 ≤1，病灶总数≤2，瘤体直径≤0.4cm；而7个对照细胞移植鼠肝原位灶数目最 多达到4个，转移灶数目最多达到5个，病灶总数最多达到7个，瘤体直径最大 达到了0.8cm。经统计后发现MAOA过表达组病灶数明显少于对照组（P＝0.021） （图9和10）。

HE染色实验

HE染色采用以下流程：将石蜡切片置于60℃烘片机上烘烤20分钟，然后 按二甲苯（10min）x2—1/2二甲苯（10min）—100%酒精（10min）x2—95%酒 精（10min）—85%酒精（10min）—75%酒精（10min）流程脱蜡。将脱蜡完毕的 切片在流水中冲洗10分钟，然后用苏木精染色1分半，在流水中冲洗5分钟， 再用伊红染色20秒，之后在流水中冲洗不超过5秒。之后按75%酒精（5min） —85%酒精（5min）—95%酒精（5min）—100%酒精（5min）x2—1/2二甲苯（5min） —二甲苯（5min）x2流程进行脱水。最后用中性树脂封片，用显微镜观察MAOA 过表达SMMC-7721细胞在肝内的转移情况。我们的结果发现在肝内MAOA过表达 组转移灶很少，明显低于对照组（图11和12）。

静脉注射实验

静脉注射实验是取1x10⁶个对照或过表达组肝癌细胞重悬于100μl DMEM 中，用1ml注射器将细胞沿尾静脉注射到裸鼠体内。6周后深度麻醉裸鼠，开腹 观察肝癌细胞在裸鼠肺部的侵袭转移情况，心脏取血后将肺脏标本置于10%福尔 马林中，固定1-2天后修剪标本按肝原位移植实验处理步骤进行组织脱水-包埋- 切片-HE染色。结果在肺部MAOA过表达组中没有发现转移灶，明显低于对照组 （图13和14）。

以上结果明确显示了过表达MAOA可有效抑制肝癌细胞在生物体内的近端 （肝内）或远端（肺部）侵袭转移。这也进一步印证了前面细胞实验中的结果， 确定了MAOA对于肝癌侵袭转移的抑制作用。

实施例6．MAOA基因-腺病毒表达载体的构建及评价

MAOA基因序列同实施例1,腺病毒载体见图16，购于上海吉凯基因化学技 术有限公司。具体操作步骤为：可利用Cre-loxP特异性位点基因重组技术构建 MAOA的重组腺病毒。采用高保真PCR得到MAOA，将其克隆到质粒 pCR-BluntⅡ-TOPO中，然后将目的基因片段连接到中间载体质粒pDNR-CMV中， 进行测序，随后在Cre重组酶的作用下，将MAOA cDNA转移到腺病毒载体 pLP-Adeno-X-CMV上。之后在HEK293T细胞中扩增重组腺病毒，经PCR法和限制 性内切酶消化法证实了MAOA重组腺病毒的成功构建。

培养转染的HEK293T细胞，分别在24/48/72小时等时间点收集病毒液， 3000rpm/5min离心，并用0.22μm无菌滤器过滤，共收获每个时间点的病毒液 2ml，经检测滴度为1x10⁶IU，储藏于-80℃冰箱中备用。

肝癌细胞SMMC-7721细胞培养到60%-70%密度后，用上面的重组腺病毒对其 进行转染，RT-PCR和Western blotting检测证实该重组腺病毒显著性增强了 SMMC-7721细胞中MAOA的mRNA和蛋白表达水平。

采用MAOA-腺病毒载体转染的MAOA高表达肝癌细胞SMMC-7721，按照实施例 2、3和4中的步骤进行体外、体内评价，得到类似结果。

[参考文献]

[1]Whibley A,Urquhart J,Dore J,Willatt L,Parkin G，Gaunt L,Black G，Donnai D, Raymond FL.Deletion of MAOA and MAOB in a male patient causes severe  developmental delay，intermittent hypotonia and stereotypical hand movements.Eur J Hum Genet.2010;18(10):1095-1099.

[2]Antoni MH,Lutgendorf SK,Cole S W，Dhabhar FS,Sephton SE,McDonald PG， Stefanek M,Sood AK.The influence of bio-behavioural factors on tumour biology: pathways and mechanisms.Nat Rev Cancer.2006;6(3):240-248.

[3]刘华锋，刘丽丽，于婷，刘晓岚，李波，方芳，王继萍，刘娅.单胺氧化酶 A基因多态性与暴力行为的关联性分析.中华行为医学与脑科学杂志. 2009;18(11):1001-1003.

[4]Horita A.The influence of drug-tissue interactions on the inhibition of monoamine  oxidase by pheniprazine and iproniazid.J Pharmacol Exp Ther.1963;142:141-146.

[5]Parkin DM.Global cancer statistics in the year 2000.Lancet Oncol. 2001;2(9):533-543.

[6]Lang K,Bastian P.Neurotransmitter effects on tumor cells and leukocytes.Prog  Exp Tumor Res.2007;39:99-121.(Review)

[7]Cao L,Liu X,Lin EJ,Wang C,Choi EY,Riban V,Lin B,During MJ. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes  cancer remission and inhibition.Cell.2010;142(1):52-64

[8]Sood AK,Armaiz-Pena GN,Halder J,Nick AM,Stone RL,Hu W，Carroll AR, Spannuth WA,Deavers M T,Allen JK,Han LY，Kamat AA,Shahzad MM,McIntyre  BW，Diaz-Montero CM,Jennings NB,Lin YG，Merritt WM,DeGeest K,Vivas-Mejia PE,Lopez-Berestein G，Schaller MD,Cole SW，Lutgendorf SK.Adrenergic  modulation of focal adhesion kinase protects human ovarian cancer cells from anoikis. J Clin Invest.2010;120(5):1515-1523.