调控基因在病原体诱导状况下表达的FGI2启动子及其应用

摘要

本发明涉及调控基因在病原体诱导状况下表达的FGI2启动子及其应用。本发明首次分离到一个能够响应病原体侵染信号，并调节目的基因特异性表达的启动子。所述的启动子对于在病原体侵染状态下调节目的基因的表达以改变植物的抗病性是非常有用的。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及调控基因在病原体诱导状况下表达的FGI2启动子及其应用。

背景技术

植物启动子在调控植物基因表达中起关键的作用，可控制植物在特定组织、发育阶段及不同环境条件中表达。启动子按其功能分可分为组成型启动子、组织特异性启动子与诱导特异性启动子。在作物抗病方面，目前国际上主流观点认为组成型启动子表达任何抗病基因，都会导致植物处于抗病防御状态(mode)，使植物防御系统优先获得能量与资源分配从而影响植物产量等经济性状。而这也被认为是目前采用转基因手段的抗病应用尚未成功的原因。解决这一问题的一个合理方法是采用诱导特异性启动子，控制抗病基因只在病原菌侵入的时候表达(Gurr，S.J.，and Rushton，P.J.(2005a).Engineering plants withincreased disease resistance：what are we going to express？Trends inBiotechnology 23，275-282)。

病程相关蛋白(Pathogenesis-Related Proteins，PRs蛋白)是指植物在病理或病理相关的环境下诱导产生的一种或几种蛋白质，植物病原细菌、真菌、病毒和类病毒都可以诱导病程相关蛋白生成，类似病原物效果的化合物和能诱导相似胁迫条件的化合物也能诱导植物合成病程相关蛋白，自然老化时合成的有关酶也都属于病程相关蛋白(刘利华等，1999)。最早的PR蛋白是Gianinazzi等(Gianinazzi，S.，Pratt，H.M.，Shewry，P.R.，and Miflin，B.J.(1977).Partial-Purification and Preliminary Characterization of Soluble Leaf ProteinsSpecific to Virus-Infected Tobacco Plants.J Gen Virol 34，345-351)和Vanloon等分别在烟草中发现的，研究者们在受烟草花叶病毒TMV侵染的烟草中检测到这类蛋白，命名为病程相关蛋白。后来陆续在番茄、马铃薯等多种植物中发现。玉米的病程相关蛋白又称PRms(m代表maize)，对玉米幼苗进行病原真菌(Fusarium moniliforme)的侵染，在真菌侵染的玉米胚根中能检测到PRmsmRNA。现已发现吸水萌发的玉米种子、胚根及玉米幼苗叶片经病毒、病原真菌、氯化汞或水杨酸等化合物诱导后均可产生PRms，并且不同的诱导因子作用后诱导的PRms各不相同(郭红莲，陈捷，高增贵(1999).玉米病程相关蛋白(PRm)的研究进展.沈阳农业大学学报，30(3)，372-374)。玉米中不含甲壳素几丁质，只含少量的葡聚糖，但几丁质和葡聚糖是除卵菌纲外绝大多数真菌和细菌的主要组成成分。健康植株中存在少量或不存在几丁质酶和葡聚糖酶，但在受侵染诱发后可积累至40-100倍，说明PRms在抗病反应中起作用。离体实验证明，PRms单独或协同作用可以抑制Fusarium moniliforme、Trichoderma recseian和Aspergillus等几种玉米常见病原菌。组织学观察也证明PRms可能在玉米抗病中起作用，在萌发的玉米种子受Aspergillus侵染时，不亲和的PRms积累要早于亲和型的，说明不亲和反应诱导出PRms抑制病菌侵入，而亲和反应虽可侵入但也可能阻止其扩展，而且组织学上也发现病菌作用后主要集中在与真菌接触的植物细胞壁的表面(Murillo，I.，Cavallarin，L.，and SanSegundo，B.(1997).The maizepathogenesis-related PRms protein localizes to plasmodesmata in maize radicles.Plant Cell 9，145-156)。但玉米中PRms的启动子构建及功能在本领域中至今未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控基因在病原体诱导状况下表达的FGI2启动子及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的启动子，所述的启动子：

(a)分离自病程相关蛋白编码基因的上游；

(b)碱基长度为800-2000个；

(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且

(d)具有响应病原体侵染信号并启动目的基因特异性表达功能。

在另一优选例中，所述的病程相关蛋白来源于玉米。

在另一优选例中，所述的启动子含有TATA-盒结构。

在另一优选例中，所述的植物是禾本科植物。

在另一优选例中，所述的启动子的碱基长度为1000-1800个。

在另一优选例中，所述的启动子的碱基长度为1100-1500个。

在另一优选例中，所述的启动子是：

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的启动子；

(2)核苷酸序列与SEQ ID NO：1有95％以上相同性且具有响应病原体侵染信号并启动目的基因特异性表达功能的启动子；

(3)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)-(2)任一限定的多核苷酸序列杂交且具有响应病原体侵染信号并启动目的基因特异性表达功能的多核苷酸；或

(4)核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列完全互补的启动子。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的启动子。

在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的启动子可操作地连接的目的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因编码具有特定功能的蛋白。

在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是是抗真菌蛋白基因、病程相关蛋白基因。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子区直接邻近的编码基因的序列。通常，所述启动子与目的基因的间隔小于1000bp(优选的，小于500bp；更优选的，小于100bp；最优选的，小于50bp)。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞：

含有所述的载体；或

其基因组中整合有外源的启动子。

在本发明的另一方面，提供一种制备能响应病原体侵染信号的植物方法，所述的方法包括：将构建物转化植物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因，所述目的基因在病原体侵染状态下表达。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；

(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞、组织或器官；

(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及

(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织或器官再生成植物，所述植物中目的基因在病原体侵染状态下表达。

在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，所述的启动子用于响应病原体侵染信号并启动目的基因特异性表达。

在另一优选例中，所述的病原体是植物病原体。

在另一优选例中，所述的病原体选自但不限于：细菌、真菌。

在另一优选例中，所述的病原体选自但不限于：禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)菌、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、pTG-19T-FGI2 promoter载体图谱(载体图谱中启动子标示为Fgi-2promoter)。

图2、pCAM-FGI2 promoter表达载体图谱(载体图谱中启动子标示为Fgi-2promoter)。

图3、转Fgi-2promoter::GUS基因水稻叶片经禾谷镰孢诱导后GUS活性检测。A：T0代叶片侵染；B：T0代叶片水对照；C：T1代胚芽鞘侵染；D：T 1代胚芽鞘水对照；E：野生型叶片侵染；F：野生型叶片水对照；G：35S启动子驱动GUS转基因植株叶片侵染；H：35S启动子驱动GUS转基因胚芽鞘侵染。

图4A、不同病原菌以及对照诱导下，转Fgi-2promoter::GUS基因水稻的相对GUS酶活性比较。

图4B、不同病原菌以及对照诱导下，转Fgi-2promoter::GUS基因水稻中，Fgi-2启动子诱导表达倍数比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离到一个能够响应病原体侵染信号，并调节目的基因特异性表达的启动子。所述的启动子对于在病原体侵染状态下调节目的基因的表达以改变植物的抗病性是非常有用的。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，所述的“植物(或作物、农作物)”包括任何种类的植物，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于：禾本科的水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为本发明的优选方式，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦。

如本文所用，除非另外说明，所述的“病原体”是指侵染植物的微生物，通常是对植物有害的微生物，导致植物发生病虫害。所述的病原体例如是病原真菌、病原细菌、植物病毒、疫霉、线虫。更具体的，所述的病原体选自：病原真菌禾谷镰孢(Fusarium graminearum)菌(本文中也简称为禾谷镰孢，又被称为玉蜀黍赤霉Gibberella zeae)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)等。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织和/或特定的状态表达。所述的“在病原体诱导状况下表达的启动子”是指在这类启动子调控下，目的基因在病原体侵染的进程(包括病原体起始侵染的时候)中特异性表达，而在没有病原体侵染的状态下不表达。

通常，如果在特定状态(本文中该特定状态一般指病原体侵染的状态)下mRNA以比在其它状态(如没有病原体侵染的状态)下高至少5倍，优选至少10倍，更优选至少高50倍水平被表达，则该启动子被认为是在特定的时间和/或特定状态下特异性驱动目的基因表达的。

由于mRNA还只是基因表达中间产物，蛋白质才是基因表达的终产物。因此，更优选的情况下，检测蛋白质产物(例如GUS)的活性，如果在受到病原真菌侵染情况下比未受病原真菌侵染时蛋白活性上升3倍以上，较佳地5倍以上，更佳地10倍以上，则该启动子被认为是更有应用价值的在特定的时间和/或特定状态下特异性驱动目的基因表达的。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。

如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子启动或指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于：改良植物抗病性、性状或代谢相关的基因。合适的目的基因包括但不限于：抗真菌蛋白编码基因、病程相关蛋白基因(pathogenesis-related genes，PR1-PR17)。具体的病程相关蛋白包括PR-1(cysteine-rich secretary protein富含半胱氨酸分泌蛋白)、PR-2β-1，3-glucanase葡聚糖酶、PR-3 Chitinase几丁质酶、PR-4 Chitinas几丁质酶、PR-5Thaumatin-like甜蛋白类似、PR-6 Proteinase-inhibitor I蛋白酶抑制剂、PR-7Endoproteinase蛋白内切酶、PR-8 chitinase type III几丁质酶、PR-9lignin-forming peroxidase过氧化物酶、PR-10Ribonuclease-like核糖核酸酶类似蛋白、PR-11 Chitinase几丁质酶、PR-12 Defensin防御素、PR-13 Thionin硫素、PR-14 Lipid-transfer protein转脂蛋白、PR-15 Oxalate oxidase草酸氧化酶、PR-16 OxOLP Oxalate-oxidase-like草酸氧化酶类似蛋白等，或可参见van Loon，L.C.，M.Rep，et al.(2006).″Significance of inducible defense-related proteins ininfected plants.″Annu Rev Phytopathol 44：135-62。所述的目的基因还可以是H.Wongand T.B.Ng，Gymnin，a potent defensin-like antifungal peptide from theYunnan bean Gymnocladus chinensis Baill，Peptides 24(2003)，pp.963-968.2；Benhamou N，Broglie K，Broglie R，Chet I.Antifungal effect of bean endochitinaseon Rhizoctonia solani：ultrastructural changes and cytochemical aspect of chitinbreakdown.Can J Microbiol 1993；39：318-28.3；Broekaert WF，Van Parijs J，Leyns F，Joos H，Peumans WJ.A chitin-binding lectin from stinging nettlerhizomes with antifungal properties.Science 1989；245：1100-2中报道的。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“FGI2”、“FGI-2”可互换使用。

启动子

本发明提供了一种在病原体侵染状态下特异性表达的启动子，所述的启动子具有以下特点：(a)分离自可能的病程相关蛋白(本文中简称为FGI2或PRms)编码基因的上游；(b)碱基长度为800-2000个；(c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；且(d)具有响应病原体(如真菌)侵染信号并启动目的基因特异性表达功能。作为本发明的一种实施方式，所述的启动子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的启动子。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列(如SEQ ID NO：1)杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述的多核苷酸(如SEQ IDNO：1)可杂交的多核苷酸。

“严格条件”(或“严紧条件”)是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有响应病原体侵染信号的功能。

本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上，如98％、99％)相同性的核酸，所述核酸也具有响应病原体侵染信号并启动目的基因特异性表达功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。

应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于玉米的该启动子及其功能，然而，来源于其它类似的植物的与该启动子具有一定相同性(保守性)的启动子也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。

在本发明的具体实施例中，以玉米基因组DNA为模板，运用PCR的方法克隆了本发明的启动子序列，将其构建至带有融合基因GUS的植物表达载体pCAMBIA1300上，通过农杆菌介导的水稻遗传转化，获得FGI2promoter::GUS转基因植株，对FGI2启动子进行了启动活性及病原菌诱导性分析。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性，表明该启动子具有启动活性。在幼苗生长时期，其根与叶均未检测到GUS活性，表明在一般生长条件下，FGI2启动子不驱动下游基因表达；而在禾谷镰孢(Fusarium graminearum)菌侵染后，FGI2启动子驱动的GUS活性有上调表达。因此认为FGI2启动子具有驱动GUS基因在受到病原真菌侵染早期诱导表达的启动活性。

启动目的基因表达

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种功能性或结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有抗病原体功能的蛋白。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。

作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。

作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。当用于植物时，其也可以是一种真核表达载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。一些载体的选择是本领域技术人员可以获知的。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、小麦、玉米、拟南芥、烟草、果树等等。

在本发明的实例中，所述的重组载体是pCAMBIA载体，其自带β-葡萄糖苷酶(GUS)基因，将本发明的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活GUS基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。β-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。通常本领域已经达成如下共识：若是一种启动子能够驱动GUS基因表达，则其也能够驱动GUS基因以外的其它目的基因的表达。

应用

根据本发明的实施例，通过激光显微切割技术获取受禾谷镰孢侵染早期的玉米细胞，从中抽取微量的RNA经线性扩增得到数十微克cRNA进行基因表达差异分析(RT-PCR，real-time-PCR和芯片多种手段)。对比受禾谷镰孢侵染早期的玉米细胞与和未受禾谷镰孢侵染的同类型玉米细胞的基因表达，发现一个受诱导表达上调的基因，本发明人定名为FGI2，其编码PRms。

根据本发明的实施例，本发明所述的FGI2，其对应玉米病程相关蛋白基因(PRms)，该玉米病程相关蛋白基因的GenBank登录号是X54325。本发明人以玉米基因组DNA为模板，运用PCR的方法克隆了FGI2启动子序列，将其构建至带有融合基因GUS的植物表达载体pCAMBIA1300上，通过农杆菌介导的水稻遗传转化，获得多株FGI2promoter::GUS转基因植株，对FGI2启动子进行了启动活性及病原菌诱导性分析。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性，表明该启动子具有启动活性。在幼苗生长时期，其根与叶均未检测到GUS活性，表明在一般生长条件下，FGI2启动子不驱动下游基因表达；禾谷镰孢侵染后，FGI2启动子驱动的GUS活性有上调表达。因此认为FGI2启动子具有驱动GUS基因在受到病原真菌侵染早期诱导表达的启动活性。

根据本发明的实施例，本发明的启动子驱动GUS报告基因的转基因水稻的叶片在未受侵染时经GUS染色未见GUS基因表达，受侵染时经GUS染色显示可见表达。以35S启动子驱动GUS报告基因的转基因水稻，未受侵染时经GUS染色显示可见表达。本发明的启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。

本发明可广泛应用于植物基因工程：启动子作为植物基因工程中一个重要工具可与目标基因融合，通过转基因载体，转化植物并获得转基因植株。在植物受到病原体侵害(侵染)时，该启动子便会启动下游目标基因(可以是感兴趣的任何可以改变农艺性状的功能基因，特别是抗病原体侵害的基因)的表达，从而达到在病原体侵害状态下控制某一功能基因表达的目的。

本发明得到的启动子可以用于转基因农作物(如水稻、玉米等)中驱动特定的其它基因(如抗病原体基因)，使该基因在转基因植株受病原体侵染早期表达，从而达到在有病原体威胁时发挥抗病虫害保产的作用，而在无病害威胁时保持关闭有利于能量和营养的分配向高产倾斜。用本发明的启动驱动植物抗病原体基因，可在受到病原体侵染时，迅速作出反应，防御病原体的侵染，从而更有效的在发病早期及时阻止发病，同时又区别于组成型表达启动子，可在抗病原体的同时而又不影响农作物的产量。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的启动子属于特异型启动子。它在植物受到病原体侵染的状态下，响应侵染信号，才启动下游基因表达，而在植物未受到病原体侵染的状态下表达量很低或不表达，其既能使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又减少该表达对植物的不利影响。

(2)目前在作物抗病方面多采用的是一些组成型表达的启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米ubiquitin启动子，本发明得到的启动子比这些组成型表达启动子更特异。该启动子只在作物受到侵染时表达，而在作物正常时期不表达。

(2)本发明的启动子具有响应迅速的特性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料与方法

材料

玉米品种B73购自The Maize Genetics Cooperation Stock Center(美国University of Illinois)或参见Schnable，P.S.，D.Ware，et al.(2009).″The B73maize genome：complexity，diversity，and dynamics.″Science 326(5956)：1112-5，水稻品种“中花11”(Oryza sativa japonica Zhonghua 11)参见中国专利200510110629.9、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)菌株PH-1购自FungalGenetics Stock Center(http://www.fgsc.net/)参见Cuomo，C.A.，U.Guldener，et al.(2007).″The Fusarium graminearum genome reveals a linkbetween localized polymorphism and pathogen specialization.″Science 317(5843)：1400-2；稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株ZB15由中国科学院遗传和发育研究所提供；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105参见Hood，E.E.等，1993，New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgen.Res.2：208-218；pCAMBIA1300质粒购自CAMBIA公司；pTG-19T质粒购自TaRaKa公司。试验用抗生素浓度为卡那霉素(Kan)50μg/ml、氨苄青霉素(Amp)100μg/ml。限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等为TaRaKa公司产品；5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)购自前程生物科技公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)购自鼎国生物科技公司。

PRms基因表达检测

设计一对RT-PCR引物检测基因表达情况：

FGI2RT-PCR primerF 1：GCAACATCGCCGGGATGAAG(SEQ ID NO：4)；

FGI2RT-PCR primerR1：ATGCGCTGCAACAAGCTCGT(SEQ ID NO：5)。

FGI2启动子的克隆与序列分析

根据FGI2基因序列，设计了分别含有HindIII和BamHI酶切位点的FGI2基因启动子的上下游引物：

FGI2promoter primer F：5’-GAGAAAGACCAGCGGGAAGA-3’(SEQ IDNO：6)；

FGI2promoter primer R：5’-TTGTAGAAGCTGCTACCTAGGGAG-3’(SEQID NO：7)。

参照《分子克隆：实验室指南》上CTAB法提取玉米叶片总DNA。以玉米总DNA为模板，以前述上下游引物PCR扩增FGI2启动子序列，连接至pTG-19T质粒，转化E.coli DH5-α感受态细胞，蓝白斑筛选获得重组质粒。送至博尚测序公司进行序列测定。测序结果至http://www.ncbi.nlm.nih.gov/与http://www.maizesequence.org/进行比对。

FGI2(Fgi-2)promoter::GUS表达载体的构建和转化

将克隆的FGI2启动子片段用HindIII和BamHI酶切，回收后与pCAMBIA1300的HindIII和BamHI酶切载体进行连接，得到FGI2启动子与GUS基因融合的表达载体FGI2promoter::GUS；通过冻融法将表达载体转入根癌农杆菌EHA105菌株中。取授粉后12-15天的水稻未成熟种子用70％(v/v)酒精消毒1min，再用2％(v/v)次氯酸钠溶液消毒90min以上，无菌水冲洗4-5次；取幼胚在诱导培养基上26℃暗培养7天左右诱导得到愈伤组织备用。参照Hiei等的方法(Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.，and Kumashiro，T.(1994).EfficientTransformation of Rice(Oryza-Sativa L)Mediated by Agrobacterium andSequence-Analysis of the Boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6，271-282)，进行农杆菌介导的遗传转化、转化子筛选和转基因植株再生。

病原菌诱导处理

选取T0代苗期根与叶没有GUS表达的FGI2promoter::GUS转基因株系进行病原菌诱导验证启动子功能，诱导取两个时期：种子萌发期与苗期。

种子萌发期采取胚芽鞘侵染法，对转基因植株T 1代进行启动子功能验证。取播种约2天的芽鞘作处理，以棉花棒蘸取1.0％(w/v)明胶溶液均匀涂在芽鞘周围，剪去芽鞘顶端叶尖约1-2mm，造成伤口。取棉条包裹在芽鞘伤口处，在棉条上接种禾谷镰孢(Fusarium.graminearum)菌株PH-1(菌悬浮浓度为1×10⁸cfu/ml)，以水处理做对照，置于25℃温度，75-100％湿度的培养箱培养，4-7天后对FGI2promoter::GUS转基因植株T1代进行GUS活性检测，设置3次重复实验。

苗期采取剪叶侵染法，对FGI2promoter::GUS转基因植株的T0代及T1代进行启动子功能验证。取生长约8周的转基因水稻叶片，使用尖头镊子划伤叶片背部，从叶脉剪开，一半以PH-1(菌悬浮浓度为1×10⁸cfu/ml)做接种处理，另一半水处理对照。野生型“中花11”水稻作为阴性对照，35S启动子驱动GUS转基因植株作为阳性对照。48小时后，对处理后的水稻叶片进行GUS活性检测，设置3次重复实验。

GUS活性检测

定性方法：参照Jefferson的方法(Jefferson，R.A.(1987).Assaying chimericgenes in plants：the GUS gene fusion system.Plant Molecular Biology Reporter 5，387-405)，对水稻组织进行染色和GUS活性检测。在37℃下染色8小时，用95％(v/v)乙醇脱色处理至阴性对照材料呈白色。显微镜下观察拍照保存。

定量测GUS活性：参照Jefferson的方法并经优化如下：

1.试剂配制

1)GEB(GUS抽提缓冲液)100ml

4℃保存。

2)stop buffer：0.2M Na₂CO₃(21.2g溶解于1LddH₂O中)；

2.1g无水Na₂CO₃溶于100ml ddH₂O，室温保存。

3)1mM 4-MU stock solution(加热溶解)

9.9mg 4-MU(4-甲基伞形酮)溶于50ml ddH₂O，4℃避光保存。

4)1μM 4-MU working solution

10.87μl 1mM 4-MU stock solution溶于10ml ddH₂O，4℃避光保存。

5)20mM 4-MUG

2.1mg 4-MUG(4-甲基伞形酮β-D-葡糖苷酸)溶于200μl ddH₂O，4℃避光保存(加热溶解)。

2.步骤

1)取受侵染部位的水稻叶片100mg，液氮研磨，溶于500μl GEB，冰浴中研磨完全，4℃14000rpm离心10min，取上清液用于GUS活性及蛋白浓度的测定。若有必要可重复离心一次。

2)将20mM底物4-MUG溶液50μl加入430μl GEB中，37℃水浴预热后加入20μl上清液，继续在37℃水浴中反应并开始计时，60min后取100μl反应液加入1.9ml stop buffer中终止反应，室温黑暗中保存，准备测荧光。

3)取100μl待测样品加入ELISA板中，每个样品设3个重复，以stop buffer为空白对照。

4)取1μM 4-MU working solution，稀释成0、5、15、30μMol/L各取100μl反应液加入1.9ml stop buffer中终止反应制作标准曲线。

5)使用BioTek Synergy2多功能酶标仪测定，发射波为460nm，吸收波为360nm下检测荧光值。根据标准曲线计算GUS活性。

II.实施例

实施例1、植物在病菌侵入或未侵入时内源FGI2基因表达

本发明人用Real-Time PCR检测了植物内源的FGI2基因在被禾谷镰孢侵入或未侵入情况下的表达情况。

通过实时反转录PCR检测激光显微切割获得的受到禾谷镰孢侵染一天的玉米茎杆细胞(感染组织1：与被禾谷镰孢侵入的细胞相邻的附近细胞，尚未直接被禾谷镰孢侵入；感染组织2：直接被禾谷镰孢侵入的细胞)，与经水假接种(Mock)的同类玉米茎杆细胞相比，FGI2基因表达水平均上升50-200倍(1st，2nd，3rd代表三次独立实验数据)。

结果见下表1。

表1、FGI2基因表达检测结果

实施例2、FGI2启动子的克隆及序列分析

根据基因组序列设计FGI2启动子引物，扩增了翻译起始位点前的上游1293bp的玉米DNA片段，命名为FGI2promoter。

用以克隆启动子的专一性引物序列如下：

FGI2promoter primer F：5’-GAGAAAGACCAGCGGGAAGA-3’(SEQ IDNO：8)；

FGI2promoter primer R：5’-TTGTAGAAGCTGCTACCTAGGGAG-3’(SEQID NO：9)。

克隆的启动子序列(1305bp)经测序验证如下(SEQ ID NO：1)：

AAGCTTGAGAAAGACCAGCGGGAAGAGAGAACGATGCGCGGGAGATATTTTTGTTCCGAGCTCGGTGCTAAGATCTACGACGCCGAGCTCGGGCCACGTCGACGCCACGTCGGCCCTCGCTAGCGAGCGCTGCAGCTAACTCGGTGCCAAGATCTATAGCGTGAGTTGTGTTAGCTCAGTGCCACGTCTCTTGGCGCCAAGCAAAGGGCCTAAAACTGCTATTAAGTATTCTAAGGGTCTAAACGTGAATATTTTTCATAAAATAGGCTAAAATACAAAAAAAATCAGGAGGTTCGCTGTGCTGCGAACAGAGGTGCGAGCGAATATAATAGGATGTTTGTGTAGTAATAAGCTAGTGTATTATCTTCTTAATCCTTACTTTTTTATTTGGTTTGTGAAATAGAATGAGGGCACGTTTGGTTTGATGGACTAAAGATTAGTCCCTCCATTTTAGTCTCATTTAATCCTTAAAAACGGTGGGACTAAAACAGAGACGACTAAACTGTTTTAGTCTCTAGTCCCTAAAGGGATGACTAAAAGGGACTAAACTATATAAATACCACTTTTTTACCCCTCTTTTATTTCAGTTGCACTAATGGTATGAGAATGCCAAAGGGTATTTCAGTCCTCTTATGATTCATTTAATATGTTTTGAATACTTTTAGTCCCTATAACCAAACAAGGTAGAGACTAAACTTTAGACTCTTAATTAAATTTTAGTTCATGGACTAAAGGAACCAAACAAGCCCTGAGTCGATCCATAACCATCTCATCTCATTCCTTATAGTTAGTTAGTTTGTTAGTTAACACTAATATAAGAAATGCGGTCACCTACTAAAGCTGAGAGACTCATGATGCACAACATCGCTGAATGTCGTCAGTTCAAACTTTACACGTTCGTAACAGAAATACAGATAAGAATGCATCTTATCCGTTTGACTTCAACTGCATTTTAGACTAGACAGCATGCACGAATTGACCATTCCATGAGGTCCTTTGATCTGTACAATATATAAATGCACCTAACAGAATCAAAGTTGCCTCAACGCTATGCATGTCCTGTTCGTGGAATTCTATTGAACTCATACGTAGAAAAGATTGGCATGCCGGCCATATTTTCGTGCAACGGGACTATTTTTCCAAGCATACTGGAGAAAATTCACATGCTCTCCACTATTAATAGCCCCCACATATTTGCAGTATAGCATCCACAAATTAAACTCACGCACACACACAATTAGGTCACATACACACATCCCGGCTGCCTCCCTAGGTAACAGCTTCTACAAGGATCC

以上序列中，含有预测的TATA盒、盒，以及W-box(Eulgem T，Rushton PJ，Schmelzer E，Hahlbrock K，Somssich IE(1999)Early nuclear events inplant defence signalling：rapid gene activation by WRKY transcription factors.EMBO J 18：4689-4699)。

将所述的FGI2promoter连接到pTG-19T载体的的T/A接头之间，经筛选获得重组载体pTG-19T-FGI2promoter(图1)。序列分析表明，克隆的FGI2promoter序列与Schnable，P.S.，D.Ware，et al.(2009).″The B73 maize genome：complexity，diversity，and dynamics.″Science 326(5956)：1112-5报道的基因组中相应区域的序列一致。

一段878bp碱基长的FGI2启动子截短体(FGI2S)以同样方法得到并构建载体用于转基因水稻启动子分析。(FGI2S启动子比FGI2启动子(SEQ ID NO：1)在5’端减少了427碱基。FGI2S序列如下(SEQ ID NO：2)：

AAGCTTAGATTAGTCCCTCCATTTTAGTCTCATTTAATCCTTAAATTGCCAAACGGTGGGACTAAAACAGAGACGACTAAACTGTTTTAGTCTCTAGTCCCTAAAGGGATGACTAAAAGGGACTAAACTATATAAATACCACTTTTTTACCCCTCTTTTATTTCAGTTGCACTAATGGTATGAGAATGCCAAAGGGTATTTCAGTCCTCTTATGATTCATTTAATATGTTTTGAATACTTTTAGTCCCTATAACCAAACAAGGTAGAGACTAAACTTTAGACTCTTAATTAAATTTTAGTTCATGGACTAAAGGAACCAAACAAGCCCTGAGTCGATCCATAACCATCTCATCTCATTCCTTATAGTTAGTTAGTTTGTTAGTTAACACTAATATAAGAAATGCGGTCACCTACTAAAGCTGAGCAATAGACTCATGATGCACAACATCGCTGAATGTCGTCAGTTCAAACTTTACACGTTCGTAACAGAAATACAGATAAGAATGCATCTTATCCGTTTGACTTCAACTGCATTTTAGACTAGACAGCATGCACGAATTGACCATTCCATGAGGTCCTTTGATCTGTACAATATATAAATGCACCTAACAGAATCAAAGTTGCCTCAACGCTATGCATGTCCTGTTCGTGGAATTCTATTGAACTCATACGTAGAAAAGATTGGCATGCCGGCCATATTTTCGTGCAACGGGACTATTTTTCCAAGCATACTGGAGAAAATTCACATGCTCTCCACTATTAATAGCCCCCACATATTTGCAGTATAGCATCCACAAATTAAACTCACGCACACACACAATTAGGTCACATACACACATCCCGGCTGCCTCCCTAGGTAACAGCTTCTACAAGGATCC

将所述的FGI2S promoter连接到pTG-19T载体的的T/A接头之间，经筛选获得重组载体pTG-19T-FGI2S promoter。

实施例3、融合基因表达载体的构建和转化

用HindIII和BamHI酶切重组质粒pTG-19T-FGI2promoter，回收克隆片段，与pCAMBIA1300的HindIII和BamHI双酶切质粒载体部分连接，经转化和酶切验证，获得FGI2promoter::GUS融合基因质粒Fgi-2promoter::p1300GN(图2)。通过冻融法，将获得的重组表达载体转化农杆菌EHA105菌株，并经质粒酶切分析，得以确证。已获得的克隆经DNA测序验证正确。获得的农杆菌称为EHA105/Fgi-2promoter::p1300GN。

pTG-19T-FGI2S promoter同样操作获得Fgi-2Spromoter::p1300GN，以及农杆菌EHA105/Fgi-2Spromoter::p1300GN。

实施例4、转基因水稻的获得

以农杆菌EHA105/Fgi-2promoter::p1300GN为介导，按“材料与方法”中所述，将构建FGI2promoter::GUS嵌合基因导入“中花11”中未成熟胚来源的初生愈伤组织中，筛选再生得到21个独立的转基因水稻株系(如表2所列)。绝大多数转基因植株生长正常，并能结实。在每一个独立的转化株系中，对其全部单株抽提叶片总DNA，用与GUS编码区特异配对的引物进行分析，均能扩增出特异的产物，初步证实带有嵌合基因的T-DNA已经整合到水稻染色体上。下表显示对愈伤组织和转基因水稻幼苗的根与叶进行GUS活性检测，其中13个株系在愈伤组织染色时表现有GUS活性，在幼苗期叶片检测中均未显示GUS活性(表2)。

表2

“弱+”表示显色信号较弱。

实施例5、禾谷镰孢诱导转基因水稻GUS表达结果

在上述分析的基础上，选取在转基因水稻幼苗期未显示GUS活性的7个株系(11、21、26、28、36、39、43)进行禾谷镰孢的诱导表达。如图3所示，FGI2promoter转基因水稻T0代叶片受禾谷镰孢侵染48h后进行GUS活性检测，在伤口附近有GUS表达，水处理没有GUS表达；T1代植株在胚芽鞘侵染时GUS表达，水处理没有GUS表达。以35S启动子驱动GUS报告基因的转基因水稻，未受侵染时经GUS染色均显示可见表达(表3)。

表3

FGI2promoter-各株系染色情况

(+：显色；-：未显色；空格为未进行实验)

EHA105/Fgi-2Spromoter::p 1300GN转基因水稻在禾谷镰孢处理下未显示GUS染色，表明截短的Fgi-2Spromoter不足以驱动禾谷镰孢诱导表达。该截短的启动子没有诱导表达的功能，说明SEQ ID NO：1中前427个碱基对诱导表达是必须的。

为了进行比较，本发明人还克隆了另一基因FGI1(ANT-G2)的启动子(SEQID NO：3)：

TCCGTTTCTCCATAGGTGTGTGCGTCGCAGTGGATTTAATGCTCCGTTTTTCCTGGAGCCTTGGAATCTTTAGATCTTTATGGAGTCTTTTTAGATCGTGAGATAATTGGTTGGTAATCGGGTAAGCGGGAAGAAAAAATTGTCGTATTTTGACCGCTGTTTTGTCATAGTGTCGGTGCCGCGTTAGATCTGTCTGTTATGAGCCGTGGATGGCGATCTGACGGCAGGCGACCGTCTCATTAGTACTTGTATAACTACCATTGTTTCAGTTTTTTTTTCAGTTCTTGAAAGTACTGAGTAATAGAGTGCACACCTATACTTTTGACATGCTATGATGTTCTTCGCTGGTTTTGTAATTAAATTTGTAAATCATGGTAATCTTTGAATGCTAAATTTTCTGAACTGTTTGAGCATGCTACAATGGGCATCTGTTCTATTTTGATGATTGTTGTCAAAACTAGAGTTATGGAACATGAAAAATATAAATGTGTATGTTTGTATGATTGCATTCATTGTTTATTTCTGTCTAATAGTTTTATCTGTTAGTGTTTGCACGGAGGCTCTCTGCTTTAGTTAGATGTGTCTAGCTTTGATTTGTTCTTACTCTATATTGAAACTGTAAAATATACTCATCCTTTATTGCACAGATGCGGAGGTCTTATTTTGTTTCTCTTTATGTAATGTCCTAAGTTTTGTGTGTTGACATTATGTTGCAGCCAACAGTTTTGAGG

如前述构建FGI2promoter驱动的GUS基因表达相同的方法，本发明人构建了FGI1promoter驱动的GUS基因表达的转基因植物，并检测获得的各株系的GUS染色情况。

FGI1启动子与FGI2启动子驱动GUS基因表达的GUS染色结果比较表明，FGI2受诱导表达的强度更强。显色时期上，FGI1启动子驱动GUS表达的株系T0代在侵染48小时后开始检测，每隔24小时检测一次，发现最早在48小时个别株系有检测到GUS表达，且颜色非常弱多数在7天后有检测到。同样，FGI2启动子驱动GUS表达的株系T0代在侵染48小时后开始检测，在48小时时有检测到GUS表达，且颜色非常强，4天后，多数检测株系均有GUS表达。同时观察到，GUS表达的区域FGI2比FGI1大。

用定量检测的方法可以更精确的估计受病原真菌诱导表达的倍数，具体实验结果见表4和图4中，受禾谷镰孢诱导表达的倍数在两个独立转基因株系(FGI2promoter转基因植株)中均达到20倍以上。本发明人认为这个诱导倍数仍是被低估了的，因为感染后只有少部分细胞被真菌侵染到达而启动诱导表达，而取样中其他周边细胞未表达，计算出的是平均值，在被真菌侵染到的细胞中诱导倍数应该更高。

本发明人认为FGI2启动子可能也受其他一些病原真菌(如稻瘟病菌)侵染的诱导表达，具体实验结果见表4和图4中，诱导表达的倍数在两个独立转基因株系中均达到7倍以上。

表4、Fgi-2启动子::GUS转基因水稻分别经禾谷镰孢处理6天或稻瘟病菌处理3天淡GUS酶活定量检测

  relative GUS unit  1L39  1L36  无病原菌水处理对照  0.06  0.03  禾谷镰孢处理实验1  2.07  0.55  稻瘟病菌处理实验1  0.63  0.50  稻瘟病菌处理实验2  0.86  0.18  标准差  无病原菌水处理对照  0.09  0.10  禾谷镰孢处理实验1  0.06  0.02  稻瘟病菌处理实验1  0.05  0.11  稻瘟病菌处理实验2  0.02  0.04  诱导表达倍数(均与无病原菌水处理对照相比)  1L39  1L36  禾谷镰孢处理实验1  32.27  21.84  稻瘟病菌处理实验1  9.82  19.67  稻瘟病菌处理实验2  13.41  7.24  标准差  禾谷镰孢处理实验1  0.26  0.19  稻瘟病菌处理实验1  0.25  1.03  稻瘟病菌处理实验2  0.09  0.38

注：每个数据是3次测量的平均值，1L39和1L36是两个独立的转基因水稻株系。

讨论

本发明克隆了玉米FGI2启动子，利用农杆菌介导的方法转化水稻，结果显示，转基因植株T0代苗期叶片及T1代胚芽鞘期在受禾谷镰孢侵染时可见表达，未受禾谷镰孢侵染时未见表达，结果表明该启动子可受禾谷镰孢侵染诱导。

本发明的受禾谷镰孢菌早期诱导高表达基因的启动子可以用于转基因农作物(水稻、玉米等)中驱动特定的其他基因(如抗菌基因)，使该基因在转基因植株受禾谷镰孢菌侵染早期表达，从而达到在有真菌病害威胁时发挥抗菌保产的作用，而在无病害威胁时保持关闭有利于能量和营养的分配向高产倾斜。玉米病程相关蛋白基因(PRms)是在病原真菌侵入玉米早期高表达的基因，本发明得到该基因的启动子驱动植物抗真菌病基因，获得的转基因水稻，可在受到禾谷镰孢侵染时，迅速做出反应，诱导抗病基因表达，防御禾谷镰孢菌的侵染，从而更有效的在发病早期及时阻止发病，同时又区别于组成型表达启动子，可在抗病的同时而又不影响农作物的产量。

另外，本发明也证明了FGI2启动子受到多种病原真菌(如稻瘟病菌)侵染的诱导表达。受多种病原真菌侵染诱导的话，可能用于多种抗病性设计，因此可能具有更广的应用范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。