一种用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸亲和膜的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸亲和膜的制备方法，包括以下步骤：将聚砜中空纤维膜浸于氯甲基甲醚、四氯化锡和正己烷混合溶液中进行反应，得到带有活性基团的聚砜中空纤维膜；将带有活性基团的聚砜中空纤维膜浸于乙二胺中反应，得到带有间隔臂的聚砜中空纤维膜；将带有间隔臂的聚砜中空纤维膜置于磷酸缓冲液中，平衡后浸于醋酸钠水溶液与戊二醛水溶液的混合溶液中活化，得到活化后的聚砜中空纤维膜；将活化后的聚砜中空纤维膜浸于丝氨酸溶液中进行反应，得到偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜；将偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜浸于硼氢化钠溶液中还原，清洗烘干后得到聚砜丝氨酸亲和膜。本方法制备得到相容性好，特异性强的聚砜丝氨酸亲和膜。

说明书

技术领域

本发明涉及膜技术领域，具体涉及一种用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸 亲和膜的制备方法。

背景技术

脓毒血症(Sepsis)是现代医学上面临的棘手难题之一，存在着患病率高、 病死率高、治疗费用高的三高现象，在对患者的身体健康构成严重威胁的 同时，也为病人家属带来经济上的巨大压力。

脓毒血症的发生被公认与内毒素密切相关，内毒素(endotoxin)是革兰氏 阴性细菌细胞壁上的一种脂多糖分子，位于细胞壁的最外层，覆盖于细胞 壁的黏肽上。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细菌细胞后才 释放出来，内毒素对宿主有毒性，各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同， 可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。

内毒素通过与免疫细胞上的受体发生作用来激活人体免疫系统，产生 复杂的炎症反应，单纯使用抗生素无法阻断内毒素与免疫细胞之间的信号 传导作用，反而有可能因杀灭细菌而引起大量内毒素释放，从而加重炎症 反应，因此，目前脓毒血症仍缺乏有效的药物治疗手段。

近年来，研究者开始尝试通过亲和吸附的方法来降低病人血液中内毒 素浓度，从而达到治疗脓毒血症的目的。亲和膜由于具有选择性高、分离 速度快、易放大等优点，是一种合适的亲和吸附载体。

日本东丽公司开发的多粘菌素吸附柱(H.Shoji，et al.，Therapeutic  Apheresis and Dialysis，2(1)：3-12(1998))在提高脓血症重患者存活率方面取 得了一定效果，但由于多粘菌素价格昂贵，且具有毒性，因此未实现广泛 应用。

申请号为97103649.7的中国发明公开了一种带组氨酸配基尼龙亲和 膜，申请号为00123290.8的中国发明公开了一种用于内毒素去除的疏水荷 正电亲和膜，这两种亲和膜可以去除自来水、生理盐水及蛋白质溶液中的 内毒素，但基于静电作用力的配基(配基是亲和层析的核心物质，在分离 中特异性吸附欲分离物)，容易引起蛋白质的吸附，特异性不强，不适合用 于血浆或全血当中。

申请号为200910100567.5中国发明公开了一种以氨基酸为配基的聚偏 氟乙烯亲和膜，所偶联的氨基酸配基对血浆或全血中内毒素的去除率较高， 但聚偏氟乙烯材料并不是一种常见的医用材料，其在血液中的安全性尚不 明确。

聚砜材料是最常见的透析膜材料之一，其血液相容性得到了长期临床 数据的验证。由于聚砜材料对有机溶剂的耐受性差，不易改性，因此以聚 砜材料为载体的亲和膜研究很少，目前以聚砜中空纤维膜为载体的内毒素 吸附膜未见报道。

发明内容

本发明提供了一种用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸亲和膜的制备方法， 制备得到性能稳定，血液相容性好，对内毒素吸附特异性强的聚砜丝氨酸 亲和膜。

一种用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸亲和膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚砜中空纤维膜浸于氯甲基甲醚、四氯化锡和正己烷的混合溶 液中进行反应，得到带有活性基团的聚砜中空纤维膜；

(2)将带有活性基团的聚砜中空纤维膜浸于乙二胺中进行反应，得到 带有间隔臂的聚砜中空纤维膜；

(3)将带有间隔臂的聚砜中空纤维膜置于磷酸缓冲液中，平衡后浸于 醋酸钠水溶液与戊二醛水溶液的混合溶液中活化，得到活化后的聚砜中空 纤维膜；

(4)将活化后的聚砜中空纤维膜浸于丝氨酸溶液中进行反应，得到偶 联丝氨酸的聚砜中空纤维膜；

(5)将偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜浸于硼氢化钠溶液中还原，清洗 烘干后得到聚砜丝氨酸亲和膜。

具体反应过程见如下方程式：

聚砜中空纤维膜在四氯化锡的催化下，引入活性基团氯甲基，然后用 纯度大于99.8％的无水甲醇清洗，除去反应溶剂正己烷、未反应的氯甲基甲 醚以及催化剂四氯化锡，烘干除去无水甲醇，得到带有活性基团的聚砜中 空纤维膜。

将带有活性基团的聚砜中空纤维膜浸于乙二胺中反应，反应完毕后， 用去离子水清洗，除去未反应的乙二胺，得到带有间隔臂的聚砜中空纤维 膜。

将得到的带有间隔臂的聚砜中空纤维膜置于50mmol/L，pH7.4的磷酸 缓冲液中充分平衡，然后浸于醋酸钠水溶液与戊二醛水溶液的混合溶液中 活化，活化反应结束后，用去离子水冲洗，除去醋酸钠及未反应的戊二醛， 得到活化后的聚砜中空纤维膜。

将活化后的聚砜中空纤维膜浸于丝氨酸溶液中反应，丝氨酸溶液所用 溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的磷酸缓冲液，反应得到偶联丝氨酸的聚砜中空 纤维膜。

将偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜浸于硼氢化钠溶液中还原，硼氢化钠 溶液所用溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的硼酸缓冲液，反应完毕后，用1.0mol/mL 的NaCl溶液清洗，烘干后得到聚砜丝氨酸亲和膜。

作为优选，所述步骤(1)氯甲基甲醚、四氯化锡和正己烷的混合溶液 中氯甲基甲醚的摩尔分数为5～10％，四氯化锡的摩尔分数为5～10％，正己 烷的摩尔分数为80～90％。

改变所述氯甲基甲醚的摩尔分数可以改变聚砜亲和膜中引入活性基团 的数目，从而控制最终聚砜丝氨酸亲和膜上丝氨酸配基的接枝密度，氯甲 基甲醚的摩尔分数越高，则最终聚砜丝氨酸亲和膜上丝氨酸配基的接枝密 度越高，对内毒素的吸附能力越强，但受到聚砜中空纤维膜与氯甲基甲醚 反应能力的影响，氯甲基甲醚的摩尔分数需控制在合适范围内，保证氯甲 基甲醚的利用率。

作为优选，所述步骤(1)的反应时间为30～120min，反应温度为25～35℃。

在所述反应时间及反应温度下，氯甲基甲醚与聚砜中空纤维膜反应完 全，得到带有活性基团的聚砜中空纤维膜。

作为优选，所述步骤(2)的反应时间为30～120min，反应温度为25～35℃。

在所述反应时间及反应温度下，带有活性基团的聚砜中空纤维膜与乙 二胺充分反应，得到带有间隔臂的聚砜中空纤维膜。

作为优选，所述步骤(3)中醋酸钠水溶液的浓度为0.1～0.3mol/L，戊 二醛水溶液中戊二醛与水的体积比为1∶3，所述混合溶液中醋酸钠水溶液 与戊二醛水溶液的体积比为1∶1～3。

所述醋酸钠水溶液提供戊二醛的醛基与带有间隔臂的聚砜中空纤维膜 中氨基反应所需的碱性条件，提高反应的效率。

作为优选，所述步骤(3)的活化时间为2～3h，活化温度为25～35℃。

在所述反应时间及反应温度下，戊二醛中醛基与带有间隔臂的聚砜中 空纤维膜表面的氨基充分反应，得到活化后的聚砜中空纤维膜。

作为优选，所述步骤(4)中丝氨酸溶液中丝氨酸的浓度为2～8mg/mL， 所用溶剂为磷酸盐缓冲液。

所用丝氨酸的浓度依据所述步骤(1)中氯甲基甲醚的摩尔分数而定， 溶剂选用0.1mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液，在该pH条件下，丝氨酸可以很 好地溶解。

作为优选，所述步骤(4)中反应时间为20～24h，反应温度为25～45℃。

在所述反应时间及反应温度下，活化后的聚砜中空纤维膜表面的醛基 与丝氨酸中的氨基充分反应，得到偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜。

作为优选，所述步骤(5)硼氢化钠溶液中的硼氢化钠浓度为 0.5～2mg/mL，所用溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的硼酸缓冲液，可以很好地溶 解硼氢化钠。

所述硼氢化钠用于将偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜中的羰基还原为羟 基，所述硼氢化钠的浓度依据步骤(4)中丝氨酸的浓度而定。

作为优选，所述步骤(5)的还原时间为5～20min。

室温下，在所述还原时间内，所述硼氢化钠将偶联丝氨酸的聚砜中空 纤维膜中的羰基还原为羟基。

本发明用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸亲和膜的制备方法的优点：

(1)使用聚砜中空纤维膜为载体，聚砜中空纤维膜的物理化学性质稳 定，具有良好的血液相容性，且由于聚砜中空纤维膜具有较大的比表面积， 制成膜组件后容易放大；

(2)制备方法反应条件温和，步骤简单，制备得到的聚砜丝氨酸亲和 膜中丝氨酸配基接枝密度高达1.0～8.0μmol/cm²，且对聚砜中空纤维膜的机 械性能损伤小；

(3)以丝氨酸为配基，含有羟基、氨基、羧基等多个氢键位点，能通 过氢键作用与内毒素牢固结合，实现特异性吸附。

具体实施方式

实施例1

(1)将聚砜中空纤维膜浸没于混合均匀的5％(mol％)氯甲基甲醚、5％ (mol％)SnCl₄、90％(mol％)正己烷混合液中，在25℃下反应120min，所得 产物用无水甲醇清洗后烘干，得到带有活性基团的聚砜中空纤维膜；

(2)将带有活性基团的聚砜中空纤维膜浸于乙二胺中，在25℃下反应 10min，所得产物用去离子水清洗，得到带有间隔臂的聚砜中空纤维膜；

(3)将带有间隔臂的聚砜中空纤维膜置于50mmol/L，pH 7.4的磷酸 缓冲液中平衡30min，然后浸于0.1mol/L醋酸钠水溶液与25％戊二醛水溶 液(即戊二醛与水的体积比为1∶3)的混合溶液中，在25℃下活化150min， 醋酸钠水溶液与戊二醛水溶液的体积比为1∶1，活化完成后，所得产物用 去离子水清洗，得到活化后的聚砜中空纤维膜；

(4)将活化后的聚砜中空纤维膜浸于5mg/mL的丝氨酸溶液中(所用 溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的磷酸缓冲液)，在25℃条件下反应24h，得到偶 联丝氨酸的聚砜中空纤维膜；

(5)将偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜浸于浓度1mg/mL的NaBH₄溶液 (所用溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的硼酸缓冲液)中还原15min，用1.0mol/L 的NaCl溶液清洗，烘干后得到聚砜丝氨酸亲和膜。

所得聚砜丝氨酸亲和膜上丝氨酸配基密度为3.07μmol/cm²(利用茚三 酮显色法测定反应前后丝氨酸溶液中的丝氨酸浓度，计算获得聚砜丝氨酸 亲和膜上丝氨酸配基密度)。

分别在去离子水和脓毒血症患者血浆中使用本实施例制备得到的聚砜 丝氨酸亲和膜进行静态吸附，使用鲎试剂法检测吸附前后内内毒素浓度获 得内毒素的吸附量。

为了避免外部内毒素对实验的干扰，实验中所用到的器具均需除热原， 其中玻璃器置于400℃下干烤4小时，非玻璃器具在30％H₂O₂中浸泡4小 时，所用聚砜丝氨酸亲和膜用含有20％乙醇的0.1mol/L NaOH溶液，0.5％ 脱氧胆酸钠溶液，1.5mol/L NaCl溶液和无热原水依次冲洗2小时。

所用聚砜丝氨酸亲和膜的面积为2cm²，去离子水及血浆体积均为5ml， 静态吸附时间为30min，内毒素去除效率(即被聚砜丝氨酸亲和膜吸附的内 毒素量与原始内毒素量的百分比)见表1。

表1实施例1制备得到的聚砜丝氨酸亲和膜性能

  溶液体系   去离子水   血浆   内毒素去除率   37.6％   33.4％

实施例2

(1)将聚砜中空纤维膜浸没于混合均匀的7.5％(mol％)氯甲基甲醚、 7.5％(mol％)SnCl₄、85％(mol％)正己烷混合液中，在35℃下反应60min， 所得产物用无水甲醇清洗后烘干，得到带有活性基团的聚砜中空纤维膜；

(2)将带有活性基团的聚砜中空纤维膜浸于乙二胺中，在25℃下反应 15min，所得产物用去离子水清洗，得到带有间隔臂的聚砜中空纤维膜；

(3)将带有间隔臂的聚砜中空纤维膜置于50mmol/L，pH 7.4的磷酸 缓冲液中平衡30min，然后浸于0.1mol/L醋酸钠水溶液与25％戊二醛水溶 液(即戊二醛与水的体积比为1∶3)的混合溶液中，在30℃下活化60min， 醋酸钠水溶液与戊二醛水溶液的体积比为1∶1.5，活化完成后，所得产物 用去离子水清洗，得到活化后的聚砜中空纤维膜；

(4)将活化后的聚砜中空纤维膜浸于2mg/mL的丝氨酸溶液中(所用 溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的磷酸缓冲液)，在40℃条件下反应24h，得到偶 联丝氨酸的聚砜中空纤维膜；

(5)将偶联丝氨酸的聚砜中空纤维膜浸于浓度1.5mg/mL的NaBH₄溶 液(所用溶剂为0.1mol/L，pH 7.2的硼酸缓冲液)中还原10min，用1.0mol/L 的NaCl溶液清洗，烘干后得到聚砜丝氨酸亲和膜。

所得聚砜丝氨酸亲和膜上丝氨酸配基密度为7.25μmol/cm²(利用茚三 酮显色法测定反应前后丝氨酸溶液中的丝氨酸浓度，计算获得聚砜丝氨酸 亲和膜上丝氨酸配基密度)。

分别在去离子水和脓毒血症患者血浆中使用本实施例制备得到的聚砜 丝氨酸亲和膜进行静态吸附，实验方法同实施例1，内毒素去除效率(即被 聚砜丝氨酸亲和膜吸附的内毒素量与原始内毒素量的百分比)见表2。

表2实施例2制备得到的聚砜丝氨酸亲和膜性能

  溶液体系   去离子水   血浆   内毒素去除率   75.6％   67.9％