基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途

摘要

本发明涉及基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途。具体而言，本发明涉及基因搜寻系统所用的载体、随机基因调控方法、筛选高转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法、利用所述随机基因调控方法获得的全基因组随机突变文库及利用所述筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法筛选获得的基因的制药用途、所述基因的抑制剂的制药用途和所述基因的蛋白质表达产物的抑制剂的制药用途。利用本发明上述方法获得的基因，该基因的抑制剂，该基因的表达产物及该基因的表达产物的抑制剂，可以开发特异性抗肿瘤的药物。

说明书

技术领域

本发明属于随机基因突变方法领域。具体而言，本发明涉及基因搜寻系统所 用的载体、随机基因调控方法、筛选高转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高人肿 瘤细胞株转移的基因的方法、利用所述随机基因调控方法获得的全基因组随机突 变文库及利用所述筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法筛选获得的基因的制 药用途、所述基因的抑制剂的制药用途和所述基因的蛋白质表达产物的抑制剂的 制药用途。

背景技术

随着人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究领域已进入后基因组时代。

基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步，更大的挑战将是如何确 定基因的功能和破译全部的遗传信息^1，2。目前很多遗传学技术被用来寻找控制癌 症转移的基因，包括化学诱变DNA、逆转录病毒插入诱变、小型干扰RNA(siRNA)、 核酸酶(ribozymes)、基因打靶(Shot-Gun)、转基因动物和生物芯片技术，这些方法 功能基因组学研究方法广泛应用于癌症的研究，新基因的发现已经应用于恶性肿 瘤的早期发现、诊断和治疗^3-6。最近关于胰腺癌的全基因组测序分析显示胰腺癌 约有63个基因突变，涉及到12个关键的信号转导通路⁷，其中核心通路包括只有 单个基因突变占优势的通路，如KRAS信号转导通路；几个基因突变的通路，如 TGF-β信号转导通路；许多基因突变的通路，如调节侵袭的整合素的信号转导通 路，Guanine Triphosphatase(GTPase)依赖的信号转导通路等。这些关键信号转导通 路的失调和频繁的基因突变足以解释胰腺癌自身独特复杂的生物学特性，也为深 入理解胰腺癌转移的分子机制带来一定的难度。因此，确定胰腺癌频繁的基因突 变和这些突变与其独特的生物学特性之间的联系对研究胰腺癌的转移具有很重要 的作用。

现阶段利用功能基因组学技术研究癌症转移的方法主要有微阵列分析、RNA 干扰和插入突变等。微阵列是20世纪80年代末发展起来的以高密度为特征的可 用于大规模检测基因表达差异的一项新的基因功能研究技术；主要原理是利用分 子杂交原理将印有大量已知部分序列的DNA探针与检测样品杂交，通过检测杂交 信号强度及数据处理，从而全面的对基因的表达进行定量分析；其主要优点是高 通量，能对大量基因的表达情况进行比较^8-10。利用生物芯片分析转移性和非转移 性肿瘤之间基因表达的差异，现阶段已有研究者找到一些与癌症转移相关的基因。 但是，生物芯片比较实验组和对照组表达差异得到的基因成千上万，为后续的分 析带来了巨大困难，研究者必须具有很高的专业水平并且需要后续的功能验证， 所得到的基因都是一些癌症转移相关基因。近年来，RNA干扰筛选肿瘤发生和转 移相关基因方面取得了很大进步，利用该技术已经筛选出肿瘤发生相关的p53通 路上新的关键基因、与上皮性肿瘤细胞的迁移即癌症转移第一步相关的基因、肝 癌发生相关的新基因、黑色素瘤转移的相关基因^11-16。然而，该技术需要提前知道 靶基因的序列，才能设计出沉默此靶基因的dsRNA，这样会缩小基因筛选的范围， 往往会漏掉一些未知基因；另外，RNAi技术只能将靶基因敲除，无法过表达某个 基因，需要配合使用cDNA文库技术¹⁷，这样也限制其应用。插入突变是利用已 知的外源DNA插入序列作为标记，不必事先确定基因表达和基因产物，破坏基因 的结构而导致突变，可以直接验证个别基因与所筛选性状之间关系，是一种理想 的功能基因组学研究方法。目前有文献报道利用该技术筛选到与肿瘤发生、转移 相关基因，但是困扰该方法应用的问题在于其插入突变的效率，一方面需要外源 DNA高效整合到基因组，另一方面需要将两个等位基因同时突变¹⁸。

目前，利用插入突变进行功能基因组学研究应用较多的工具是转座子。1996 年有研究报道应用逆转录病毒作为基因插入的工具并结合相应的表型筛选出新的 肿瘤抑制基因tsg101 ¹⁹。除了逆转座子外，使用较多的有Sleeping Beauty和 PiggyBac转座子，插入突变和标记基因组中的基因，然后根据相应的功能特征进 行筛选突变细胞株，最后分离和克隆基因^20-24。Sleeping Beauty是第一个应用于哺 乳动物细胞的DNA转座系统-SB转座子，有研究证实与逆转座子相比，其转座 位点偏倚性相对小，免疫原性低，转座效率高等多项优势，可随机突变基因，对 于基因功能研究和疾病研究均具有重要意义²⁵。PiggyBac是一种从飞蛾中分离出 来的可移动的DNA元件，插入位点偏好于基因的内含子区域，且其整合频率高， 受生物体种类的限制性较少。2005年首次证明了piggyBac转座子系统在在哺乳动 物细胞中能够实现高效稳定的转座²⁶；且很多实验已证实PB转座系统携带的外源 基因片段的能力强，最高可携带14.3kb片段且不会影响转座效率；插入位点更多 (67％)位于转录单位附近或其中；转座效率高；转座后在细胞全套染色体上均有 分布，基因覆盖率高^27-29。此外，有研究利用PB系统在小鼠胚胎干细胞中建立全 基因组范围内的突变文库，结果显示其文库的基因覆盖率理想，易于发现新基因 ^30，31。因此，PiggBac转座子系统较为理想的高效插入突变工具，能在全基因组水 平筛选基因中发挥重要作用的，而且更多影响编码基因的特征使其在功能基因组 学研究中具有突出的优势。

胰腺癌是预后最差的消化系统恶性肿瘤之一。在过去二十年内，关于其发生、 发展、诊断、治疗研究取得了重要的进展，年平均死亡率与年平均发病率比例有 所下降，但是仍不能改善胰腺癌患者的远期生存时间。由于胰腺特殊的解剖位置、 高度侵袭的生物学特性使其难以早期发现，临床就诊时多为晚期患者，在病人体 内已经发生转移，手术切除率小于20％，五年生存率仍然小于5％，其中转移是治 疗失败的最主要原因^32，33。肿瘤转移是指肿瘤细胞离开原发部位并在新器官或组织 中生长的复杂过程，是一个多步骤的进程，包括癌细胞丧失黏附能力，血管生成， 侵袭脉管，进入循环，逃避机体的免疫监视而存活，在毛细血管处停留，穿出血 管壁进入周围组织，并在远处器官定位生长形成新的转移灶³⁴。目前认为其发生的 分子机制是这一复杂过程中的许多基因及其编码的蛋白质发挥了重要作用^35，36。因 此，找出背后的这些基因及其相关的遗传通路将是解决肿瘤转移的突破口。

因此，需要一种独特的分子遗传学方法来研究胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转 移，该技术能直接确定基因突变和癌症转移的因果关系，非常高效地筛选到控制 胰腺癌和/或其他恶性肿瘤转移的关键基因和候选通道，深入分析转移的分子机理， 为胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的诊断和治疗奠定基础。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于寻求一种高效的研究胰腺癌和/或其他恶性肿瘤 的转移、基因突变和癌症转移的因果关系及高效筛选控制胰腺癌和/或其他恶性肿 瘤转移的关键基因和候选通道的方法，并利用所述方法筛选到的基因制备药物。

因此，本发明的第一方面涉及一种基因搜寻载体，其包含四环素反应元件、 piggbac转座子，优选地，所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到， 优选地，所述基因搜寻载体还含有新霉素抗性基因，优选地，所述基因搜寻载体 还含有质粒复制起点。

本发明的第二方面涉及一种随机基因调控方法，其包括步骤：

1)将人肿瘤细胞株用cag-tTA质粒转染，获得稳定表达转录激活因子(tTA) 的Tet-off细胞株，优选地，所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌细胞株，最优选地，所 述人肿瘤细胞株为人胰腺癌细胞株Aspc-1；

2)将如上所述的基因搜寻载体和有效表达转座酶MPB的质粒共转染步骤1) 获得的Tet-off细胞株，获得全基因组纯合细胞突变体，优选地，所述有效表达转 座酶的质粒为MPB³⁷。

本发明的第三方面涉及一种筛选高转移人肿瘤细胞株的方法，其包括步骤：

3)将有效量的如上所述的步骤2)中获得的全基因组纯合细胞突变体接种裸 鼠，优选地，所述裸鼠为BALB/C裸鼠(购自中国药品生物制品检定所)；

4)待接种的裸鼠体内长出肿瘤或显现病态后处死小鼠，分离获得转移灶并进 行体外原代培养，获得与对照的人肿瘤细胞株相比高转移和/或低转移的人肿瘤细 胞株，所述对照的人肿瘤细胞株为人胰腺癌Aspc-1细胞株。

本发明的第四方面涉及一种筛选提高和/或降低人肿瘤细胞株转移的基因的方 法，其包括步骤：

5)将如上所述的步骤4)中获得的高转移和/或低转移的人肿瘤细胞株通过 Splinkette PCR的方法克隆出基因搜寻载体周围的序列，再通过blast比对找到该位 置的基因。

本发明的第五方面涉及一种利用如本发明第二方面所述的随机基因调控方法 获得的全基因组随机突变文库。

本发明的第六方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因在制 备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌。

本发明的第七方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因，其 用做抗肿瘤的药物，优选地，所述肿瘤为胰腺癌。

本发明的第八方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的抑 制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑 制剂为siRNA。

本发明的第九方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的抑 制剂，其用作抗肿瘤的药物，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂 为siRNA。

本发明的第十方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的蛋 白质表达产物的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌， 优选地，所述抑制剂为特异性抗利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的蛋 白质表达产物的抗体，优选地，所述抗体为单克隆抗体。

本发明所构建的基因搜寻载体、利用所述基因搜寻载体和表达转录激活因子 (tTA)的Tet-off细胞株以及有效表达转座酶MPB的质粒随机调控基因的方法、 筛选高转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法为研 究胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转移、直接确定基因突变和癌症转移的因果关系、 高效地筛选到控制胰腺癌和/或其他恶性肿瘤转移的关键基因和候选通道、深入分 析胰腺癌和/或其他恶性治疗转移的分子机理、为胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的诊断 和治疗奠定基础提供了一整套有利的工具，利用所述随机调控基因的方法获得的 全基因组随机突变文库为筛选其他控制目标形状的基因提供了基础。利用本发明 上述方法获得的基因，该基因的抑制剂，该基因的表达产物及该基因的表达产物 的抑制剂，可以开发特异性抗肿瘤的药物。

附图说明

图1：显示了本发明所述随机基因突变调控技术的原理。基因搜寻载体(GSV) 包括piggyBac转座子骨架、两个四环素反应元件、新霉素抗性基因、质粒的复制 起点。piggyBac转座子在转座酶的帮助下可以通过“剪切-粘贴”的机制整合到基 因组；四环素反应元件受转录激活因子(tTA)的激活，启动转录；新霉素抗性基 因作为筛选标记，可以降解新霉素药物G418；质粒的复制起点是质粒扩增复制必 不可少的元件。当基因搜寻载体整合到编码基因内并且受tTA的激活后转录方向 与该基因转录方向相反时，可以得到与该基因转录产物互补的反义RAN(Antisense RNA)，从而阻断该基因的翻译(A图)；若GSV插入到编码基因之间且启动转录 方向与该基因相同时，则可增强该基因的表达(B图)。四环素类衍生物(DOX) 可结合TtTA并诱导其构象发生变化，阻碍其结合四环素反应元件，从而不能启动 转录；因此，可以通过添加DOX来实现对插入基因的表达人为控制。

图2：显示了利用随机基因突变调控技术平台筛选控制胰腺癌转移的关键基因 的实验流程图。首先在人胰腺癌细胞株(Aspc-1)建立Tet-off表达调控系统得到 Tet-off细胞株，然后利用基因搜寻载体建立全基因组纯合细胞突变库，经过裸鼠 体内筛选得到高转移细胞株，再经过Dox进行基因突变和功能的因果关系验证， 最后通过分子克隆和blast比对得到候选基因。

图3：A显示了构建基因搜寻载体的流程图，其包括TATA-14Tet片段和 Neo-PA-Ori片段的获取与拼接，TATA-14Tet-Neo-PA-Ori片段插入piggyBac转座子 及CMV启动子的插入；B显示了本发明构建的基因搜寻载体的图谱。

图4：显示了荧光素酶报告基因检测转录激活因子(tTA)的表达：利用荧光 素酶报告基因检测tTA对四环素反应元件的激活活性以及受DOX的调控程度，与 对照的Aspc-1细胞株相比，2B6、2D2、5A3三个克隆的tTA活性较高，且受DOX 的调控超过500倍。

图5：显示了GSV与MPB的浓度摸索。GSV的高效整合需要MPB的帮助， 为了得到足够大的全基因组纯合细胞突变库，需要合适的GSV和MPB的浓度， 且尽量避免GSV的随机插入。MPB能大大提高GSV的整合效率(A图)，为了减 少GSV随机插入，要尽量降低GSV的转染量，但是GSV的含量太少会影响后续 得到的突变克隆数目，因此需要综合考虑来决定GSV用量，随着GSV的增加， 所得到克隆数目也逐渐增多(B图)，GSV与MPB的比例也决定所得到突变克隆 的多少，有文献报道随着MPB量的增加会出现过度抑制现象，故将GSV用量固 定在25ng和50ng来摸索合适的MPB用量(C图，D图)。

图6：显示了DOX验证高转移胰腺癌细胞株M45转移特性与基因突变的因果 关系的结果。A、C为接种M45后，解剖经口喂食DOX裸鼠的肉眼下的肺脏和肝 脏，B、D是未在应用水中添加DOX组的肉眼下裸鼠肺脏和肝脏。

图7：显示了DOX验证高转移胰腺癌细胞株M45转移特性与基因突变的因果 关系的结果。A、C为接种M45后，解剖经口喂食DOX裸鼠的显微镜下(20×) 的肺脏和肝脏，B、D是未在应用水中添加DOX组的显微镜下(20×)裸鼠肺脏 和肝脏，图中箭头所示为转移灶。

图8：显示了基因克隆与定位的结果。A中为通过splinkette PCR后得到的GSV 两端PCR产物大小，B是将PCR产物测序后进行基因定位。

具体实施方式

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，发明一种随机基因突变调控的方法 并使用该方法筛选控制胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转移的基因。该方法的特点包 括：能产生全基因组纯合基因突变；提供全基因组基因筛选和基因功能分析；同 时发现并证实其基因突变和功能表达的关系；系统性基因功能定位和分析其在遗 传和生化通路中的功能特点；快速分离与疾病有关基因和变阻器式基因表达调控。

该方法的原理是：通过基于能在真核细胞中高效整合的piggyBac转座子 (GI：226433913)构建基因搜寻载体(gene search vector，GSV)，将其随机插入基 因组，其中GSV所携带的四环素反应元件(TRE，GI：76667907)优选为利用两段 四环素反应元件拼接得到，这样转录激活因子对其的激活作用更强，启动转录的 距离更远，能够受到转录激活因子tTA的激活，piggbac转座子在真核细胞中能高 效整合，并且整合位点偏向于编码基因，并且在插入基因组后可以通过转座酶进 行无痕切除，这些都符合一个理想的基因搜寻载体的要求。在tTA的作用下，GSV 中的14Tet能够很强地启动附近DNA序列的转录；若转录出的RNA与上游基因 转录方向相反，则可得到反义RNA，与上游基因的mRNA结合从而阻止该基因的 翻译表达；若方向相同，则可过表达下游基因，故通过该载体可将插入位点附近 的基因突变。GSV中还可以包含新霉素抗性基因，该抗性基因在真核细胞中可以 利用G418筛选阳性克隆，在原核细胞表现为卡那霉素抗性，用于筛选阳性菌落。 当然，所述GSV中的抗性基因可以为任何适于可以在真核细胞和原核细胞中分别 进行抗性筛选的原件。此外，转录激活因子tTA与TRE的结合还受到四环素类药 物例如强力霉素(Doxcyclin)的调控，通过添加或者不添加DOX可以人为的调控 tTA是否激活TRE启动转录，从而能够同时发现并证实其基因突变和功能表达的 关系，故是一种突变调控技术，其原理如图1所示。本领域技术人员熟知，为了 实现或更好地实现本发明的目的，本发明的基因搜寻载体还可以包含质粒复制起 点，该质粒复制起点并无特殊要求，只要其能有效起始质粒在相应宿主中的复制 即可，如p15A复制子；利于外源片段插入的多克隆位点；调控目标基因转录翻译 的四环素反应元件，如TRE；能在真核细胞中随机整合的转座子，如PiggyBac； 利于在原核系统中筛选阳性菌落的氨苄青霉素抗性基因；能有效启动基因搜寻载 体在宿主细胞中转录翻译的启动子，如P-CMV；以及其他质粒常见元件，如增强 子、便于基因表达检测的荧光蛋白基因、终止子，等。

本发明是通过如下技术方案来实行：组建基于piggyBac转座子的基因搜寻载 体；建立人胰腺癌Aspc-1细胞株Tet-off表达调控系统和高效率基因搜寻载体转化 方法；构建Aspc-1细胞全基因组纯合基因突变细胞库；裸鼠体内筛选突变后高转 移胰腺癌细胞株；体外原代培养转移灶；验证筛选出的高转移细胞株与基因突变 的因果关系(通过四环素调控的特异性转录激活因子活性激活或失活)；克隆和鉴 定候选基因，见图2。

本领域技术人员公知，在保证实现基因搜寻的目的的前体下，所述基因搜寻 载体还可以包含其他功能元件，所述功能元件均被有效连接，以实现在原核宿主 细胞中被复制、扩增、检测、筛选、分离或纯化，和/或在真核宿主细胞中被复制、 扩增、与宿主基因组整合、转录、翻译、检测、筛选、分离或纯化的目的。同时， 本领域技术人员公知，在保证实现基因搜寻的目的的前提下，所述基因搜寻载体 的组成元件的顺序可以进行适当地调整，例如，所述原核抗性基因和真核抗性基 因的位置可以相互调换。这样的变形也包括在本发明的范围内。

本领域技术人员理解，本发明所述基因搜寻载体内所使用的各个组成元件均 是本领域公知的作用元件，其具体的核苷酸序列可以方便地在本领域公知的数据 库中找到并适用。

本领域技术人员公知，本发明所述的随机基因调控方法、筛选高转移和/或低 转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高和/或降低人肿瘤细胞株转移的基因的方法不 仅适用于人胰腺癌肿瘤细胞系，也适用于其他人肿瘤细胞系。

本发明所述方法获得的全基因组随机突变文库随机产生且突变性状能够遗 传，包含的突变的基因从概率上覆盖了整个基因组，可以应用于筛选待检测的作 用于目标性状的控制基因或信号通路，所述目标性状例如但不限于加速肿瘤细胞 转移、降低肿瘤细胞转移及筛选肿瘤发生、耐药等，也可通过流式细胞术FACS 筛选细胞表面表达某种特异性分子标记的细胞。

本领域技术人员公知，本发明所述方法获得的基因可以应用于抗肿瘤药物的 制备，此时，所述基因为抑制肿瘤细胞转移的基因。所述基因可以按照公知的基 因治疗药物的制备形式予以制备，例如所述基因可以连接入腺病毒载体以重组载 体的形式制备，或所述基因可以连接入原核或真核表达载体，在相应的宿主细胞 中表达、纯化，以纯化的蛋白质的形式提供。

本领域技术人员公知，本发明所述方法获得的基因的抑制剂可以应用于抗肿 瘤药物的制备，此时，所述基因为促进肿瘤细胞转移的基因。所述基因的抑制剂 可以是利用RNA干扰原理实现治疗目的的siRNA。对于这样的siRNA的设计及制 备方法，本领域已经有大量可选的文献可供参考。所述基因的抑制剂也可以是 microRNA等直接抑制靶基因的转录和/或表达的作用元件。

本领域技术人员公知，本发明所述方法获得的基因的蛋白质表达产物的抑制 剂可以应用于抗肿瘤药物的制备，此时，所述基因为促进肿瘤细胞转移的基因。 所述基因的蛋白质表达产物的抑制剂可以是中和所述基因的蛋白质表达产物的抗 体。所述抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。

本领域技术人员公知，本发明所述方法能够治疗的肿瘤绝不仅限于本发明下 述实施例所例证的胰腺癌。由于本发明的原理在于利用肿瘤细胞在转染本发明所 述的载体后发生的肿瘤转移性状的可测表现筛选与之对应的控制基因，因此所测 定的基因直接与所使用的检测用的肿瘤细胞系在功能上相关。由于本发明所述的 载体对所使用的肿瘤细胞系并无特殊要求，因此，本发明所述药物能够治疗的肿 瘤也并无特殊的限定。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知， 在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入 本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说 明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1主要实验材料

限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，引物、测序、Taq聚合酶均 购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司，Aspc-1 细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)，胎牛血清、DMEM培养 基、PBS购自Hyclone公司，FugenHD购自Roche公司，各种细胞培养耗材均购 自Corning公司，嘌呤霉素(puromycin)、Luciferin底物购自Invivo公司，新霉素 (neomyicn，G418)购自Merck公司，胸腺缺陷裸鼠(BALB/c nu/nu)雌鼠购于 中国药品生物制品检定所。

实施例2：基因搜寻载体的组建

本发明中基因搜寻载体包括四环素反应元件、新霉素抗性基因、质粒复制起 点和piggbac转座子等几个部分，需要将这些核心部分拼接在一起，总流程见图3A， 具体包括以下几个部分：

1.TATA-14Tet片段的获取，该部分包括真核基因转录起始点TATA盒和2个 四环素反应元件；利用限制性内切酶SmaI、XhoI和EcoRI分别单切和双切 pUHD13-3质粒³⁸，方法如下：

SmaI单切质粒pUHD13-3，反应体系如下述表1所示：

表1：

反应条件为：25℃孵育2h。

XhoI和EcoRI双切质粒pUHD13-3，反应体系如下述表2所示：

表2：

反应条件为：37℃水浴2h。

凝胶分别回收纯化约3kb及0.45kb酶切产物，将回收后的产物16℃连接过夜， 反应体系如下述表3所示：

表3：

反应条件为：16℃连接过夜。

利用乙醇沉淀法纯化连接产物，纯化的产物沉淀用DDH₂O溶解。

纯化后的连接产物利用常规电击法转化至DH10B细菌(invitrogen)，利用具 有氨苄抗性的10cm琼脂平板筛选阳性克隆。

挑取平板上的抗性菌落扩增培养后利用OMEGA公司质粒提取试剂盒提取质 粒，将提取后的质粒进行XhoI+XbaI双酶切反应，纯化回收约0.8kb产物，得到 TATA-14Tet片段，具体方法同前，见图3A中①部分。

2.Neo-PA-Ori片段获取，利用NheI+XbaI双酶切pACYC184质粒³⁹，纯化回 收约0.8kb的产物Ori；利用引物Neo-F及Neo-R进行PCR扩增Neo-PA片段，反 应体系如下述表4和表5所示：

表4：

表5：

将PCR产物进行NheI单切，回收纯化后与Ori片段连接、转化、用卡那霉素 进行菌落克隆平板筛选、挑克隆、质粒提取并利用XhoI+NheI双酶切、回收纯化 后得到长度约为2.1kb的Neo-PA-Ori片段，见图3A中②部分。

3.TATA-14Tet片段与Neo-PA-Ori片段的拼接，将酶切纯化回收后的上述两个 片段，连接，转化至DH10B，利用卡那霉素筛选，挑克隆培养，提取质粒，将所 得质粒用BamHI酶切后回收，所用方法同前，得到约为2.9kb的片段 TATA-14Tet-Neo-PA-Ori，见图3A中③部分。

4.将TATA-14Tet-Neo-PA-Ori片段插入piggyBac转座子⁴⁰中，见图3A中④ 部分，利用引物PB-P1和PB-P2进行PCR扩增piggyBac空载体⁴⁰部分，BamHI 酶切、回收后与片段连接并转化DH10B、挑克隆、提质粒、BamHI酶切鉴定方向 插入正确的克隆，即酶切后得到约为6kb+0.8kb片段，而非2.1kb+4.7kb片段，具 体方法同前。

5.将CMV启动子插入Neo前面，利用引物Np5和Np3从PBR-β-Neo³⁹上 扩增出CMV启动子片段，约为0.3kb，BamHI+BglII双切后与经BamHI单切 PB-TATA-14Tet-Neo-PA-Ori质粒得到的片段连接，具体方法同前，经过鉴定后最 终得到约为7.1kb的基因搜寻载体(GSV)，见图3A中⑤部分，质粒图谱见图3B。

实施例3：全基因组随机突变文库的构建

本发明中所涉及到的构建随机突变文库是通过随机插入细胞基因组的基于 piggyBac转座子的基因搜寻载体上的核心元件来发挥作用，该工作包括构建表达 转录激活因子tTA的载体、建立Tet-off表达调控系统的胰腺癌细胞株、随机整合 基因搜寻载体进入Tet-off细胞株中，具体如下：

1.构建表达转录激活因子tTA的质粒，为了建立高效表达tTA的Tet-off细胞 株，首先将tTA编码基因前方插入强启动子CAG。利用引物tTA-P1和引物tTA-P2 从pTet-off/hygro质粒(购自Clontech)上扩增出转录激活因子tTA的编码序列，经 BamHI和NotI双酶切后连入同样经双酶切的表达载体pCAG-PBase⁴¹转化、筛选 鉴定、测序后得到表达载体CAG-tTA，具体方法同前。将得到的CAG-tTA质粒大 量提取后，利用KpnI酶切成线性，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，测定浓度， 储存至-20℃备用。

2.建立稳定表达的Tet-off的Aspc-1细胞株。

2.1细胞转染：将线性CAG-tTA质粒转染Aspc-1细胞，利用荧光素酶报告基 因技术筛选高效表达的Tet-off细胞株。按照罗氏FugeneHD说明书，在转染前一 天接种5×10⁵Aspc-1细胞至60mm细胞培养皿，待细胞长至约80％时，用无血清 无抗生素的DMEM培养基将CAG-tTA质粒稀释成0.02μg/μl，取250μl，向其中加 入15μl FugeneHD，轻轻混匀，常温孵育15min后，慢慢滴入已准备好的细胞中， 轻轻混匀，放置37℃的CO₂培养箱中继续培养；24h后消化细胞，平均分至3个 10cm培养皿中，加入含嘌呤霉素(puromycin，2μg/ml)的培养基中继续培养，每 隔2天换一次液继续筛选；2周后形成肉眼能够观察到的克隆。

2.2荧光素酶报告基因筛选稳定表达的Tet-off的Aspc-1细胞株，将经嘌呤霉 素筛选后的克隆挑取并扩大培养，消化并接种10⁴细胞于96孔板，每个克隆接种 6个平行孔，置于5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜，待细胞密度达 到80％时，按FuGeneHD说明书用前述相同方法向细胞内转染Luciferase报告 基因-pUHC13-3质粒³⁸，每孔加质粒DNA 0.05μg，FuGeneHD∶DNA按3∶1转染， 然后在每个克隆的一半孔中加强力霉素(Doxycycline，DOX)溶液(0.2μg/孔)； 置于培养箱中培养，48小时后用冰冷的PBS洗涤细胞，弃去上清，利用Harvest Buffer裂解细胞(4℃，30min)，将裂解液混合均匀之后每孔取50μl至96孔酶标 板中，按照ATP∶Luciferin Buffer＝1∶3.6的比例配制适当反应液，然后在生物发光 检测仪上读取吸光度值，根据结果计算加了DOX各孔与未加DOX各孔相比荧光 素酶表达强度的下调倍数；在所挑选的克隆中，克隆2B6、2D2、5A3的荧光强度 相对较高，且加入DOX后，其相对光单位能大幅度下降，加入DOX前后的差异 能达到几百到几千倍，见图4。

3.构建全基因组随机突变文库，利用脂质体转染法共转染基因搜寻载体GSV 和转座酶MPB质粒³⁷，在mpb的帮助下，GSV能高效整合到基因组上；比较理 想的文库应该是文库中每个突变克隆只含有一个GSV的整合，为了减少插入到细 胞中的拷贝数，需要严格控制转染的GSV的量；此外，为了使GSV高效整合， GSV和MPB的比例和量也尤为重要，有文献报道过量的MPB反而会大大减少 GSV的整合效率；因此，在构建随机突变文库前，需要摸索GSV和MPB合适的 量。利用前述方法接种10⁵细胞至24孔板，实验设立空白组；单独转染GSV组， 按不同的GSV量细分为0ng，25ng，50ng，100ng，150ng，200ng；GSV和MPB 共转染组，包括分别固定GSV为25ng和50ng，MPB量从0ng，25ng，50ng，100ng， 150ng，200ng变化；最终的DNA总量为500ng，用载体DNA补齐；转染24h后 将细胞转入10cm培养皿中，加入400μg/ml的新霉素(neomycin，G418)筛选， 每2-3天换一次液，3周后可见到空白组细胞全部死亡，单独转染25ngGSV组克 隆数目较少，约100个，共转染25ngMPB后克隆数目大幅度提高，高达1500个 左右，即MPB能大幅提高GSV的整合效率，将经过筛药后的克隆利用亚甲基蓝 染色后可明显看出差异，见图5A。

具体的单转染GSV组和共转染GSV及MPB组后得到的克隆数目统计结果见 图5B、5C和5D，可以从中看出，克隆的数目跟GSV的量密切相关，而MPB对 GSV也存在过度抑制现象，当MPB∶GSV超过1∶1时，所得到的克隆数目迅速减少。 因此，为了减少单个细胞中GSV的拷贝数，同时兼顾共转染MPB后的总的克隆 数，将GSV和MPB固定在50ng进行文库构建。按照上述比例，每10⁵细胞中共 转染GSV和mPB各50ng，转染后每10⁵细胞转入一个10cm培养皿中加入新霉素 筛选3周左右，一共进行8次实验，共得到约120万具有G418抗性的克隆，即得 到包含约120万个整合了GSV的克隆的突变文库。

实施例4：高转移性胰腺癌细胞株的体内筛选

前述所构建的突变文库所包含的突变克隆数目是整个细胞基因组编码基因数 目的40多倍，故所突变的基因从概率上覆盖了整个基因组；将该文库分为四组， 分别是L123、L456、L7和L8，每组大约含30万个突变克隆；同时将4-6周龄的 BALB/C裸鼠也分成四组，每组对应一组突变文库，裸鼠每组9只，3只用于尾静 脉注射(10⁶/只)，3只进行腹腔接种(3×10⁶/只)，余下3只用于皮下注射(4× 10⁶/只)；消化细胞，利用PBS洗3次，尽量去除血清以减少免疫排斥反应，将细 胞放置冰上，计数细胞并利用台盼蓝计算细胞存活率，保证接种前细胞存活率 ＞90％；利用1ml注射器接种突变后的癌细胞，吸取细胞时去掉针头以减少其对细 胞的机械损伤作用，尾静脉注射时排空注射器内的空气；接种后密切观察裸鼠的 生命状态，待出现病态体征时，处死小鼠进行原代培养。大约1-3月内小鼠都表现 异常，断颈处死后，碘酒消毒小鼠并解剖，肉眼观察各个脏器，看到转移灶后切 下转移瘤，利用手术刀切碎，用培养基悬浮至离心管中，1000rpm离心5min，弃 上清，加入10ml红细胞裂解液，悬浮细胞并裂解细胞10min，离心、PBS洗2次、 培养基重悬后转至10cm培养皿中，放置37℃5％CO₂培养箱中培养；第二天更 换培养基，去除未贴壁的悬浮组织，大约一周后加入筛选药物(G418：400μg/ml， puromycin：2μg/ml)，每3-5天换液一次以去除间质细胞、血管内皮细胞等，待细 胞稳定生长传代后进行下一步验证工作，共筛选得到14个高转移胰腺癌细胞株， 高转移的标准是与对照相比，同样数量的肿瘤细胞接种后，对照不能形成转移， 而筛选得到的能够在相同时间内形成转移灶，见下述表6。

表6

实施例5：基因突变与癌细胞转移的因果关系的验证

本发明的优势之一是能够直接对基因的功能进行验证，通过添加DOX来阻断 基因搜寻载体的作用，从而使得被突变的基因重新打开或者关闭；筛选得到具有 高转移性状的Aspc-1细胞通过体内接种直接验证。取20只4-6周龄的BALB/C裸 鼠，分成四组，每组5只；扩大培养高转移细胞株M45，消化细胞，利用PBS洗 3次，为减少小鼠的排斥反应，尽量去除血清，计数细胞；按2×10⁵/只进行小鼠 尾静脉注射10只，其中5只口喂强力霉素DOX(200μg/ml)，另五只不喂，每隔 三天换一次液；同时按2×10⁵/只进行小鼠脾脏注射10只，首先利用异戊巴比妥 (50mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，然后在腹部左侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹 壁，可见红色长条状脾脏，用镊子轻轻提起脾脏，沿脾脏纵轴方向进针，缓慢推 入细胞悬液100μl(2×10⁶/ml)，注射完成后拔出针头，将脾脏轻轻推回腹腔内， 缝合腹膜和皮肤；将小鼠放在温暖环境下直至小鼠苏醒，放回笼中继续饲养；观 察小鼠，待小鼠出现病态体征时，将其处死，解剖小鼠，肉眼观察小鼠各个脏器 转移情况；尾静脉注射主要观察肺部肿瘤转移，脾脏接种观察肝脏中肿瘤细胞的 转移情况，拍照记录后，取下各个器官，将其浸泡在4％福尔马林固定液中；待固 定完毕后进行石蜡切片-HE染色，显微镜下观察转移；取已固定的组织块，用LEICA ASP 200S自动脱水机脱水、透明、浸蜡、后用LECIA EG1500H包埋机包埋、在 LECIA EG1500C冷台上冷却、在LECIA RM2255切片机切片、贴片、烤片、最后 用LECIA Stainer XL自动染色机上进行HE染色，封片后观察，脱水，透明及浸蜡 程序(LEICA ASP 200S)如下：70％乙醇×1h，80％乙醇×1h，90％乙醇×1h，95％ 乙醇I×45min，95％乙醇II×45min，无水乙醇I×40min，无水乙醇II×40min， 二甲苯I×5min，二甲苯II×5min，蜡杯I×1h，蜡杯II×1h，蜡杯III×1h；HE 染色程序(LECIA Stainer XL)如下：二甲苯I×10min，二甲苯II×10min，无水 乙醇I×1min，无水乙醇II×1min，95％乙醇×1min，90％乙醇×1min，70％乙醇 ×1min，苏木精染色液×1min，盐酸乙醇×30s，氨水×30s，0.5％伊红染色液× 20s，80％乙醇×1min，90％乙醇×25s，95％乙醇×30s，95％乙醇×30s，无水乙 醇I×30s，无水乙醇II×1min，二甲苯I×2min，二甲苯II×2min；中性树胶封 片后观察。解剖后肉眼可见，未喂DOX的小鼠在肺上和肝上可见转移灶，而在饮 用水中添加DOX后，肺脏和肝脏的转移灶不明显，肉眼、切片HE染色结果见图 6和图7。

实施例6：候选基因的分子克隆

筛选到高转移性胰腺癌细胞株并进行功能验证后，下一步克隆基因搜寻载体 突变的基因。GSV的序列是已知，可通过Splinkette PCR的方法克隆出GSV周围 的序列，再通过blast比对(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？command＝start) 找到该位置的基因，进行Splinkette PCR实验中所用引物如下述表7所示：

表7：

按照基因组DNA提取试剂盒(威格拉斯，DNAVzol)说明书提取筛选到的细 胞株基因组DNA，利用Sau3AI酶切1μg基因组DNA，具体反应如下述表8所 示：

表8：

反应条件为：37℃酶切过夜；65℃失活20min后与接头(Adaptor)连接，各 取5μl SPL和SPR-Sau3 AI(100μm)，加入90μl水，加热至100℃反应10min后， 缓慢冷却至常温后的产物为接头，冻存至-20℃备用，连接反应具体如下述表9所 示：

表9：

反应条件为：16℃连接过夜；进行第一轮PCR反应，反应体系如下述表10 所示：

表10：

反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45s，68℃退火2min，反应30个循 环；94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸2min；反应34个循环；72℃延伸 5min。反应结束后进行第二步PCR反应，反应体系如下述表11所示：

表11：

反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性20s，61℃退火30s，72℃延伸1min， 反应40个循环；72℃延伸5min。反应结束后，琼脂糖凝胶回收PCR产物进行测 序；得到5’端和3’端DNA序列后，登录UCSC基因组浏览器进行Blat比对，定 位GSV在基因组上的位置，分析其引起转录的方向，以M45为例，见图8；克隆 的基因共19个，见上表。

参考文献：

1.Francis S.Collins，Eric D.Green，Alan E.Guttmacher & Mark S.Guyer.A vision for the future of genomics research Free access.Nature 422，835-847，2003

2.Hieter P.Boguski M.Functional genomics：It′s all how you read it.Science， 278：601-602.，1997

3.Gupta GP，Nguyen DX，Chiang AC，Bos PD，Kim JY，Nadal C，Gomis RR， Manova-Todorova K，Massague J.Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis.Nature.12；446(7137)：765-70，2007.

4.Minn AJ，Gupta GP，Siegel PM，Bos PD，Shu W，Giri DD，Viale A，Olshen AB， Gerald WL，Massague J.Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.Nature. 436(7050)：518-24，2005

5.Nicoloso MS，Spizzo R，Shimizu M，Rossi S and Calin GA：MicroRNAs-The micro steering wheel of tumour metastasis，Nature Review Cancer，doi：10.1038/nrc2619， Published online 5March 2009

6.Kuperwasser C，Bessain S，Bierbaum BE，Garnet D，Sperandio K，Gauvin GP， Naber SP，Weinberg RA and Rosenblatt M：A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone，Cancer Res 65：6130，2005.

7.Jones，S.et al.，Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses.Science 2008；321(5897)，1801-1806.

8.Russo G，Zegar C，Giordano A：Advantages and limitations of microarray technology in human cancer.Oncogene；22：6497-6507，2003

9.Fingleton，B Molecular targets in metastasis：lessons from genomic approaches. Cancer Genomics Proteomics，4(3)，211-21，2007

10.Yang J.Exploring the molecular basis of tumor.metastasis by microarray analysis.Assay Drug Dev.Technol；4：483-8，2006

11.Berns，K.et al.A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of the p53 pathway.Nature 428(6981)，431-437，2004.

12.Hermeking H.p53 enters the microRNA world.Cancer Cell，12(5)：414-8， 2007.

13.Blow，2008a N.Blow，RNAi technologies：a screen whose time has arrived， Nat.Methods 5，361-368，2008

14.Kaylene J.Simpson et al.Identification of genes that regulate epithelial cell migration using an siRNA screening approach.Nature Cell Biol.10，1027-1038，2008

15.Zender L，Lowe SW.An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer.28；135(5)：852-64.Cell 2008.

16.Bernards R.RNAi Delivers Insights into Liver Cancer.28；135(5)：793-5.Cell 2008.

17.Gumireddy K，Sun F et al.In vivo selection for metastasis promoting genes in the mouse.Proc Natl Acad Sci USA.2007 Apr 17；104(16)：6696-701.

18.Carlson CM，Largaespada DA.Insertional mutagenesis in mice：new perspectives and tools.Nat Rev Genet.2005 Jul；6(7)：568-80.

19.Li，L.and Cohen，S.N.tsg101：A novel tumor susceptibility gene isolated by controlled homozygous functional knockout of allelic loci in mammalian cells. Cell.1996；85，319-329.

20.Collier LS，Largaespada DA.Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.Nature.2005；14；436(7048)：272-6.

21.Neil，J.C.& Cameron，E.R.Retroviral insertion sites and cancer：fountain of all knowledge？Cancer Cell 2002；2，253-255.

22.Jonkers，J.& Berns，A.Retroviral insertional mutagenesis as a strategy to identify cancer genes.Biochim.Biophys.1996；Acta 1287，29-57.

23.Lund，A.H.et al.Genome-wide retroviral insertional tagging of genes involved in cancer in Cdkn2a-deficient mice.2002；Nature Genet.32，160-165.

24.Wu SC，Kaminski JM，piggy Bac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty，Tol2，and Mosl in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA.2006；10；103(41)：15008-13.

25.Ivics Z，Hackett PB，Plasterk RH，et al.Molecular Reconstruction of sleeping beauty，a Tc1-like transposon from fish，and its transposition in human cells.Cell，1997， 91(4)：501-510.

26.Ding，S，Wu，X，Li，G，Han，M.Efficient transposition of the piggy Bac(PB) transposon in mammalian cells and mice.Cell.2005；122，473-483.

27.Sheng Ding，Xiaohui Wu，Gang Li et al.Efficient transposition of the piggyBack(PB)transposon in mammalian cells and mice.Cell.2005；122：473-483

28.Matthew H Wilson Craig J Coates，Alfred L George Jr.piggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells.Molecular Therapy.2007；15：139-145

29.SCY Wu，YJJ Meir，CJ Coates et al.piggy Bac is a flexible and highly active transposon as compared to Sleeping Beauty，Tol2，andMosl in mammaliancells.PNAS.2006；103：15008-15013

30.Wei Wang，Allan Bradley，Yue Huang.A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated blm-deficient murine ES cells.Genome Research.2009；19：667-673.

31.Wang，W.et al.Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells.Proc.Natl Acad.Sci.USA.2008；105，9290-9295.

32.Jemal A，Siegel R，Ward E，Hao Y，Xu J，Thun MJ.Cancer Statistics.CA Cancer J Clin 2009；59：225-49.

33.Hezel AF，Kimmelman AC，Stanger BZ，et al.Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma.Genes & Dev，2006；20：1218-1249.

34.Sahai，E Illuminating the metastatic process.Nature Rev.Cancer 7，737-749， 2007

35.Fidler IJ.The pathogenesis of cancer metastasis：the′seed and soil′hypothesis revisited(Timeline).Nat Rev Cancer 3：453-458，2003

36.Nguyen DX，MassaguéJ.Genetic determinants of cancer metastasis.Nature Reviews Genetics 8，341-352，2007

37.Yusa K，Rad R，Takeda J，Bradley A.Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.Nat Methods.2009 May；6(5)：363-9.Epub 2009 Mar 31.

38.Gossen，M.，A.L.Bonin，and H.Bujard.1994.Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements.Trends Biochem.Sci. 18：471-475.16.Gossen，M.，and H.Bujard.1992.Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551.

39.BartoloméB，Jubete Y，et al.Construction and properties of a family of pACYC 184-derived cloning vectors compatible with pBR322 and its derivatives.Gene. 1991 Jun 15；102(1)：75-8.

40.Rad R，Rad L，et al.PiggyBac transposon mutagenesis：a tool for cancer gene discovery in mice.Science.2010 Nov 19；330(6007)：1104-7.Epub 2010 Oct 14.

41.Silva J，Nichols J，et al.Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell.2009 Aug 21；138(4)：722-37.