在脱乙酰壳多糖藻酸盐水凝胶小珠中的细胞培养

摘要

本发明涉及一种生产包含软骨形成细胞的水凝胶基质的方法，其中藻酸盐、脱乙酰壳多糖和软骨形成细胞混合并且随后聚合成小珠。

说明书

发明领域

本发明涉及用于培养软骨形成细胞、更具体地是软骨细胞的支架(scaffold)。本发明还涉及用于植入的细胞化的小珠。本发明还涉及用于软骨修复的方法和工具。

发明背景

数十年以来，分离的和增殖的软骨形成细胞已经用于植入。然而，为获得足量的细胞而进行的体外增殖可能导致这样的细胞，其在植入时导致细胞死亡、瘢痕组织或过度分化的细胞。对于软骨修复尤其如此，其中软骨细胞培养物在植入时通常产生纤维性或骨骼样物质而不是预期的透明软骨。

已经尝试在其中模拟软骨的细胞外基质的三维基质中培养软骨细胞。已经使用了多种凝胶，在其中培养细胞。例如，现有技术公开了具有藻酸盐核和脱乙酰壳多糖涂层的小珠(Babister等(2008)Biomaterials(生物材料)29，58-65)。

制备水凝胶小珠的方法可以分成三组。第一种类型涉及为细胞所居住的多孔基质。此处，所述基质具有大的孔径大小以允许细胞迁移到基质中。Li等(2008)J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)A.86，552-559记述了一种包含2.4％藻酸盐/2.4％脱乙酰壳多糖的多孔支架，其随后接种有细胞。

由于细胞由基质外部迁移到内部，这些基质通常在外部具有许多细胞而在内部具有少量细胞。

在第二种类型的方法中，将细胞与基质的组分混合，然后形成基质。Bernstein等(2009)Biotechnol.Prog.(生物技术进展)25，1146-1152记述了一些方法，其中形成具有2.5％藻酸盐和1.4％脱乙酰壳多糖的小珠。其中的软骨被描述为是低质量的。

在第三种方法中，如在WO2007/135114中所示例的，将细胞包封在凝胶化溶液中，所述凝胶化溶液获得自多糖如藻酸盐和多分支的脱乙酰壳多糖的寡糖衍生物的混合物的水溶液。利用胶凝剂将所述水溶液凝胶化以包封所述细胞。

在每种类型的方法中，水凝胶的选择对细胞表型具有很大影响，并且随后对植入物的质量具有很大影响。特别地，在WO2007/135114的水凝胶中，脱乙酰壳多糖的寡糖衍生物具有至少40％的衍生度，并且多糖混合物或藻酸盐混合物具有的离子强度并非最适于保持细胞存活。此外，这种3D基质不能保持软骨细胞表型稳定，如由细胞增殖增加和聚集蛋白聚糖合成减少所示。

对基质材料的选择和生产细胞化的植入物的方法的进一步改进存在需求。

发明概述

本发明的一个方面涉及生产包含软骨形成细胞的水凝胶基质的方法，所述方法包括下述步骤：

-提供藻酸盐溶液，

-提供具有低于60kD的Mw的脱乙酰壳多糖的溶液，

-将所述藻酸盐溶液和所述脱乙酰壳多糖溶液与软骨形成细胞混合，其中所述混合溶液包含0.5-0.7％(w/v)的脱乙酰壳多糖和1-1.4％(w/v)的藻酸盐，

-将所述混合溶液的液滴引入到具有Ca²⁺或Sr²⁺阳离子的溶液中，和

-从所述具有阳离子的溶液分离凝胶化的小珠。

在本发明方法的特定实施方案中，将混合溶液的液滴引入到Sr²⁺离子溶液中。

在该方法的具体实施方案中，所述混合溶液包含0.6％的脱乙酰壳多糖和或包含1.2％的藻酸盐。

在本发明方法的具体实施方案中，所述混合溶液中藻酸盐与脱乙酰壳多糖之间的比率是1.4-2.8，或1.75-2.25或约为2。

在本发明方法的具体实施方案中，所述脱乙酰壳多糖具有35-45kD的Mw和/或是动物来源的，或优选是植物来源的。

在本发明方法的其他具体实施方案中，所述方法进一步包括在培养基中培养包含软骨形成细胞的小珠的步骤。所述培养可以进行达7天、14天、21天或甚至28天。

在本发明方法的其他具体实施方案中，所述培养基包含血清。

在本发明方法的其他具体实施方案中，小珠的形成通过使液滴经过针来进行，从而得到直径为约0.2-5mm的颗粒。

在本发明方法的其他具体实施方案中，所述方法进一步包括将所述培养的小珠混合在热敏性水凝胶中的步骤。此处，小珠和水凝胶之间的比率，例如为5/1-1/1，或4/1-2/1。

本发明的另一个方面涉及球形水凝胶小珠，其包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的均质混合物，并且还包含软骨形成细胞，其中所述小珠可以通过上述方法得到。

本发明的另一个方面涉及直径为0.01-5mm的球形水凝胶小珠，其包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的均质混合物，并且在基质内还包含软骨形成细胞，所述球形水凝胶小珠的特征在于所述小珠包含1-1.4％的藻酸盐和0.5-0.7％的脱乙酰壳多糖，例如，所述小珠包含1.2％的藻酸盐，或例如，所述小珠包含0.6％的脱乙酰壳多糖。

在本发明小珠的具体实施方案中，藻酸盐/脱乙酰壳多糖的比率为1.4-2.8，或1.75-2.25，或1.8-2.2。

在本发明小珠的其他具体实施方案中，所述脱乙酰壳多糖具有35-45kD的Mw。

在本发明小珠的其他具体实施方案中，所述软骨形成细胞的浓度为50000或60000至100000或150000个细胞/小珠。

在本发明小珠的其他具体实施方案中，当在血清存在下生长时，所述软骨形成细胞在培养21天后表达低于0.5pg的乳酸脱氢酶(LDH)，或者，所述软骨形成细胞在培养21天后表达的碱性磷酸酶低于0.02单位/ngLDH。

本发明的另一个方面涉及包含在所述或如上所述生产的小珠中的软骨形成细胞在修复软骨缺陷(如骨关节炎(osteoarthritis))中的用途。

本发明的另一个方面涉及包含在所述或如上所述生产的小珠中的软骨形成细胞在制备用于修复软骨缺陷的药物中的用途。

如在本发明中制备的小珠的优点及其用途：

在现有技术的软骨移植方法中，从来自正常软骨区域的软骨活组织切片收集少量的自体软骨细胞，然后进行单层培养增殖直到得到最适于移植的细胞数目。当以单层对它们进行培养时，软骨细胞逐渐失去其表型，并且对于软骨胞外基质是无能为力的，并且变成主要产生瘢痕组织的成纤维细胞。为了避免这种去分化进程或为了在单层培养后促进细胞再分化，可以将软骨细胞在三维基质(如藻酸盐小珠)中培养。然而，在藻酸盐小珠中，软骨细胞进行肥大性分化(hypertrophic differentiation)并且使周围基质矿物化。肥大性分化和基质矿物化是与骨关节炎相关的不理想的效果。本发明证明，与在藻酸盐小珠中培养的软骨细胞对比，在脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠中培养的软骨细胞不分化成肥大软骨细胞。按照本发明使用的小珠稳定软骨细胞表型。事实上，与在藻酸盐小珠中培养的软骨细胞相比，在血清(例如10％FBS)存在下(其是支持软骨细胞肥大性分化的条件)培养数周后，在脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠中培养21至28天的软骨细胞产生最低量的作为肥大的特异性标记的碱性磷酸酶(AP)(图4)。

与在藻酸盐小珠中的软骨细胞相比，在脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠中培养的软骨细胞产生显著更高量的软骨特异性分子聚集蛋白聚糖，和显著更少的促炎症因子(IL-6，一氧化氮)和分解代谢因子(溶基质蛋白酶-1(stromelysine-1))。本发明所述的脱乙酰壳多糖/藻酸盐混合物防止软骨细胞的肥大性分化，如由碱性磷酸酶表达的减少所示。

这种特别的作用表明脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠是用于细胞移植、特别是修复组织(包括软骨缺陷)的潜在载体。

附图简述

图1显示藻酸盐小珠(A)和脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠(B)的截面[脱乙酰壳多糖：深灰色小梁(trabeculae)；藻酸盐：浅灰色背景]。

图2以低放大率显示(A)包埋在脱乙酰壳多糖水凝胶中的脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠。在更高的放大率(B)，软骨细胞是可见的(箭头所示)。

图3显示白介素-6(Il-6)在不同时间点的表达(表示为纳克IL-6/每ng乳酸脱氢酶)。图3A，左侧条柱：在藻酸钙中培养的细胞；中间条柱：在脱乙酰壳多糖(20kD)/藻酸钙小珠中培养的细胞；右侧条柱：在脱乙酰壳多糖(40kD)/藻酸钙小珠中培养的细胞。(脱乙酰壳多糖/藻酸盐比率为1/2)。图3B显示使用Ca²⁺、Sr²⁺或Ca²⁺和Sr²⁺的混合物在藻酸盐(左)或脱乙酰壳多糖/藻酸盐(右)小珠中培养9天后软骨细胞中的IL-6产量。

图4显示在不同培养基[ITS：包含胰岛素、运铁蛋白和亚硒酸的培养基；UG：Ultroser G；FBS：胎牛血清)中在藻酸盐小珠(闭合的(closed)条柱)和在0.6％脱乙酰壳多糖/1.2％藻酸盐小珠(开启的(open)条柱)[脱乙酰壳多糖40kD]中碱性磷酸酶(AP)的表达。(AP浓度表示为单位的碱性磷酸酶/每ng乳酸脱氢酶)

A图显示培养21天后的值。图B显示培养28天后的值。

图5显示聚集蛋白聚糖的表达(表示为纳克聚集蛋白聚糖/每ng乳酸脱氢酶)。图5A显示在藻酸盐小珠(左)、脱乙酰壳多糖(20kD)/藻酸盐小珠(中)和脱乙酰壳多糖(40kD)/藻酸盐小珠(脱乙酰壳多糖/藻酸盐比率为1/2)中培养13天后的表达。图5B显示使用Ca²⁺、Sr²⁺或Ca²⁺和Sr²⁺的混合物在藻酸盐(左)或脱乙酰壳多糖/藻酸盐(右)小珠中培养9天后软骨细胞中聚集蛋白聚糖的产量。CM：结合细胞的基质；FRM：进一步去除的基质*(Further-Removed matrix*)；

图6显示MMP-3在不同时间点的表达(表示为纳克MMP-3/每ng乳酸脱氢酶)。左侧条柱：在藻酸钙中培养的细胞；中间条柱：在脱乙酰壳多糖(20kD)/藻酸钙小珠中培养的细胞；右侧条柱：在脱乙酰壳多糖(40kD)/藻酸钙小珠中培养的细胞。(脱乙酰壳多糖/藻酸盐比率为1/2)。

图7显示包含0.6％脱乙酰壳多糖/1.2％藻酸盐小珠的热敏性脱乙酰壳多糖水凝胶(双孢蘑菇(A.bisporus)脱乙酰壳多糖(40kD))的植入。

图8显示植入15天后对植入物的组织学评估。

A：软骨下骨；B：细胞群集的(Cell-colonized)的水凝胶；C：细胞群集的脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠；D：包埋在脱乙酰壳多糖空隙(lacunae)中的细胞。

发明详述

本发明的一个方面涉及生产包含软骨形成细胞的水凝胶基质的方法。在该方法中，当形成所述水凝胶基质时，细胞包含在凝胶组分中。该方法包括下述步骤：

-提供藻酸盐溶液，

-提供Mw低于60kD的脱乙酰壳多糖的溶液，

-将所述藻酸盐溶液和所述脱乙酰壳多糖溶液与软骨形成细胞混合，其中所述混合溶液包含0.5-0.7％(w/v)的脱乙酰壳多糖和1-1.4％藻酸盐，

-将所述混合溶液的液滴引入到具有Ca²⁺或Sr²⁺离子的溶液中，和

-从所述具有阳离子的溶液分离凝胶化的小珠。

通过该方法得到的水凝胶导致藻酸钙和脱乙酰壳多糖的均质基质，其中细胞平均分布在整个基质中。

如在本发明中得到的基质与现有技术的基质不同，现有技术的基质具有一种成分的核，并由另一种成分的层包被。

与首先被冻干以获得一定的孔隙度的基质相比，如在本发明中得到的基质具有优点：该基质的孔隙度可以被更准确地确定。

如在本发明中得到的基质具有优点，即，由低分子量的脱乙酰壳多糖(低于60kDA)组成，其在藻酸盐基质中自发形成均质网络。

如在本发明中得到的基质(其中在胶凝时细胞包含在所述基质中)具有这样的优点，即，细胞均匀分布于基质小珠上。之后接种有细胞的多孔小珠典型地将产生细胞梯度，由此该基质的内部核心包含的细胞比小珠的外壳包含的细胞少。这通常导致这样的细胞群体：其中在核心的细胞具有与在外部的细胞不同的特性。

如在实施例部分所示，用于制备水凝胶的藻酸盐和脱乙酰壳多糖溶解在具有杀菌作用的强的碱性或酸性缓冲液中。这是本发明另外的优点。

在根据本发明的方法中，可以将藻酸盐和脱乙酰壳多糖溶液混合以获得具有不同浓度的小珠。本发明的具体实施方案涉及这样的小珠，其中，在通过钙离子或锶离子凝胶化前，组合物包含0.4、0.45、0.5、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80％(w/v)的脱乙酰壳多糖，并且独立于其地包含0.9、0.95、0.1、0.105、0.11、0.115、0.12、0.125、0.13、0.135、0.14、0.145或1.5％(w/v)的藻酸盐。在具体实施方案中，脱乙酰壳多糖的浓度范围在0.5-0.7％，或0.55-0.65％。在其他具体实施方案中，藻酸盐的浓度范围在1.至1,4％或1,25至1,35％。水凝胶的具体实施方案包含约0.6％的脱乙酰壳多糖和约1.2％的藻酸盐。

本发明的方法和组合物的其他实施方案涉及水凝胶组合物和其所得到的小珠，其中藻酸盐与脱乙酰壳多糖在混合溶液中的比率为1.4-2.8，更特别为1.5-2.7，更特别为1.6-2.6，或1.75-2.25。该比率的具体值为约1.9、1.95、2.0、2.05和1。

在本发明的方法中，小珠的平均尺寸可以调整并且通过调节用于形成被引入到钙或锶溶液中的液滴的针的直径而凭经验确定。本文预期直径为0.01-5mm的小珠。这些尺寸在操作容易性与营养物扩散到小珠中之间提供折衷。

本发明的实验表明，脱乙酰壳多糖的物理特性可以有助于形成软骨的软骨细胞的表型。脱乙酰壳多糖已经分离自不同的动物来源，如甲壳类动物(crustaceans)(对虾壳)或乌贼类动物。备选地，脱乙酰壳多糖可以是植物来源的，更特别是真菌来源的，如毛霉目(Mucoralean)菌株，总状毛霉(Mucor racemosus)和雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)，卵形孢球托霉(Gongronella butleri)，黑曲霉(Aspergillus niger)，稻根霉菌(Rhizopusoryzae)，香菇(Lentinus edodes)，凤尾菇(Pleurotus sajo-caju)，鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)，白色念珠菌(Candida albicans)或双孢蘑菇(Agaricus bisporus)。

脱乙酰壳多糖还以多种类型的分子量存在。此处，脱乙酰壳多糖的链长可以对水凝胶的三维结构起作用。用于本发明的典型的脱乙酰壳多糖具有小于60kD的平均分子量，特别是15-50kD、更特别是35-45kD的平均分子量。

按照本发明生产的小珠包含软骨形成细胞，并且对其进行培养以得到所需量的细胞用于进一步的目的，诸如植入。培养时间可以取决于特定因素，如细胞类型和在小珠中的初始浓度。

本发明的小珠与软骨细胞、软骨细胞前体、形成软骨的充质干细胞或形成软骨的干细胞或与软骨细胞和形成软骨的前体或干细胞的混合物一起制备。

已经发现新鲜分离的软骨细胞可以在本发明的小珠中培养7天、14天、21天或28天或甚至更久，同时保持其在植入时产生透明软骨的特性。

当分析软骨细胞稳定性的标记物时，对于其他上述细胞类型的适当的培养时间经实验确定，这在本发明的实施例部分有描述。

本发明的脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠允许在被描述为对软骨细胞培养有害的条件下培养细胞，更具体地，允许软骨细胞在包含5、10、15％(血清体积/培养基体积)胎儿或成体动物血清的培养基中生长，并且克服用于软骨细胞培养的专用合成培养基的使用。

如上所述的制备小珠的方法导致形成球形水凝胶小珠，所述球形水凝胶小珠包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的均质混合物，并且进一步包含均匀分布在小珠基质中的软骨形成细胞。

与其他类型的细胞化的小珠相比，本发明的小珠可以比通过冻干来提供用于细胞进入和培养的空腔的小珠更可重现的方式制备。

在根据本发明方法制备的小珠中培养的细胞的优越特性表现为：细胞死亡标记物如乳酸脱氢酶(LDH)的有限表达，炎症标记物如白介素的有限表达，骨骼形成细胞的典型标记物如碱性磷酸酶的有限表达，和软骨标记物如聚集蛋白聚糖的增加的表达(图5)。与评估软骨细胞的表型稳定性相关的标记物的表达已经通过在血清存在下在本发明的脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠中以及在藻酸盐小珠中培养细胞而实验性确定。

已经进一步观察到，已经用于凝胶化的阳离子的类型至少对聚集蛋白聚糖和白介素-6的表达有影响。此处，使用锶而不是钙使得IL-6(炎症标记物)的表达以及聚集蛋白聚糖(ECM产生的标记物)的表达减少。

考虑到在如本发明制备的小珠中生长的软骨形成细胞的令人惊讶的特性，本发明的一个方面涉及包含在如本发明制备的小珠中的软骨形成细胞在治疗软骨缺陷(更具体地骨关节炎)中的用途。

取决于软骨缺陷的类型，小珠可以在小珠形成后立即植入，以使细胞主要在植入后生长。备选地，小珠在体外培养数天或数周后植入。

在具体的实施方案中，将具有软骨细胞的小珠配制为由小珠和凝胶形成的两相植入物材料。该植入物包括聚合基质(“水凝胶”)和包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐和细胞的球形三维小珠。

这允许配制可注射的凝胶，其在植入时确保细胞(软骨细胞或其他)在宿主组织或器官中的最佳空间分布。此处典型地使用的可注射的凝胶是热敏性凝胶。这些凝胶在环境温度(在用于引入到患者中的装置中)保持液态，但是当引入身体时在约37℃变成固体凝胶。这种原位凝胶化使小珠(及其中的细胞)保持其空间分布。体外测试已经证明，当加热至37℃时，包含细胞的小珠均匀分布在这样的水凝胶中。热敏性水凝胶的实例包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。其一种具体的类型是脱乙酰壳多糖。

不受理论限制，据信在微珠内的脱乙酰壳多糖网络赋予小珠特定的机械特性，以使它们与仅由藻酸盐制成的小珠相比更不可压缩且更抗压。本发明的基质提供在藻酸盐凝胶内的相互连接的脱乙酰壳多糖小梁(trabeculae)，其通过提供中性pH的水性介质而产生有利于细胞培养的环境。

这样的小梁由不溶性脱乙酰壳多糖得到，所述不溶性脱乙酰壳多糖在与藻酸盐混合时形成团聚体，所述团聚体产生篮状结构网络或小梁。小梁的厚度和长度可变，并且为小珠提供特定的生物学特性和机械特性，如表型稳定性、可变形性、弹性和压缩模量。

实施例

实施例1.分离软骨细胞

软骨片段通过活组织切片收集，然后进行三次连续的酶处理(透明质酸酶0.5mg/ml在37℃30min；链霉蛋白酶1mg/ml在37℃1小时；胶原酶0.5mg/ml在1％Ultroser G的存在下在37℃1夜)以去除细胞外基质。(Ultroser G是Pall公司(Pall Corporation)的血清替代品)。在细胞滤网上通过后，将软骨细胞漂洗并离心。收集细胞沉淀并且悬浮在脱乙酰壳多糖/藻酸盐溶液中。

实施例2.制备藻酸盐/脱乙酰壳多糖小珠

由脱乙酰壳多糖(最终为0.6％)和藻酸盐(最终为1.2％)的均质混合物制备小珠。在混合之前，分别制备这两种溶液。藻酸盐和脱乙酰壳多糖溶液以下述方式制备：制备在0.16M NaOH中的2.4％(W/v)的藻酸盐溶液和在1.666M HAc中的1.333％(w/v)的脱乙酰壳多糖溶液。向10体积的藻酸盐溶液中，加入1体积的1M Hepes溶液。均质化后，逐渐加入9体积的脱乙酰壳多糖溶液，同时规律且剧烈搅拌。

然后，施加软骨细胞的细胞沉淀并且以6×10⁶个细胞/ml的浓度小心分散在脱乙酰壳多糖/藻酸盐溶液中。

将具有细胞的脱乙酰壳多糖/藻酸盐溶液缓慢通过25号(25gauges)针，以逐滴的方式加入到102mM CaCl₂溶液(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇)，Bornem，比利时)中。在瞬时凝胶化后，允许小珠在该CaCl₂溶液中进一步凝胶化10分钟。在凝胶化的小珠中，软骨细胞以均匀的方式分布。在微观尺度，脱乙酰壳多糖(被曙红染成红色)形成由不同厚度和长度的小梁或纤维组成的篮状结构(见图1和2)。此处的间隙由包含软骨细胞的藻酸盐(被苏木精染为紫色)填充。

实施例3.在藻酸盐/脱乙酰壳多糖小珠中培养软骨细胞

将包含软骨细胞的凝胶化的小珠用盐水溶液洗涤。通过将10个小珠提供在1ml培养基[补充了1％ITS+(ICN Biomedicals，Asse-Relegem，比利时)，10mM HEPES，青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)，200μg/ml谷氨酰胺(Biowhittaker Europe，Verviers，比利时)，50μg/ml抗坏血酸(Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)，Bornem，比利时)，2mM脯氨酸(Gibco，Merelbeke，比利时)的DMEM]中而在24孔板中培养小珠。(ITS+是预混合的细胞生长系统，1ml中包括：0.625mg胰岛素，0.625mg运铁蛋白，0.625μg亚硒酸，0.125g牛血清清蛋白和0.535mg亚油酸)。

实施例4.软骨细胞的表征

在图2B中，软骨细胞用苏木精/曙红染色。

聚集蛋白聚糖和IL-6用ELISA定量。(Biosource Europe)碱性磷酸酶用分光光度法测定定量。简言之，将50μl细胞提取物与100μl对-硝基苯基磷酸酯(KEM-EN-TEC，Kobenhavn，丹麦)一起孵育。在AP的存在下，将p-NPP转化为对-硝基苯酚和无机磷酸盐。在405nm测量对硝基苯酚的吸光度。对硝基苯酚的标准制剂用来校正。结果表示为每分钟和每μgDNA释放的对硝基苯酚的纳摩尔数。一单位AP定义为每分钟释放一纳摩尔对硝基苯酚。

乳酸脱氢酶通过检测其在培养物上清中的酶活性而定量。将100μl上清或标准溶液(来自兔肌肉的LDH)的稀释液与50μl含800mM乳酸盐的Tris缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.1％BSA)混合。加入100μl比色试剂(1，6mg/ml碘硝基氯化四唑(iodonitrotetrazolium chloride)(Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)，Bornem，比利时)，4mg/ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Roche Diagnostics(罗氏诊断)，Brussels，比利时)，0.4mg/ml吩嗪硫酸甲脂(Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)，Bornem，比利时))，并且在于室温温育10分钟后读取492nm处的吸光度。

这些数据显示在本发明的基质中培养的软骨细胞表现出多种优越特性：

-与藻酸盐小珠相比，在脱乙酰壳多糖/藻酸盐中培养的细胞表现出更少的凋亡或坏死，如通过测量乳酸脱氢酶所示。

-在脱乙酰壳多糖/藻酸盐中培养的细胞表现出较少的炎症迹象。

在脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠中培养的软骨细胞不产生或产生非常少量的IL-6、IL-8和NO。图3显示与藻酸盐小珠相比，在混合的小珠(藻酸盐/脱乙酰壳多糖)中培养软骨细胞过程中IL-6产量的显著减少。

IL-1β是炎症反应和相关的组织蛋白水解中非常活跃的细胞因子。在藻酸盐/脱乙酰壳多糖小珠中IL-1β对炎症介质或蛋白水解酶的产生的刺激作用不如在藻酸盐小珠中的重要。

-与在藻酸盐小珠中培养的软骨细胞相比，在脱乙酰壳多糖/藻酸盐中培养的软骨细胞表现出更少的分解代谢事件的迹象，如通过基质金属蛋白酶MMP-3的更低的产量所示，基质金属蛋白酶MMP-3参与软骨基质降解。

-软骨细胞在脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠中的生长对软骨细胞表型具有有利的和稳定作用。

实施例5.配制在热敏性水凝胶中的小珠

通过抽吸而去除培养基，并且将小珠与植物(双孢蘑菇)脱乙酰壳多糖水凝胶(Kitozyme，Alleur，比利时)混合。该步骤在低于27℃进行，以避免水凝胶凝胶化。使用3/1(v/v)的小珠/水凝胶比率。

实施例6.阳离子对软骨细胞表型的影响

图3B和5B显示用于水凝胶形成的阳离子的选择的影响。尽管钙或锶的选择对标记物白介素-6和聚集蛋白聚糖在完全由藻酸盐组成的小珠中的表达没有影响，但是，当脱乙酰壳多糖/藻酸盐与钙或锶离子一起形成时，观察到显著的影响。

实施例7.在动物模型中植入

将如在实施例5中所述的无软骨细胞的凝胶植入到兔关节的软骨缺陷中(图7)。植入15天后，评价该植入物(图8)。损伤保持被该植入物填充。此外，观察到植入物群集有来源于下面的骨髓的细胞。细胞汇集(encountered)在固定的热敏性脱乙酰壳多糖水凝胶(B)以及在脱乙酰壳多糖藻酸盐小珠(C)中(脱乙酰壳多糖小梁显示为D)。该测试证实两相植入物能够容易地操作和植入。植入物的生物可降解性质确保植入后的逐渐吸收。

实施例8.脱乙酰壳多糖分子量对小珠形成的影响

在本发明的方法中已经使用了不同分子量的天然脱乙酰壳多糖。测量混合溶液(与软骨细胞一起的)的不同物理参数如pH和粘度。按照本领域公知的技术测量所得到的水凝胶的渗透性。

表1

我们推论出混合的小珠可以用低于55kDa的天然脱乙酰壳多糖制成。例如，在91kDA时，小珠不能用本发明所述的方法制成，并且在藻酸盐1.2％与脱乙酰壳多糖0.6％的比率下，脱乙酰壳多糖溶液粘性过大。因此，脱乙酰壳多糖分子量的选择是本发明的基本要素。

实施例9.脱乙酰壳多糖分子量对软骨细胞行为的影响

分子量对软骨细胞行为的影响如在图3A、5A和6中所示。脱乙酰壳多糖40kDa对MMP-3、IL-6和聚集蛋白聚糖的作用显著不同于用20kDa的脱乙酰壳多糖获得的作用。脱乙酰壳多糖20kDa不如40kDa脱乙酰壳多糖对IL-6和MMP-3合成有效，但是比40kDa脱乙酰壳多糖对聚集蛋白聚糖合成更有效。这清楚地证明天然脱乙酰壳多糖的生物学活性直接取决于分子量。