用于控制秋粘虫和欧洲玉米螟的杀虫蛋白组合和用于昆虫抗性管理的方法

摘要

本发明部分地涉及将某些Cry基因与Cry 1Fa混杂(stacking)，从而使所得产物更加持久并且使引发昆虫对该产物中任一毒素(例如Cry1Fa)的活性产生抗性的倾向性更低。Cry1F混杂对的实例包括Cry2Aa、Cry 1I和Cry1E。这些混杂可用于如本文所述地控制FAW和/或ECB。

说明书

背景

人类种植作物用于食物和能源应用。昆虫吃掉并毁坏谷物植物从而破坏了人类的努力。造成谷物的主要破坏的农业害虫是秋粘虫(FAW，Spodopterafrugiperda)和欧洲玉米螟(ECB,Ostrinia nubilalis)。

当前用植物内(in-plant)转基因控制这些害虫是通过使植物表达来自苏云金芽孢杆菌的编码Cry1Fa蛋白的晶体(Cry)δ内毒素基因实现的。Cry1Fa是一种蛋白毒素，目前在Dow AgroSciences的Herculex^TM牌的转基因作物种子(Herculex,Herculex-Extra,和Herculex-RW)中存在，其对FAW和ECB害虫有抗性。这种蛋白通过与位于昆虫中肠内的特异受体结合发挥作用，并在肠细胞内形成孔。这些孔的形成使昆虫不能调节渗透压平衡，而导致它们死亡。

然而，一些人担心昆虫可能通过其肠道内与Cry1Fa结合的受体的遗传改变而能够形成对Cry1Fa活性的抗性。可产生与Cry1Fa结合能力降低的受体的昆虫会对Cry1Fa的活性具有抗性，因此在表达这种蛋白的植物上存活下来。

在生长条件下植物中持续存在单一的Cry毒素，关注的是昆虫能够通过其肠道内与Cry1Fa毒素结合的受体的遗传改变而形成对这种蛋白的活性的抗性。由于受体的这些改变导致的与毒素的结合降低会使Cry1Fa的毒性减小，可能最终使在作物内表达时，这种蛋白的有效性降低。

发明内容

本发明部分地涉及将某些Cry基因与Cty1Fa混杂，从而使所得产物更加持久并且使引发昆虫对该产物中任一毒素(例如Cty1Fa)的活性产生抗性的倾向性更低(and less prone towards insects developing resistance towards the acivityof any of the toxins(such as Cry1Fa)by itself)。Cry1F混杂对(stacking partner)的实例包括Cry2Aa和/或针对秋粘虫(FAW;Spodoptera frugiperda)的Cry1I和针对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nubilalis)的Cry1E。

发明详述

本发明包括使用至少一种混杂对毒素与Cry1Fa毒素作为一对。针对FAW(秋粘虫;Spodoptera frugiperda)的一些优选配对是Cry1Fa蛋白+Cry1Ea蛋白。针对ECB(欧洲玉米螟;Ostrinia nubilalis)的一些优选配对包括Cry1Fa蛋白+Cry1I和/或Cry2Aa蛋白

本发明还部分地涉及三种(或更多种)毒素的三重混杂或者“锥形混杂(pyramids)”，其中以Cry1Fa和一种混杂对毒素作为基础配对(base pair)。优选的锥形混杂针对两种害虫(即FAW和ECB)提供了两种作用模式。“2MOA”型锥形混杂包括Cry1Fa+Cry2Aa+Cry1Ab (一种用于控制ECB的优选实施方案)，和Cry1Fa+Cry1Ea(一种用于控制FAW的优选实施方案)。“分离的作用模式”的意思是蛋白彼此之间不会引起交叉抗性。

在一些优选的锥形混杂实施方案中，所选毒素可针对ECB提供三种分离的作用模式(活性成分不会产生交叉抗性)。优选的锥形混杂组合是Cry1Fa+第二种IRM毒素+第三种IRM毒素。这样的实施例如下。

本发明的ECB锥形混杂包括Cry1Fa+作为第二IRM毒素的Cry2Aa毒素+一种第三IRM毒素，其从由Cry1Be,Cry1Ab,DIG-3和Cry1I毒素组成的组中选出。

本发明的ECB锥形混杂包括Cry1Fa毒素+作为第二IRM毒素的Cry1I毒素+一种第三IRM毒素，其从由Cry1Ab,Cry1Be,DIG-3和Cry2Aa毒素组成的组中选出。

各种毒素(及其它)在所附的附录A中列出。那些GENBANK号还可用于获得本文公开或提到的任何基因和蛋白的序列。

也可使用一些专利获得相关的序列。例如，美国专利No.5,188,960和美国专利No.5,827,514描述了适用于执行本发明的含Cry1Fa核心毒素的蛋白质。美国专利No.6,218,188描述了编码适用于本发明的含Cry1Fa核心毒素的蛋白质的植物优化DNA序列。US 2010-00269223涉及DIG-3蛋白。

本发明还一般地涉及使用三种杀虫蛋白(在一些优选实施方案中是Cry蛋白)，它们不会彼此竞争，不会产生交叉抗性，但对单一的靶害虫有活性。

可产生任意目标对或者三种(或者更多种)毒素的植物(和种植有这些植物的田亩(acreage))均包含在本发明的范围内。也可以添加额外的毒素/基因，但是根据本发明，这些特定的三重混杂可以针对FAW和/或ECB有利地并且令人惊讶地提供三种作用模式(非交叉抗性活性)。这有助于降低或者消除避难所田亩的需要(例如少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或者甚至0%避难所)。因此覆盖(over)10英亩的种植田地包含在本发明之内。

本多核苷酸优选地位于在非苏云金芽孢杆菌启动子控制下(与之可操作连接/包含)的遗传构建体内。本多核苷酸可以包括植物密码子选择，以提高在植物中表达。

为了抵抗昆虫产生针对Cry1Fa的抗性的能力，我们鉴定了(与Cry1Fa)非竞争性结合FAW和/或ECB肠细胞制备物的Cry毒素。在FAW和ECB幼虫的昆虫肠内，Cry1Fa不会取代本发明所鉴定的Cry蛋白与Cry蛋白例如Cry2Aa的结合。这些Cry毒素对FAW和/或ECB幼虫有毒性的能力但作用位点与Cry1Fa不完全相同，显示出它们的毒性不会受到作为机制已经在Cry1Fa受体发生遗传改变从而对Cry1Fa的毒性变得有抗性的昆虫的影响。

因此，通过降低其肠受体与Cry1Fa的结合能力从而产生对Cry1Fa抗性的昆虫仍然对例如结合不同位点的Cry2Aa蛋白的毒性易感。我们已经获得了支持这个观点的生化数据。因此，在转基因植物内表达这些蛋白的组合提供了一种有用并且很有价值的机制，可降低田地内昆虫产生抗性的可能性，从而导致减少对避难所的需求。已经研究了其它Cry蛋白针对其他主要虫害(无论是对Cry1Fa敏感的还是抗性的(rFAW和rECB))的活性。如表1所示，Cry1I和Cry2Aa对抗性和易感的ECB幼虫均有活性。Cry1Ea对抗性和易感的FAW均有活性。可以获得这些Cry毒素针对这些害虫的结合数据。在任何情况下，本发明下面所述的数据显示了在昆虫肠内与Cry1Fa相比在不同靶位点相互作用的毒素，因此可以制成优异的混杂配对。

将表达Cry1Fa的作物与一种或多种额外的Cry基因混杂，例如本文所述的那些Cry基因，可以产生一种有效的管理策略，防止昆虫对表达这些蛋白毒素的转基因植物的活性产生抗性的能力。因为我们显示这些Cry蛋白在与Cry1Fa相比不同和/或重叠的位点相互作用，所以如果要通过改变与Cry毒素结合的昆虫肠道受体的亲和性而发生抗性，则该变化必须同时在至少两个不同的受体上发生以使昆虫在表达多种蛋白的植物上存活。发生这种情况的概率极小，因此增加了转基因产物针对能够对这些蛋白产生抗性的昆虫的耐久性。

我们放射性碘化标记了(radio-iodinated)Cry蛋白毒素的胰蛋白酶截短形式，并使用放射性受体结合实验技术测量了它们与位于昆虫肠膜内的推定受体蛋白的结合相互作用。这些肠膜通过Wolfersberger的方法制备成刷状缘膜泡(brush border membrane vesicle,BBMV)。毒素的碘化标记使用来自PierceChemicals的碘珠或Iodogen(非水溶性碘化试剂)处理的管进行。放射性标记毒素的比活性为大约1-4μCi/μg蛋白。结合试验基本上按照Liang的步骤进行。

这里提供的数据显示，毒素在昆虫肠道内在与Cry1Fa相比不同的靶位点相互作用，因此可以制备优异的混杂对。

本发明可以用于多种植物。实例包括谷物(玉米)、大豆和棉花。

可用于本发明的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，还包括保留了本发明具体例示的毒素的特征杀虫活性的这些序列的片段、变体、突变体以及融合蛋白。如本文所使用的，术语基因“变体”或“变异”是指编码相同毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“等价毒素”是指对靶害虫具有与所要求保护的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。

如本文所使用的，边界表示大约95%(例如Cry1Fa的)、78%(例如Cry1F的)和45%(Cry1的)序列同一性，参见“Revision of the Nomenclature for theBacilus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler，J.Feitelson,E.Schnepf，J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum,和D.H.Dean.Microbiologyand Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62:807-813。这些截断值(cut offs)也可仅应用于核心蛋白(例如Cry1F和Cry1Fa核心蛋白)。参见相关的Crickmore等，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/。

保留了例示的毒素的杀虫活性的片段和等价物也包含在本发明的范围内。另外，由于遗传密码的冗余，多种不同的DNA序列可以编码本文所公开的氨基酸序列。本领域的技术人员完全可以生成这些编码相同的或者基本上相同的毒素的可替换的DAN序列。这些变体DNA序列也在本发明的范围内。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不会实质上影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。编码保留了杀虫活性的蛋白质的基因片段也包含在这个定义内。

另一种用于鉴定根据本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过用合适的标记加以检测或者可制成固有地发荧光，如国际申请No.WO93/16094中所述。如本领域众所熟知的，如果探针分子与核酸样品通过在两分子之间形成强键而杂交，则有理由假定，探针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交通过本领域众所周知的技术在严格条件下进行，如例如在Keller，G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,pp.169-170中所述。盐浓度和温度组合的一些实例如下(按照严格性增强的顺序)：2X SSPE或SSC，室温；1X SSPE或SSC，42℃；0.1X SSPE或SSC，42℃；0.1X SSPE或SSC，65℃。探针的检测提供了一种用已知的方式确定杂交是否发生的方法。这种探针分析提供了用于鉴定本发明毒素编码基因的快速方法。根据本发明用作探针的核苷酸区段可以用DNA合成仪和标准的步骤合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。

本文特别例示了本发明的某些蛋白质。因为这些蛋白质仅仅是本发明蛋白质的实例，因此应当显而易见，本发明包括具有与例示蛋白质相同或相似杀虫活性的变体或等价蛋白(和编码等价蛋白的核苷酸序列)。等价蛋白质与例示蛋白质具有氨基酸同源性。该氨基酸同源性通常为大于75%，优选大于90%，最优选大于95%。氨基酸同源性在蛋白的关键区域最高，所述关键区域决定其生物活性或者涉及最终负责生物活性的三维构型的确定。在此方面，某些氨基酸取代是可以接受的，并且如果这些取代位于对于活性非关键的区域内或者是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代的话，其是可以预期的。例如，氨基酸可以在下面的分类中被替换：非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要取代不会实质改变化合物的生物活性，一个类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替的保守取代就属于本发明的范围。下面是属于每种类型的氨基酸的实例的列表。在一些情况下，也可以进行非保守取代。关键的因素是这些取代不会显著降低蛋白的生物活性。

  氨基酸类型  氨基酸实例  非极性  Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp  极性不带电荷  Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln  酸性  Asp,Glu  碱性  Lys,Arg,His

昆虫抗性管理(IRM)策略例如Roush等概述了(outline)双毒素策略，也称作“锥形”或“混杂”，用于管理杀虫转基因作物。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

美国环境保护局在其网站上(epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公布了如下的要求，要求提供非转基因(即非B.t.)避难所(非Bt作物/谷物的部分)用于与可产生针对靶害虫的单一Bt蛋白活性的转基因作物一起使用。

“针对玉米螟保护的Bt(Cry1Ab或Cry1F)谷物产物的具体结构要求(structured requirement)如下：

结构避难所：在玉米带中，20%非鳞翅类Bt谷物/玉米避难所；

在棉花带中，50%非鳞翅类Bt避难所。

块状地(blocks)

内部(即Bt田地内)

外部(即Bt田地1/2英里(如果可能1/4英里)内的分离田地，使随机相配(mating)最大化)

田地内的条带

条带必须至少4行宽(优选6行)，以降低幼虫运动效应”。

此外，美国玉米生产者协会在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)也提供了关于避难所要求的相似指导。例如：

“玉米螟IRM的要求：

-(避难所)种植在至少20%的玉米田亩以避免杂交

-在产棉区，避难所必须为50%

-(避难所)必须种植在避免杂交的1/2英里内

-避难所可以在Bt田内成条状种植；避难所条带必须至少4行宽

-只有对于靶昆虫达到了经济阈值时才可以用常规的杀虫剂处理避难所

-基于Bt的可喷洒杀虫剂不能用在避难所玉米上

-在每一块具有Bt玉米的农场上必须种植适当的避难所

如Roush等所述(例如在1780和1784页右栏)，将均对靶害虫有效并且没有或者仅有很少交叉抗性的两种不同蛋白混杂或锥形混杂，可允许使用更小的避难所。Roush建议，对于成功的混杂，小于避难所10%的避难所尺寸可以提供与对于单一(非锥形混杂)性状大约50%避难所相当的抗性管理。对于目前可以获得的锥形混杂的Bt谷物/玉米产物，美国环境保护局要求所种植的非Bt谷物/玉米的结构避难所(一般5%)显著小于对单一性状产物的要求(一般20%)。

存在提供避难所的IRM效应的多种方法，包括田地内的多种几何种植模式(如上所述)和包装好的(in-bag)种子混合物，如Roush等(前文)和美国专利No.6,551,962中进一步讨论的。

上面的百分比和相似的避难所比例可用于本双重混杂或三重混杂或锥形混杂。对于针对单一靶害虫的三个作用位点的三重混杂，目标是零避难所(或者例如小于5%的避难所)。这对于商业田亩(例如超过10英亩的商业田亩)来说是特别真实的。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过提述以其全部内容并入，其程度为它们与本说明书的明确教导没有不一致。

除非特别指出或暗示，如本文所使用的，术语“一”、“一个”和“该”的意思是“至少一个”。

下面是说明用于实施本发明的步骤的实施例。这些实施例不应当认为是限制性的。除非另外指出，否则所有的百分比均为按重量计，所有的溶剂混合物比例均为按体积计。所有的温度均为摄氏度。

参考文献

Wolfersberger,M.G.,(1993),Preparation and Partial Characterization of AminoAcid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut of theGypsy Moth(Lymantria Dispar).Arch.Insect Biochem.Physiol.24:139-147.

Liang,Y.,Patel,S.S.,和Dean,D.H.,(1995),Irreversible Binding Kinetics ofBacillus thuringiensis Cry1A Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border MembraeVesicles is Directly Correlated to Toxicity.J.Biol.Chem.,270,24719-24724.

实施例1-生物测定法

研究本Cry蛋白的针对其它主要害虫(对Cry1Fa敏感的和对Cry1Fa抗性的(rFAW和rECB))的活性。如表1所示，Cry1I和Cry2Aa对抗性和易感的ECB幼虫均有活性。Cry1Ea对抗性和易感的FAW均有活性。(关于此害虫的一般性讨论，见例如Tabashnik,PNAS(2008),vol.105no.49,19029-19030.)

表1

  蛋白  FAW  rFAW  Cry1Ea  144  1845  Cry2Aa  1397.9  1936.8  Cry1Fa  22  无活性

  蛋白  ECB  rECB  Cry1I  79.1  3618  Cry2Aa  122.9  188.4  Cry1Fa  16  无活性

附录A

δ-内毒素的列表-来自Crickmore等网址(申请中引用)

登录号用于NCBI登录(如果可得到)