一株产生物表面活性剂的酵母菌株及其应用

摘要

本发明公开了一株产生物表面活性剂的鲑色锁掷酵母菌株Sporidiobolussalmonicolor AH3，其微生物保藏号是CGMCC No.4814。本发明酵母菌株能够以C

说明书

技术领域

本发明涉及环境生物领域中的酵母菌及其应用，特别涉及一株产表面活性剂的 酵母及其在采油废水处理中的应用，属于酵母菌株领域。

背景技术

含油废水主要来源于石油、石油化工、钢铁、焦化、煤气发生站、机械加工等 工业部门，其中所含的油类物质包括天然石油、石油产品、焦油及其分馏物， 以及食用动植物油和脂肪类等。这些工业部门生产过程中所产生的含油废水如 果不加以回收，会造成极大地资源浪费；如果不加处理而直接排入河流、湖泊 或海湾，会污染水体，含油废水中的疏水性有机物会在水体表面形成油膜，使水 中溶解氧急剧下降，从而影响水生生物生存；如果直接用于农业灌溉，这些疏水 性有机物进入土壤后会严重影响土壤的透气性和渗水性，堵塞土壤空隙，妨碍农 作物生长；此外，含油废水中的多环芳烃具生物毒性和致畸作用，可通过各种渠 道(如食物链)进入人体，直接对人们的身体健康构成威胁。

含油废水中由于存在大量的疏水性有机物，易在水中形成油层、油珠，不易于 被细菌摄取，利用常规的活性污泥方法直接处理存在一定的难度。为了提高疏水性 有机物在水中的溶解度并促进其被生物降解，通常采用表面活性剂来减少污水张力， 增加疏水性有机物的溶解。目前较常用的表面活性剂如Tween 80等对于环境中生物 具有一定的毒性，也具有一定的持久性，容易造成二次污染。同时，国内对于高含 油废水的生物处理往往由于污水前期化学处理过程中酸碱中和产生大量的盐，使得 生物处理反应器中的活性污泥经常处于活性抑制状态，所以处理效果不理想。

生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分 泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物 等。它们不仅具有化学表面活性剂具有的各种表面性能，而且还具有选择性广， 对环境友好；其庞大而复杂的化学结构使得表面活性和乳化能力更强；分子结 构类型多样，具有许多特殊的官能团，专一性强；原料在自然界广泛存在且价 廉；绿色环保等优点。但生物表面活性剂是一些低分子量的小分子，它们形成 的乳状液往往不能稳定存在。生物乳化剂是属于生物表面活性剂的一些生物大 分子，如多糖蛋白、脂多糖。或这些聚合物的混合体等，它们虽不能显著降低 表面张力，但对油水界面表现出很强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面， 防止油滴凝聚，从而使这种乳状液得以稳定，这种效应使得烷烃呈胶状分散， 增加了烷烃与细胞的接触。因此一般的生物表面活性剂的主要作用是降低油水 界面张力而乳化原油，而生物乳化剂的主要作用是稳定乳化原油，降低原油粘 度，更能提高微生物对烃的摄取和降解效率。

酵母菌属真菌，具有耐酸、耐高盐、耐高渗透压以及代谢效率高等特点。目前， 已有研究发现酵母菌对某些难降解物质及有机的有毒物质具有较强的分解能力，并 且在降解强疏水性物质如多环芳烃上，相对于其它微生物具有较强的优势。如日本 于70年代进行了酵母菌利用废水的探索性研究，并于90年代成功开发了酵母菌废 水处理技术。目前该技术已经被应用到油脂加工、海产加工、食品加工以及制酱等 行业的废水处理中。

因此，从环境中筛选具有较好的降解疏水性有机物以及产生表面活性剂能力的 酵母菌对处理含油废水具有重要的意义，利用产生乳化剂的酵母菌株来处理高含油 废水也具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种产表面活性剂的酵 母菌株及其应用，本发明筛选到的酵母菌株能够产生表面活性剂，并能够以C10-C24 烷烃和/或多环芳烃为碳源进行生长，并对这些疏水性有机物具有良好的降解作用， 在采油废水处理方面具有良好的应用前景。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种酵母菌鲑色锁掷酵母Sporidiobolus salmonicolor AH3。

本发明所提供的酵母菌株已于2011年4月28日保藏于“中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心”，其分类命名为：Sporidiobolus salmonicolor AH3，保 藏号为CGMCC No.4814。保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研 究所。

该菌株从河北冀东油田采油场油井周围的原油污染土壤中采用富集培养、平板 稀释法分离、纯化得到。

其中，富集培养基为基本培养基中添加菲溶液0.2％，调节pH值为5-6，培养 基在121℃下恒温灭菌20分钟得到，其中所述的基本培养基组成如下：

(NH₄)₂SO₄1g，K₂HPO₄0.8g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g， FeSO₄·7H₂O 5mg，1mL过滤除菌的维他命溶液，纯净水1000mL，pH 5-6。

特别是，所述维他命溶液的组成如下：烟酸100mg，维生素B1 100mg，生物素 5mg，对氨基苯甲酸50mg，维生素B12 1mg，泛酸钙50mg，维生素B6 50mg，微 生素M 50mg，3Na EDTA 200mg，超纯水稀释至100mL。

特别是，所述的菲溶液的组成为：1g菲，1L正己烷。

其中，分离纯化培养基为基本培养基中添加菲溶液0.2％，琼脂2％，pH值为5-6， 培养基在121℃下恒温灭菌20分钟得到，其中所述的基本培养基组成如下：

(NH₄)₂SO₄1g，K₂HPO₄0.8g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g， FeSO₄·7H₂O 5mg，1mL过滤除菌的维他命溶液，纯净水1,000mL，pH 5-6。

菌株Sporidiobolus salmonicolor AH3有以下特征：

1、菌落形态学特征为：在YPD固体培养基上培养2天的菌落直径大小为5-6mm， 菌落呈圆形，表面粗糙，边缘不整齐，突出，粉红色。

2、细胞形态学特征为：细胞形状为椭圆，成熟细胞长轴为7-8um，短轴为3-4um。

3、26S rDNA基因序列特征为：菌株Sporidiobolus salmonicolor AH3的26S rDNA 序列长度为561bp。

本发明另一方面提供一种利用鲑色锁掷酵母Sporidiobolus salmonicolor AH3生 产表面活性剂的方法，包括将鲑色锁掷酵母菌株接种于培养基中，振荡培养，获得 表面活性剂，其中，所述培养基为烷烃的培养基或含有多环芳烃的混合培养基。

其中，所述烷烃培养基选择含C₁₀-C₂₄烷烃中的一种或多种的培养基。

特别是，所述烷烃培养基选择十六烷烃培养基，所述十六烷烃培养基组成如下： 十六烷烃8g，KH₂PO₄ 1g，(NH4)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g， 纯净水1,000mL，pH 5-6。

其中，所述含多环芳烃的混合培养基选择含萘混合培养基或含菲混培养基。

特别是，所述含萘混合培养基的组成如下：十六烷烃8g，萘100mg，KH₂PO₄ 1g， (NH4)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，纯净水1000mL，pH 5-6。

特别是，所述含菲混合培养基的组成如下：十六烷烃8g，菲20mg，KH₂PO₄ 1g， (NH4)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，纯净水1000mL，pH 5-6。

其中，所述振荡培养是在以下条件下进行：黑暗条件，培养温度为25-27℃，转 速150-170rpm，震荡培养时间为72-168h。

特别是，所述振荡培养条件为：黑暗条件，培养温度为25-27℃，转速150rpm， 震荡培养时间为96-168h。

特别是，所述将鲑色锁掷酵母菌株接种于培养基包括如下步骤：首先，将酵母 菌株Sporidiobolus salmonicolor AH3接种于萘培养基中，25-27℃，150rpm培养至培 养液的OD₆₀₀值达到0.4-0.6，获得Sporidiobolus salmonicolor AH3菌的接种母液，然 后将接种母液与培养基混合均匀。

其中，所述的萘培养基组成如下：萘100mg，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，纯净水1,000mL，pH 5-6，培养基在121℃下 恒温灭菌20分钟。

特别是，将所述鲑色锁掷酵母菌株接种于萘培养基的过程中，每100ml萘培养 基中接种一接种环的鲑色锁掷酵母菌株。

其中，酵母菌S.salmonicolor AH3的接种母液的用量为每100毫升培养基中接 种0.1-1ml所述接种母液。

本发明又一方面提供一种鲑色锁掷酵母菌株Sporidiobolus salmonicolor AH3在 降解疏水性有机物中的应用。

将所述鲑色锁掷酵母菌株接种于含有疏水性有机物的污染物中，进行酵母菌培 养。

其中，所述培养温度为25-27℃。

本发明再一方面提供一种利用酵母菌株S.salmonicolor AH3降解疏水性有机污 染物的方法，包括将菌株S.salmonicolor AH3接种于疏水性有机污染物中，混合均 匀，进行酵母菌培养。

其中，所述的酵母菌培养的培养温度为25-27℃。

本发明又一方面提供一种鲑色锁掷酵母菌株Sporidiobolus salmonicolor AH3在 净化处理油田废水中的应用。

其中，所述在净化处理油田废水中的应用是向油田废水中加入所述鲑色锁掷酵 母菌株，搅拌均匀，处理20-24小时。

特别是，首先将鲑色锁掷酵母菌株接种于葡萄糖-萘培养基中，25-27℃，150rpm 培养至培养液的OD₆₀₀值达到0.4-0.6，获得处理油田废水的菌株接种母液，然后将接 种母液与油田废水混合均匀。

其中，所述葡萄糖-萘培养基组成如下：灭菌纯净水1L，葡萄糖10g，萘100mg， KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，pH 5-6，培养 基在121℃下恒温灭菌20分钟。

特别是，将所述鲑色锁掷酵母菌株接种于葡萄糖-萘培养基的过程中，每100ml 葡萄糖-萘培养基中接种一接种环的鲑色锁掷酵母菌株。

特别是，油田废水菌株接种母液的用量为每100毫升油田废水中接种5-15ml所 述接种母液，优选为10ml所述接种母液。

本发明的酵母菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814是一株具有极高活力， 对疏水性有机污染物降解能力极强的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变 异，可以用于生产表面活性剂和降解疏水性有机污染物，尤其适用于石油、石油化 工、钢铁、焦化、煤气发生站、机械加工等工业部门产生的含有废水的降解处理， 在降解含有疏水性有机污染物废水方面具有工业化应用的前景。

附图说明

图1是酵母菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814细胞形态图；

图2是酵母菌株S.salmonicolorAH3在十六烷烃培养基中培养时的生长曲线图；

图3是酵母菌株S.salmonicolor AH3在萘培养基中培养时的生长曲线图；

图4是酵母菌株S.salmonicolor AH3在菲培养基中培养时对菲的降解曲线图。

具体实施例方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分 比浓度，所有培养基中的溶剂均为纯净水。

实施例1酵母菌株的分离及纯化

1、培养基制备

(1)基本培养基：

(NH₄)₂SO₄1g，K₂HPO₄0.8g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g， FeSO₄·7H₂O 5mg，1mL过滤除菌的维他命溶液，纯净水1,000mL，pH 5-6，培养 基在121℃下恒温灭菌20分钟。

维他命溶液的组成如下：烟酸100mg，维生素B1 100mg，生物素5mg，对氨基 苯甲酸50mg，维生素B12 1mg，泛酸钙50mg，维生素B650mg，微生素M 50mg， 3Na EDTA 200mg，灭菌纯净水稀释至100mL。

(2)富集培养基：

基本培养基中添加菲溶液0.2％，调节pH值为5-6，培养基在121℃下恒温灭菌 20分钟；其中菲溶液组成为：1g菲，1L正己烷。

(3)分离、纯化培养基：

基本培养基中添加菲溶液0.2％，琼脂2％，调节pH值为5-6，培养基在121℃ 下恒温灭菌20分钟；其中菲溶液组成为：1g菲，1L正己烷。

平板分离、纯化培养基：将分离、纯化培养基煮好后趁热装于500ml的三角瓶 中，用牛皮纸封口后于121℃高压灭菌20mim。灭菌后趁热移至无菌超净工作台， 分装于60cm×1.3cm的平皿中，装液量为13ml，将平板水平摆放，待培养基冷却 后备用。

斜面分离、纯化培养基：将分离、纯化培养基煮好后趁热分装于5ml的离心管 中，装液量为1.8ml，装于离心管架上，于121℃高压灭菌20mim，灭菌后将离心 管架倾斜摆放使培养基成一斜面备用。

(4)十六烷烃培养基：

十六烷烃8g，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g， 纯净水1000mL，pH 5-6，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟；

(5)萘培养基：

萘100mg，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g， 纯净水1000mL，pH 5-6，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟；

(6)菲培养基：

菲20mg，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g， 纯净水1000mL，pH 5-6，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟；

(7)含萘混合培养基：

灭菌纯净水1L，十六烷烃8g，萘100mg，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，调节pH 5-6，培养基在121℃下恒温灭菌20 分钟。

(8)含菲混合培养基：

灭菌纯净水1L，十六烷烃8g，菲20mg，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，调节pH 5-6，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。

(9)YPD培养基：

酵母浸粉5g，牛肉膏蛋白胨10g，葡萄糖10g，去离子水1L，pH 5.0。培养 基使用前在115℃下灭菌20分钟。

(10)YPD固体培养基：

酵母浸粉5g，牛肉膏蛋白胨10g，葡萄糖10g，去离子水1L，固体培养基则 加入2％的琼脂，pH 5.0。培养基使用前在115℃下灭菌20分钟。

(11)葡萄糖-萘培养基：

灭菌纯净水1L，葡萄糖10g，萘100mg，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，酵母提取物0.5g，调节pH 5-6，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。

2、富集培养

称取1g采集于河北冀东油田采油场油井周围的原油污染土壤，加入10ml灭菌水， 制成悬浮液，接着加入富集培养基，于27℃，150rpm振荡，进行富集培养，直至得 到OD₆₀₀为0.5的富集培养液。

3、分离、纯化培养

将富集培养液在平板分离、纯化培养基上划线分离培养，放入恒温培养箱中于 27℃下培养至平板上长出单个菌落，挑取形成的单个菌落，划线接种于斜面分离、 纯化培养基中，于27℃进行培养，对斜面培养物进行显微镜检查，如果获得的斜面 培养物菌种不纯，则挑取斜面培养物划线接种于斜面分离、纯化培养基中继续纯化， 直到显微镜检查结果表明为纯菌为止；经纯化得到纯酵母菌菌株。

实施例2酵母菌株的微生物学特性研究

1、菌落形态观察

将纯化培养得到的酵母菌菌株划线接种于YPD固体培养基中，于27℃下培养至 长出菌落，观察菌落形态，结果如下：

菌株的菌落特征为：在YPD平板上培养2天的菌落直径大小为5-6mm，菌落呈 圆形，表面粗糙，边缘不整齐，突出，粉红色。

2、细胞形态观察

将菌株接种于YPD培养基中，在27℃，150rpm下培养3天后，用显微镜观察培 养液中菌株的细胞形态，观察结果如图1所示，酵母菌的细胞为椭圆形，成熟细胞 的长轴为7-8um，短轴为3-4um。

3、26S rDNA基因序列测定

将酵母菌接种于YPD培养基中，于27℃，150rpm培养8小时后，离心收集酵母菌 细胞，用生理盐水重新悬浮后，反复冻融，加玻璃珠震荡破壁，用酚-氯仿法提取DNA， 采用正向引物NL1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和反向引物 NL4(5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)对菌株的26S rDNA进行PCR扩增，将扩 增产物进行测序；其中，PCR反应体系为50μL。反应混合液包括：3ng模板DNA， 10pmol引物，2.5units Taq酶，10×PCR缓冲液(包含2.5mM MgCl2)，10nmol DNTP和适量的双蒸水。PCR条件为：95℃，10min；94℃，1min，55℃，1min，72℃， 1min；30个循环，72℃，10min，4℃保存；

测序结果见序列表，其中，菌株的26S rDNA(SEQ ID NO.1)序列长度为561bp。

根据菌株的菌落形态特征，细胞形态特征以及其26S rDNA基因序列的比对结 果，鉴定菌株属于Sporidiobolus salmonicolor。

酵母菌菌株已于2011年4月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心”，其菌株名称为鲑色锁掷酵母Sporidiobolus salmonicolor AH3，在“中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”的保藏编号为CGMCC No.4814。

实施例3鲑色锁掷酵母菌株S.salmonicolor AH3的培养

1)配制酵母菌株S.salmonicolor AH3的接种母液

取酵母菌株S.salmonicolor AH3的新鲜斜面菌种，接种于萘培养基中，萘为酵母 菌株S.salmonicolor AH3生长的唯一碳源，27℃，150rpm进行培养，并测定培养液 的OD₆₀₀值，直到OD₆₀₀值达到0.5，获得S.salmonicolor AH3菌的接种母液，其中， 每100ml萘培养基中接种一接种环的S.salmonicolor AH3菌种。

2)十六烷烃培养基培养

将菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814的接种母液接种于十六烷烃培养基 中，其中，接种量为1％(v/v)，即接种母液与十六烷烃培养基的体积之比为1∶100， 然后在黑暗条件下，于27℃，150rpm进行培养，每6小时测定培养液的OD₆₀₀值， 测定48小时，测定结果如附图2示。

测定结果表明：菌株S.salmonicolor AH3在接种后12-36h为对数生长期，菌株 快速生长，在培养30h后，培养液的OD600即达到1.8左右，在培养36h后菌株生长 速度趋于平缓，达到生长稳定期。菌株S.salmonicolor AH3在十六烷烃培养基生长 状态良好，能够有效利用十六烷烃作为其生长的碳源进行生长。

3)萘培养基培养

将菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814的接种母液接种于萘培养基中，其 中，接种量为0.1％(v/v)，即接种母液与萘培养基的体积之比为0.1∶100，然后在 黑暗条件下，于27℃，150rpm进行培养，每天定时测定培养液的OD₆₀₀值，测定7 天，测定结果如附图3示。

测定结果表明：菌株S.salmonicolor AH3在接种于萘培养基后3-7天为对数生 长期，菌株快速生长，且生长良好，在第7天时培养液的OD₆₀₀可以达到0.5左右。

4)菲培养基培养

将菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814的接种母液接种于菲培养基中，其 中，接种量为0.1％(v/v)，即接种母液与菲培养基的体积之比为0.1∶100，然后在 黑暗条件下，于27℃，150rpm进行培养，每天定时测定培养液中菲的残留率，测定 7天，测定结果如附图4示。

测定结果表明：菌株S.salmonicolor AH3能够利用菲作为唯一碳源进行生长， 菌株培养7天可以使培养基中的菲含量降至35％，说明菌株S.salmonicolorAH3对底 物菲具有良好的降解作用。

实施例4菌株S.salmonicolor AH3产生物表面活性剂试验

1、配制酵母菌株S.salmonicolor AH3的接种母液

取酵母菌株S.salmonicolor AH3的新鲜斜面菌种，接种于萘培养基中，萘为酵母 菌株S.salmonicolor AH3生长的唯一碳源，27℃，150rpm进行培养，并测定培养液 的OD₆₀₀值，直到OD₆₀₀值达到0.5，获得S.salmonicolor AH3菌的接种母液，其中， 每100ml萘培养基中接种一接种环的S.salmonicolor AH3菌种。

2、以十六烷烃培养基的产表面活性剂试验

将菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814的接种母液接种于十六烷烃培养基 中，其中，接种量为1％(v/v)，即接种母液与十六烷烃培养基的体积之比为1∶100， 在黑暗条件下，于27℃，150rpm的条件下进行培养，得到含有表面活性剂的培养液。

1)采用表面张力仪测定接种前培养基和培养24小时、96小时后的培养液的表 面张力，测定结果如表1所示。

2)测定培养液的乳化能力：在室温25℃下，将培养96小时后的4mL培养液与 1mL十六烷烃在振荡器上振荡2min后，静置10min，测定水相中OD₅₄₀值，其中，将 每毫升溶液的吸光度值(OD₅₄₀值)1定义为一个乳化能力单位(EU mL^-1)。培养 液乳化能力的测定结果如表1所示。

3)采用GC-MASS方法测定培养前各培养基和培养24小时、96小时后培养液 中十六烷烃的浓度，测定结果见表1。

3、以含萘混合培养基、含菲混合培养基培养的产生物表面活性剂试验

将菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814的接种培养液接种于含萘混合培养基、 含菲混合培养基中，在黑暗条件下，于27℃，150rpm的条件下进行培养，得到两种 培养液；其中，接种量为为0.1％(v/v)，即接种母液分别与含萘混合培养基、含菲 混合培养基的体积之比为0.1∶100。

1)采用表面张力仪测定接种前培养基和培养4天后的培养液的表面张力，测定 结果如表2所示。

2)测定培养液的乳化能力：在室温25℃下，将培养4天后的两种培养液各4mL 分别与1mL十六烷烃在振荡器上振荡2min后，静置10min，测定水相中OD₅₄₀值，其 中，将每毫升溶液的吸光度值(OD₅₄₀值)1定义为一个乳化能力单位(EU mL^-1)。 测定结果如表2、3所示。

3)采用GC-MASS方法测定培养前各培养基和培养4天后的两种培养液中十六 烷烃、萘、菲的浓度，测定结果见表4。

表1菌株以十六烷为培养基时产表面活性剂试验结果

  培养液   十六烷烃含量(％)   0小时培养基表面张力(mN m^-1)   65.6±3.9   0.8   24h培养基表面张力(mN m^-1)   46.7±0.4   0.55   96h培养基表面张力(mN m^-1)   36.2±2.4   0.02   乳化能力(EU mL^-1)   0.23   /

表2菌株以含萘混合培养基的产表面活性剂试验结果

  培养时间   表面张力(mN m^-1)   乳化能力(EU mL^-1)   0小时   65.6±3.9   0.05   4天   48.4±0.4   0.82   7天   38.6±0.2   1.34

表3菌株以含菲混合培养基的产表面活性剂试验结果

  培养时间   表面张力(mN m^-1)   乳化能力(EU mL^-1)   0小时   65.6±3.9   0.05   4天   47.2±0.4   0.78   7天   37.2±0.2   1.25

表4培养基、培养液中组分含量

由表1、2、3、4的试验结果可知：

1、本发明酵母菌株S.salmonicolor AH3以十六烷烃、萘、菲为碳源，培养发酵生产 生物表面活性剂，能显著降低培养液的表面张力，增强培养液的乳化能力；

2、本发明菌株S.salmonicolor AH3以十六烷烃和多环芳烃(萘或菲)同时为碳源， 培养发酵生产的生物表面活性剂具有较强的乳化能力，发酵培养7天后培养液的 乳化能力达到1.34EU/ml以上。

3、本发明酵母菌株S.salmonicolor AH3以十六烷烃和多环芳烃(萘或菲)同时为 碳源时，能够迅速利用十六烷烃作为生长的碳源，快速去除十六烷烃，对培养基 中的疏水性有机物具有明显程度的降解作用，尤其是能够降解烷烃和多环芳烃。

4、本发明酵母菌株S.salmonicolor AH3以十六烷烃和多环芳烃(萘或菲)同时为 碳源，产生的生物表面活性剂的乳化能力强，对大分子疏水性有机物具有显著的 乳化作用，培养液的表面张力降低，培养液的乳化能力增加。

5、本发明酵母菌株S.salmonicolor AH3以十六烷烃和多环芳烃(萘或菲)同时为 碳源时，多环芳烃在培养基中的降解速度增加，培养四天后，萘的去除率达到 90％，菲的去除率达到80％，快于以多环芳烃(萘或菲)为唯一碳源时的降解速 度，说明菌株S.salmonicolor AH3CGMCC No.4814产生的生物表面活性剂促进 了多环芳烃的降解速度，表明菌株菌株P.guilliermondii AH2CGMCC No.2.4174 可用于降解多环芳烃类有机污染物。

实施例5利用酵母菌株S.salmonicolor AH3处理采油废水

采油废水为河北冀东油田的采油废水，废水水质指标见表4。

取酵母菌株S.salmonicolor AH3的新鲜斜面菌种，接种于葡萄糖-萘培养基中， 27℃，150rpm进行培养，其中，每100ml葡萄糖-萘培养基中接种一接种环的S. salmonicolor AH3菌种，培养3天，获得用于处理采油废水的酵母菌S.salmonicolor AH3的接种母液，每100ml接种母液中酵母菌的质量约为0.4g。

采用序批式反应器(SBR)对采油废水进行生物处理，其中，序批式反应器容 积为1.5L，向序批式反应器(SBR)中投加初始活性污泥(3.5g/L)、用于处理采 油废水的酵母菌S.salmonicolor AH3的接种母液(100ml/L)和塑料球状载体(用 于增加酵母菌的沉淀性能)，其中，反应器每天处理1L废水，废水在反应器内处理 22h之后，再静置沉淀2小时，然后排放出水。对采油废水、处理后的出水水质进 行检测，其中按照国家环境保护总局2002年出版的《水和废水检测分析方法(第四 版)》，检测出水的CODcr、NH₄⁺-N值；采用GC-MASS方法测定出水中屈、苯并芘、 芴、苊烯的浓度，检测结果见表4。

表4酵母菌株处理采油废水的水质指标

表2结果表明：

1、采用本发明酵母菌株S.salmonicolor AH3对采油废水进行处理后，废水中 有机污染物的含量大大降低，处理出水COD的去除率达到77.8％以上，NH₄⁺-N的 去除率为100％；

2、本发明酵母菌株S.salmonicolor AH3对采油废水中的疏水性有机物具有显 著的降解作用，其中，对屈的去除率达到98.2％，对苯并(a)芘的去除率达到95.2％。 出水中未检测到芴、苊烯，其浓度低于检测线(1-3ngL^-1)。