成像磁镊装置及其与单分子荧光技术集成的系统和方法

摘要

本发明公开一种成像磁镊装置及其与单分子荧光技术集成的系统和方法，所述成像磁镊装置包括磁场梯度和磁场强度可调的磁性物镜、照明光源和电耦合器件，所述磁性物镜与照明光源和电耦合器件组合，以实现对超顺磁微球成像的同时进行单分子力学操纵。本发明的成像磁镊装置一方面能够进行磁镊操纵实验，还可以与多种单分子荧光技术集成应用，既能够对样品进行荧光信号探测，也能够对样品进行力学操纵，并且荧光信号和力学操纵相互独立，互不干扰；另一方面，成像磁镊装置可以对样品中的超顺磁微球施加力的束缚，有效地降低该单分子连接系统的布朗涨落，使所集成的单分子荧光装置得到更加稳定的荧光信号，提高了单分子操纵测量时的实验精度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物大分子的单分子操纵与检测领域，尤其涉及一种成像磁 镊装置及其与单分子荧光技术集成的系统和方法。

背景技术

普通的单分子磁镊操纵技术采取在光学显微镜装置中安装磁铁及相应的 电耦合器件的方法来实现单分子操纵，这种方法虽然简单易行，但测量精度 不高。单分子荧光技术能实现纳米甚至亚纳米水平的单分子探测，但是它无 法进行可控的单分子力学测量。对生物大分子而言，我们既要测量分子间相 互作用的后果，又要探测引起这些后果的原因，这就指引我们将力学操纵技 术引入到单分子荧光技术中，应用单分子力学操纵技术来降低测量系统的布 朗涨落，同时利用单分子荧光技术测量得到稳定性更高的荧光信号，从而实 现单分子力学操纵和单分子荧光探测的有机结合。

具体的，在经典的单分子磁镊操纵技术中，磁铁和观察物镜分别位于平 板样品的两侧，并且磁铁-样品和物镜-样品之间的工作距离很小，这样的空间 布局下无法再引入其它器件进行整合，限制了普通磁镊与其它单分子技术的 集成应用。

发明内容

本发明针对现有技术无法实现单分子力学操纵和单分子荧光探测的有机 结合的问题，提出一种成像磁镊装置及其与单分子荧光技术集成的系统和方 法，能够实现磁镊与单分子荧光技术的集成以及亚纳米精度的单分子力学操 纵和测量。

为了解决上述问题，本发明提供一种成像磁镊装置，包括磁场梯度和磁 场强度可调的磁性物镜、照明光源和电耦合器件（CCD），所述磁性物镜与 照明光源和CCD组合，以实现对超顺磁微球成像的同时进行单分子力学操 纵。

优选地，上述装置具有以下特点：

所述磁性物镜包括物镜和集成在物镜头部的磁场梯度和强度可调的环形 磁铁，所述环形磁铁为磁镊。

优选地，上述装置具有以下特点：

所述集成在物镜头部的环形磁铁包括两块环形磁铁，分别为前端磁铁和 后端磁铁，所述前端磁铁作为所述物镜的出瞳；所述后端磁铁套在物镜外围， 其磁场与前端磁铁叠加，通过所述后端磁铁前后滑动，可调节物镜前焦面的 磁场强度和磁场梯度。

优选地，上述装置具有以下特点：

所述装置还可包括显微镜，所述磁性物镜安装在所述显微镜上，所述显 微镜分别与所述照明光源和电耦合器件相连。

为了解决上述问题，本发明提供一种成像磁镊装置与单分子荧光技术集 成的系统，包括如上所述的成像磁镊装置、与所述CCD相连的中央处理系统、 单分子荧光成像装置和样品，所述成像磁镊装置与单分子荧光成像装置相对 放置，位于样品的两侧。

为了解决上述问题，本发明提供一种磁性物镜，包括物镜和集成在物镜 头部的磁场梯度和强度可调的环形磁铁，所述集成在物镜头部的环形磁铁为 磁镊，包括两块环形磁铁，分别为前端磁铁和后端磁铁，所述前端磁铁作为 所述物镜的出瞳；所述后端磁铁套在物镜外围，其磁场与前端磁铁叠加，通 过所述后端磁铁前后滑动，可调节物镜前焦面的磁场强度和磁场梯度。

为了解决上述问题，本发明提供一种采用如上所述的成像磁镊装置与单 分子荧光技术集成的方法，包括：

通过在样品池中进行“超顺磁微球-连接手柄-荧光微球-待测生物大分子- 玻璃表面”的单分子连接，并将成像磁镊装置与单分子荧光成像装置相对放 置，位于样品的两侧，对准后联合使用，以实现磁镊与单分子荧光技术的集 成以及亚纳米精度的单分子力学操纵和测量。

优选地，上述方法具有以下特点：

所述的“超顺磁微球-连接手柄-荧光微球-待测生物大分子-玻璃表面”的 单分子连接是指：连接手柄的一端与超顺磁微球连接，另一端与荧光微球连 接，荧光微球与待测生物大分子的一端连接，待测生物大分子的另一端与玻 璃表面连接。

优选地，上述方法具有以下特点：

所述将成像磁镊装置与单分子荧光成像装置联合使用包括：所述成像磁 镊装置的磁性物镜对样品进行单分子力学操纵；所述单分子荧光成像装置对 生物分子进行荧光信号的观测。

优选地，上述方法具有以下特点：

所述连接手柄为DNA或多肽等能够做生化连接的生物分子。

本发明的有益效果是：

1、可以对生物单分子进行研究，包括蛋白质与核酸相互作用、生物大分 子的折叠与组装、生物分子马达的动力学等；

2、把成像磁镊装置和单分子荧光技术集成，能够测量生物大分子在可控 外力操纵下的亚纳米精度的形态变化，或者因为其他生物分子的结合/组装引 起的形态变化，或者分子马达沿其轨道的运动以及它们引起的底物的构型变 化；

3、通过“超顺磁微球-连接手柄-荧光微球-待测生物大分子-玻璃表面” 的单分子连接技术，实现亚纳米精度的单分子力学操纵。

附图说明

图1是本发明实施例的磁场梯度和强度可调的磁性物镜示意图；

图2是本发明实施例的成像磁镊装置示意图；

图3是本发明实施例的使用显微镜的成像磁镊装置与中央处理系统相连 示意图；

图4是本发明实施例的成像磁镊装置与单分子荧光技术集成的系统示意 图；

图5是本发明实施例的“超顺磁微球-连接手柄-荧光微球-待测生物大分 子-玻璃表面”的单分子连接示意图；

图6是本发明应用实例的用成像磁镊装置测得的Lambda DNA（脱氧核 糖核酸）拉伸曲线。

具体实施方式

下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在 不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

本发明中提出，采用成像磁镊装置来解决传统的磁镊操纵技术的局限， 该成像磁镊装置把磁镊和物镜集成在一起，使得样品的一侧用来做单分子磁 镊测量，样品的另一侧可以用来集成单分子荧光装置进行测量（单分子荧光 装置本身也包含一个高倍物镜）。并且，本发明提出一种“超顺磁微球-连接 手柄-荧光微球-待测生物大分子-玻璃表面”的单分子连接技术，实现了单分 子操纵和单分子荧光技术的有机结合，不但克服了磁镊操纵技术原理上的缺 陷，还可实现亚纳米精度的单分子磁镊操纵测量。

图1所示，磁场梯度和强度可调的磁性物镜1包括物镜2集成在物镜头 部的磁场梯度和强度可调的环形磁铁。其中集成在物镜头部的环形磁铁为磁 镊，包括两块环形磁铁，分别为前端磁铁3和后端磁铁4。物镜2内部的镜 片排列按高数值孔径物镜内部的镜片排列，符合高数值孔径物镜的成像要求， 前端磁铁3磁性弱，位于物镜2镜头的最前端，既作为物镜的出瞳，又用作 磁镊的一部分；后端磁铁4磁性强，套在物镜2的外围，放于前端磁铁3之 后，可以在一定范围内沿物镜2的光轴方向前后运动，后端磁铁4产生的磁 场与前端磁镊3产生的磁场叠加，通过后端磁铁4的前后移动来调节物镜2 前焦面的磁场强度和磁场梯度。

如图2所示，为本发明实施例的成像磁镊装置5，该成像磁镊装置5包 括上述磁性物镜1、照明光源6和电耦合器件（CCD）7，磁性物镜1与照明 光源6和电耦合器件（CCD）7组合，以实现对超顺磁微球成像的同时进行 单分子力学操纵。其中，照明光源6为磁性物镜1提供照明，电耦合器件（CCD） 7用于将通过磁性物镜1得到的光学影像转化为数字信号。磁性物镜1、照 明光源6和电耦合器件（CCD）7可以固定在光学平台上进行磁镊实验。

如图3所示，成像磁镊装置5可以包含有显微镜，并与中央处理系统相 连。磁性物镜1安装在显微镜8上，照明光源6通过显微镜8的接口与显微 镜连接，实现照明光源6对样品9进行照明，电耦合器件（CCD）7同样与 显微镜8的接口连接，并与中央处理系统10连接，从而把样品9在电耦合器 件（CCD）7上产生的图像信息传递到中央处理系统10的主机12进行处理， 分析计算超顺磁微球的位置信息，进而推算超顺磁微球所连的生物大分子的 构象变化，并在显示器11上显示，这样实现了成像磁镊装置在普通显微镜上 使用，进行磁镊实验。

如图4所示，是成像磁镊装置与单分子荧装置集成。通过在样品池中进 行“超顺磁微球-连接手柄-荧光微球-待测生物大分子-玻璃表面”的单分子连 接，并将成像磁镊装置5与单分子荧光成像装置13相对放置，位于样品9的 两侧，对准后联合使用，以实现磁镊与单分子荧光技术的集成以及亚纳米精 度的单分子力学操纵和测量。成像磁镊装置5中的可调磁性物镜1与单分子 荧光装置13中的观察物镜（图中未画出）须调节共轴，使得成像磁镊装置5 和单分子荧光装置13所观察的是相同区域，成像磁镊装置5对样品9进行单 分子力学操纵，得到的图像信息传递给中央处理系统10的主机12进行处理， 得出超顺磁微球的力学信息，并在显示器11上显示，单分子荧光装置13对 样品9进行单分子荧光信号探测，得到的荧光信号由单分子荧光装置13自带 的处理系统进行处理，得出相应的单分子荧光信息，其中单分子荧光装置13 包括很多种，如全反射荧光显微装置，或者分子马达在DNA上行走的探测装 置，也可以是FRET（fluorescence resonance energy transfer，荧光共振能量转 移）实验装置等，只要是单分子荧光的实验装置就可以通过上述方法与成像 磁镊装置5进行集成。

如图5所示，是“超顺磁微球-连接手柄-荧光微球-待测生物大分子-玻璃 表面”的单分子连接，包括超顺磁微球14，连接手柄15，荧光微球16，待 测生物大分子17，玻璃表面18，连接手柄15的一端与超顺磁微球14连接， 另一端与荧光微球16连接，荧光微球16再与待测生物大分子17的一端连接， 待测生物大分子17的另一端与玻璃表面18连接，超顺磁微球14由成像磁镊 4操纵并控制，荧光微球16的荧光强度由单分子荧光装置13探测，当采用 全反射荧光装置与成像磁镊装置耦合时，可以通过荧光微球的光强变化推算 出荧光微球16与玻璃表面的距离变化，实现亚纳米精度的单分子力学操纵和 测量，下面给出了成像磁镊测量磁力的方法，也给出了通过荧光微球荧光强 度的变化来计算荧光微球与玻璃表面之间距离的变化的方法。

如图6所示，是本发明应用实例的用成像磁镊装置测得的Lambda DNA 拉伸曲线。

在磁镊实验中，超顺磁微球受力的大小由超顺磁微球周围的磁场梯度和 超顺磁微球与磁镊之间的距离决定。超顺磁微球受力由如下公式给出：

$F\approx m\frac{{\mathrm{dB}}_x}{\mathrm{dx}}\hat{x}$

式中，m为磁矩，B为磁场强度，X是磁场梯度的矢量方向。

但是用上述方法进行力的测量比较困难，一般来说，单分子受力的测量 由超顺磁微球的布朗运动给出，如下：

$F=\frac{k_{B}T<z>}{<{\left(\mathrm{\delta x}\right)}^2>}$

式中，k_B是玻尔兹曼常数，

T是绝对温度，

<z>是单分子的平均长度，

<(δx)²>是超顺磁微球x方向的方差。

采用全反射荧光装置与成像磁镊装置耦合进行荧光信号探测时，荧光微 球的光强变化与距离变化关系由如下公式给出：

$I\left(z\right)=I\left(0\right)\exp (-\frac{z}{d});$

其中，$d=\frac{\lambda }{4\pi \sqrt{(n_1^2{\sin }^2\theta -n_2^2)}}$

式中，λ是入射激光的波长，

n₁全反射界面处光密介质折射率，

n₂是光疏介质折射率，

θ是全反射光束入射角，

z是荧光微球与玻璃表面之间的距离，

I(z)是距离z时的荧光微球光强。

在上述全反射荧光装置与成像磁镊装置耦合的实验装置中，通过成像磁 镊装置中探测到的图像信息可以直接测量超顺磁微球所受到的磁力，从而进 行单分子力学操纵；通过全反射荧光装置测量荧光微球产生的荧光强度信息， 进而计算荧光微球与玻璃表面之间相对距离的变化，从而得到高分辨率的生 物大分子构象变化信息。

本发明的成像磁镊装置一方面能够进行磁镊操纵实验，还可以与多种单 分子荧光技术集成应用，当采用全反射荧光装置与成像磁镊耦合进行荧光信 号探测时，利用本发明的单分子连接技术，把成像磁镊装置和单分子荧光技 术集成，既能够对样品进行荧光信号探测，也能够对样品进行力学操纵，并 且荧光信号和力学操纵相互独立，互不干扰；另一方面，成像磁镊装置可以 对样品中的超顺磁微球施加力的束缚，有效地降低该单分子连接系统的布朗 涨落，使所集成的单分子荧光装置得到更加稳定的荧光信号，克服了普通磁 镊装置中对磁性微球进行定位时由布朗运动引起的涨落大的缺陷，提高了单 分子操纵测量时的实验精度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本 领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。