厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用

摘要

本发明公开了一种厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用。该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2693~26792位的碱基序列所示，包含18个基因，具体为：负责萜类骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5个基因；氧化还原酶基因，即xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO共8个基因；编码调控子和转运子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5个基因。本发明所提供的包含厦霉素A和和氧厦霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解厦霉素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及吲哚倍半萜类抗生素厦霉素A（xiamycin A） 和氧厦霉素(oxiamycin)的生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

吲哚倍半萜是一类含有吲哚的生物碱。已报道发现的吲哚倍半萜生物碱类化合物主要来 源于植物，例如来自暗罗属植物Polyalthia oliveri的polyalthenol；来自甜杨（P.suaveolens） 的polyveoline以及来自Greenwayodendron suaveolens的suaveolindole等，最近的一个例子是 polysin和pentacyclindole。直到最近十年，真菌来源的吲哚倍半萜才陆续被报道，包括 sespendole和lacanindoles。Cane的基因组数据挖掘工作表明放线菌是萜类化合物的丰富来源。 与此相对应，最近，一些来源于放线菌的吲哚倍半萜类化合物相继被发现，包括从一株土壤 链霉菌中分离到的oridamycin A和B，从两个红树林植物内生链霉菌中分离到的厦霉素A （xiamycin A，1)，其结构式如图1所示和B，以及indosespene(3)和sespenine。研究发现， 来自Streptomyces sp.strain KS84的Oridamycins A和B具有抗真菌活性，来自红树林内生菌 Streptomyces sp.GT2002/1503的厦霉素A具有选择性的抗HIV活性和中等抗菌活性。

近十多年来发展起来的组合生物合成技术为改造复杂天然产物提供了新的思路和方法。 在阐明了自然界的生物合成途径、克隆和鉴定微生物天然产物生物合成基因簇的基础上，采 用组合生物合成技术对发现的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等 操作，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或 定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇。

本发明的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核 苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2693~26792位的碱基序列所示，包含18个基因，具体为：

（1）负责萜类骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5个基因：

xiaD位于基因簇核苷酸序列第5512-6504个碱基处，长度为993个碱基对，编码4-羟基 -3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶，330个氨基酸；

xiaE位于基因簇核苷酸序列第6517-8334个碱基处，长度为1818个碱基对，编码1-脱氧 -D-木酮糖-5-磷酸合酶，605个氨基酸；

xiaF位于基因簇核苷酸序列第8331-9482个碱基处，长度为1152个碱基对，编码4-羟基 -3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合酶，383个氨基酸；

xiaN位于基因簇核苷酸序列第16457-17482个碱基处，长度为1026个碱基对，编码聚异 戊二烯二磷酸合酶，341个氨基酸；

xiaP位于基因簇核苷酸序列第19795-20802个碱基处，长度为1008个碱基对，编码聚异 戊二烯合成酶，335个氨基酸；

（2）氧化还原酶基因，即xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO共8个基 因：

xiaA位于基因簇核苷酸序列第2693-3784个碱基处，长度为1092个碱基对，编码含有 Rieske 2Fe-2S（铁硫蛋白）结构域加氧酶，363个氨基酸；

xiaB位于基因簇核苷酸序列第3843-4337个碱基处，长度为495个碱基对，编码黄素还 原酶，164个氨基酸；

xiaI位于基因簇核苷酸序列第11512-12705个碱基处，长度为1194个碱基对，编码吲哚 氧化酶/乙酰CoA脱氢酶，397个氨基酸；

xiaJ位于基因簇核苷酸序列第12708-13097个碱基处，长度为390个碱基对，编码柠檬 烯-1,2-环氧化物水解酶，129个氨基酸；

xiaK位于基因簇核苷酸序列第13100-14890个碱基处，长度为1791个碱基对，编码芳香 环羟化酶，596个氨基酸；

xiaL位于基因簇核苷酸序列第14890-15123个碱基处，长度为234个碱基对，编码铁氧 化还原蛋白，77个氨基酸；

xiaM位于基因簇核苷酸序列第15149-16318个碱基处，长度为1170个碱基对，编码细胞 色素P450氧化酶，389个氨基酸；

xiaO位于基因簇核苷酸序列第17610-19766个碱基处，长度为2157个碱基对，编码单加 氧酶，718个氨基酸；

（3）编码调控子和转运子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5个基因：

xiaC位于基因簇核苷酸序列第4502-5278个碱基处，长度为777个碱基对，编码IclR家 族的转录调控蛋白，258个氨基酸；

xiaG位于基因簇核苷酸序列第9930-10652个碱基处，长度为723个碱基对，编码LuxR 家族调控蛋白，240个氨基酸；

xiaH位于基因簇核苷酸序列第10645-11445个碱基处，长度为801个碱基对，编码假定 的膜蛋白，266个氨基酸；

xiaQ位于基因簇核苷酸序列第20897-23875个碱基处，长度为2979个碱基对，编码LuxR 家族的转录调控蛋白，992个氨基酸；

xiaR位于基因簇核苷酸序列第24018-26792个碱基处，长度为2775个碱基对，编码LuxR 家族的转录调控蛋白，924个氨基酸。

在厦霉素A生物合成基因簇的上下游基因，即orf(-2)、orf(-1)、orf1、orf2共4个基因：

orf(-2)位于基因簇核苷酸序列第1-1644个碱基处，长度为1644个碱基对，编码FAD（黄 素腺嘌呤二核苷酸）依赖型氧化还原酶，547个氨基酸;

orf(-1)位于基因簇核苷酸序列第1641-2696个碱基处，长度为1056个碱基对，编码乙醇 脱氢酶，351个氨基酸;

orf1位于基因簇核苷酸序列第27049-27486个碱基处，长度为438个碱基对，编码锌金 属蛋白酶，编码145个氨基酸；

orf2位于基因簇核苷酸序列第27845-29371个碱基处，长度为1527个碱基对，编码假定 的钠耦合通透酶，编码508个氨基酸。

SEQ ID NO.1的第2693位到26792位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则 随时得到。SEQ ID NO.1的第2693位到26792位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过 聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使 用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1的第2693位到26792 位中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生厦霉素A生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少其中之 一的基因包含有SEQ ID NO.1的第2693位到26792位中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包 含本发明序列SEQ ID NO.1的第2693位到26792位的DNA作为探针以Southern杂交等方法 从其他生物体中得到与厦霉素A生物合成基因簇相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌 SCSIO 02999基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序 列，也包含有链霉菌SCSIO 02999基因组中邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突 变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变， 不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外 线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达 体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包 括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之 后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致 力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主 中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成indosespene类化合物，进一步 催化合成抗生素厦霉素A。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重 组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得 其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因DNA片段可以通过 中断厦霉素A生物合成的一个或几个步骤而得到新的厦霉素结构类似物或前体。包含DNA 片段或基因可以用来提高厦霉素A或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提 高产量的途径。

本发明所提供的催化合成indosespene类化合物的合成基因可用于合成厦霉素A衍生物。

本发明所提供的厦霉素骨架的后修饰基因或其他酶提供了通过遗传修饰得到类似物的途 径，所包含的催化吲哚倍半萜类化合物生成或后修饰的其他应用。

本发明所提供的吲哚氧化酶XiaI是一个新型的环化酶，可用于催化indosespene类化合 物形成吲哚倍半萜的成环反应。

本发明还提供了厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备厦霉素A及其类似物中的 应用。

本发明还提供了厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备氧厦霉素及其类似物中的 应用。

本发明还提供了厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备化合物indosespene及其类 似物中的应用。

本发明还提供了一种编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶的基因，其特征在于，其核苷酸 序列如SEQ ID NO.1的第11512~12705位碱基序列所示。

本发明还提供了所述的编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶的基因编码的吲哚氧化酶/乙酰 CoA脱氢酶。

总之，本发明所提供的包含厦霉素A和氧厦霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息， 可以帮助人们理解厦霉素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知 识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合 物或基因、蛋白。

本发明的海洋来源的链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 02999，该菌于2012年4月26保 藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012145。

附图说明：

图1是厦霉素A（化合物1）和氧厦霉素（化合物2）的化学结构式。

图2是推测的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成途径。

图3是阳性克隆的相互重叠区示意图，包括了阳性克隆pCSG2402，pCSG2403，pCSG2404， pCSG2405，pCSG2407，pCSG2408，粗实线表示厦霉素A生物合成基因簇，箭头所示为引物 XiaD-1F/XiaD-1R和XiaN-1F/XiaN-1R扩增片段的位置。

图4是厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇的组织结构示意图。

图5是基因遗传改造链霉菌SCSIO 02999中厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇得到的突变 株在AM6发酵培养基中发酵的发酵产物的高压液相分析图：（A）野生型菌株链霉菌SCSIO 02999经发酵获得了厦霉素A（1）和氧厦霉素（2）；（B）敲除了orf(-1)-乙醇脱氢酶基因， 获得的突变株XM31发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（C）敲除了xiaB-黄素还 原酶基因，获得的突变株XM33发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（D）敲除了 xiaC-IclR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM34发酵仍然能产生化合物厦霉素A和 氧厦霉素；（E）敲除了xiaD-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶，获得的突变株XM35发 酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（F）敲除了xiaE-1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基 因，获得的突变株XM36发酵仍然能产生了化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降低； （G）敲除了xiaF-4-羟基-3-甲基-2-丁烯-1-基磷酸合酶基因，获得的突变株XM37发酵仍然能 产生化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降低；（H）敲除了xiaG-LuxR家族调控蛋白基 因，获得的突变株XM38失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（I）敲除了xiaH-假定的 膜蛋白基因，获得的突变株XM39失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（J）敲除了xiaJ- 柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶基因，获得的突变株XM40发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧 厦霉素；（K）敲除了xiaI-吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶基因，获得的突变株XM41失去了 产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（L）敲除了xiaK-芳香环羟化酶基因，获得的突变株XM42 发酵不能产生化合物氧厦霉素，厦霉素A的产量大幅降低，而且产生了新化合物3 (indosespene)；（M）敲除了xiaL-铁氧化还原蛋白基因，获得的突变株XM43失去了产生厦霉 素A和氧厦霉素的能力；（N）敲除了xiaM-细胞色素P450氧化酶基因，获得的突变株XM44 失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（O）敲除了xiaN-聚异戊二烯二磷酸合酶基因，获 得的突变株XM45发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（P）敲除了xiaO-单加氧酶 基因，获得的突变株XM46失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（Q）敲除了xiaP-聚异 戊二烯合成酶基因，获得的突变株XM47失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（R）敲除 了xiaQ-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM48失去了产生厦霉素A和氧厦霉 素的能力；（S）敲除了xiaR-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM49失去了产 生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（T）敲除了orf1-锌金属蛋白酶基因，获得的突变株XM50 发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（U）敲除了orf2-通透酶基因，获得的突变株 XM51发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素。

图6是分离到的合成途经中间产物3的化学结构式。

图7（A）是优化培养条件后链霉菌SCSIO 02999及其基因遗传改造突变株XM44发酵产物 的高压液相分析图：（i）链霉菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6发酵培养基中发酵7天的 产物检测；（ii）链霉菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6-4发酵培养基中发酵7天的产物检 测，厦霉素A和氧厦霉素的产量有所提高；（iii）突变株XM42在AM6发酵培养基中发酵7 天的产物检测；（iv）突变株XM42在AM6-4发酵培养基中发酵7天的产物检测，能检测到 产生了新化合物4和5；（v）突变株XM44在AM6发酵培养基中发酵7天的产物检测；（vi） 突变株XM44在AM6-4发酵培养基中发酵7天的产物检测，能检测到产生了新化合物6和7； （B）是从XM42和XM44在AM6-4发酵培养基发酵的产物中分离到的化合物4-7的化学结 构式。

图8是部分突变株添加二甲基亚砜（DMSO）、厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的高 压液相分析图：（A）是突变株XM41添加厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的高压液 相分析图：（i）厦霉素A标准品；（ii）氧厦霉素标准品；（iii）化合物3标准品；（iv） 突变株XM41添加DMSO培养后的发酵产物；（v）突变株XM41添加化合物3培养后的发 酵产物，没有产生厦霉素A和氧厦霉素，也没有产生其他新的化合物；（vi）突变株XM41 添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素；（B）是突变株XM43添加厦霉素A或 化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图：（i）厦霉素A标准品；（ii）氧厦霉素标准 品；（iii）化合物3标准品；（iv）突变株XM43添加DMSO培养后的发酵产物；（v）突变 株XM43添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A和氧厦霉素；（vi）突变株XM43 添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素；（C）是突变株XM44添加厦霉素A或 化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图：（i）厦霉素A标准品；（ii）氧厦霉素标准 品；（iii）化合物3标准品；（iv）突变株XM44添加DMSO培养后的发酵产物；（v）突变 株XM44添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A和氧厦霉素；（vi）突变株XM44 添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素；（D）是突变株XM46添加厦霉素A或 化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图：（i）厦霉素A标准品；（ii）氧厦霉素标准 品；（iii）化合物3标准品；（iv）突变株XM46添加DMSO培养后的发酵产物；（v）突变 株XM43添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A，但没有产生氧厦霉素；（vi） 突变株XM46添加厦霉素A培养后的发酵产物，没有产生氧厦霉素；（E）是突变株XM47 添加厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图：（i）厦霉素A标准品；（ii） 氧厦霉素标准品；（iii）化合物3标准品；（iv）突变株XM47添加DMSO培养后的发酵产 物；（v）突变株XM47添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A和氧厦霉素；（vi） 突变株XM47添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素。

图9是吲哚氧化酶XiaI的体内生物转化，（A）XiaI生物转化化合物3的高压液相分析图： （i）厦霉素A标准品；（ii）化合物3标准品；（iii）携带pET28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3) 在含有50μM卡那霉素，0.1mM IPTG和60μM化合物3的LB培养基中培养4小时的HPLC 检测结果；（iv）携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μM卡那霉素，0.1mM IPTG和60μM化合物3的LB培养基中培养4小时的HPLC检测结果，化合物3已经部分转 化为化合物8和厦霉素A；（v）携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μM卡 那霉素，0.1mM IPTG和60μM化合物3的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果，化 合物3已经完全转化为厦霉素A，同时化合物8也消失了；“·”表示大肠杆菌宿主发酵生成的 物质；（B）反应中间产物8的化学结构式；（C）XiaI催化反应的示意图；（D）XiaI生物 转化化合物6和7的高压液相分析图：（i）携带pET28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有 50μM卡那霉素，0.1mM IPTG和60μM化合物6的LB培养基中培养24小时的HPLC检测 结果；（ii）携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μM卡那霉素，0.1mM IPTG 和60μM化合物6的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果，化合物6已经部分转化为 化合物9；（iii）携带pET28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μM卡那霉素，0.1mM IPTG 和60μM化合物7的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果；（iv）携带pCSG2604质 粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μM卡那霉素，0.1mM IPTG和60μM化合物7的LB培 养基中培养24小时的HPLC检测结果，化合物7已经部分转化为化合物10。

图10是吲哚氧化酶XiaI的体外生化鉴定，（A）纯化蛋白XiaI的蛋白电泳分析；（B）XiaI 反应的高压液相分析图：（i）厦霉素A标准品；（ii）化合物3标准品；（iii）XiaI的标准 反应体系包括400μM化合物3，1mM黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），2mM NADH，5μM XiaI，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，28℃反应4小时，化合物3部分反应生成化合物8和厦霉素 A；（iv）标准反应体系中的NADH换成NADPH，化合物3部分能反应生成厦霉素A，但是 催化效率明显低于标准体系；（v）标准反应体系中的XiaI换成经过10分钟沸水浴处理的XiaI， 化合物3不能反应生成厦霉素A，说明加热会导致XiaI失活；（vi）标准反应体系缺少FAD， 化合物3部分不能反应生成厦霉素A；（vii）标准反应体系缺少NADH，化合物3部分不能 反应生成厦霉素A；（viii）反应体系包括400μM化合物3，1mM黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）， 5μM XiaI，50mM Tris-HCl(pH 8.0)；（ix）标准反应体系中的FAD换成FMN，化合物3部分 反应生成化合物8和厦霉素A；（x）标准反应体系中的FAD换成FMN，XiaI换成经过10分 钟沸水浴处理的XiaI，化合物3不能反应生成厦霉素A；“*”表示酶反应中的杂质。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1.链霉菌SCSIO 02999基因组序列扫描及厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇序列 分析和功能分析：

通过对链霉菌（Streptomyces sp.）SCSIO 02999进行全基因组扫描和注释，在其中找到了 29kb的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇，包含了22个开放阅读框(open reading frames, ORFs)（表1）。根据生物信息学分析，其中xiaD、E、F、N和P五个基因可能参与xiamycine A的萜类骨架的合成，xiaA、B、I、J、K、L、M和O八个基因编码氧化还原酶，xiaC、G、 H、Q和R则是五个编码调控子和转运子的基因。厦霉素A的生物合成途径初步确定如下（图 2）：XiaD、XiaE和XiaF与非甲羟戊酸途径中的羟甲基丁烯焦磷酸还原酶(IspH)、1-脱氧-D- 木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基磷酸合酶(IspG)具有很高的一致性，而编 码非甲羟戊酸途径中的另外几个酶则可以在xia基因簇外的基因组序列中找到，据此推测 XiaD、E和F以及一些在xia基因簇外的酶通过非甲羟戊酸途径提供IPP和DMAPP，XiaN 催化IPP和DMAPP缩合形成法尼基焦磷酸(farnesyl-diphosphate,FPP)，而XiaP则负责将FPP 装载到吲哚环上，形成3-法尼基吲哚。随后，3-法尼基吲哚可能通过一个分子内的环化和随 后水解触发的环化机制形成preindosespene。其中xiaA、B、L编码的XiaA、B、L蛋白可能 组成Rieske[2Fe-2S]型非血红素铁氧化酶家族，与具有环氧酶功能的细胞色素P450氧化酶 XiaM共同参与分子内环化过程，而柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶XiaJ催化水解并触发环化形 成preindosespene。细胞色素P450氧化酶XiaM还能选择性催化氧化preindosespene的24位 碳上的甲基变成羧基，生成中间产物indosespene(3)。吲哚氧化酶XiaI催化indosespene反应 生成xiamycine A。氧厦霉素则可能是由XiaI和另外两个酶XiaK和XiaO共同催化indosespene 产生。

表1：厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇的基因及其功能分析

a氨基酸数目；b括号中包含了同源蛋白的GeneBank登录号，及与之对应的一致性/相似性（identity/similarity）。

2.厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的克隆、分析及边界的确定：

根据基因组序列注释和生物信息学分析，以参与厦霉素A骨架合成的羟甲基丁烯基焦磷 酸还原酶基因xiaD和异戊二烯二磷酸合酶基因xiaN的序列设计PCR筛选引物，从链霉菌 SCSIO 02999的基因组文库2400个克隆中筛选，获得了8个阳性克隆，其中的4个用两对引 物能够同时筛选获得。这些阳性克隆经酶切分析表明其中两个cosmid包含了整个厦霉素A和 氧厦霉素生物合成基因簇，其他4个cosmid包含部分基因簇（图3）。

生物信息学分析表明，orf(-2)基因编码FAD依赖的氧化还原酶，orf(-1)基因编码乙醇脱 氢酶，据报道这两个酶均参与macrolactam的合成，与厦霉素A的生物合成无关。通过建立 链霉菌SCSIO 02999的遗传操作体系，构建了orf(-1)基因灭活的突变株XM31，该突变株经 发酵仍旧能够生产厦霉素A和氧厦霉素，产量与野生型相当，从而确证了orf(-1)不参与厦霉 素的生物合成。由于未能获得与orf(-1)相邻的含有Rieske 2Fe-2S（铁硫蛋白）结构域的加氧 酶基因xiaA的灭活突变株XM32，难以确定该基因是否参与厦霉素的生物合成，因此厦霉素 生物合成基因簇的左边界还不是十分确定。灭活编码短链脱氢酶的基因orf1和编码钠耦合通 透酶的基因orf2，获得突变株XM50和XM51，两突变株仍能生产厦霉素A，产量与野生型 相当，排除了orf1基因参与厦霉素A生物合成的可能性。同时，灭活在orf1基因上游的编码 Lux家族转录调节因子的xiaQ和xiaR基因，获得的突变株XM48和XM49不能生产厦霉素 A和氧厦霉素，说明xiaQ和xiaR可能是厦霉素A和氧厦霉素生物合成的负调控因子，与厦 霉素A和氧厦霉素合成相关。这些结果表明orf1是厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇的右 边界（图4）。因此，厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的边界的上游初步确定为xiaA， 下游为xiaR（图4），该厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 的第2693~26792位的碱基序列所示。。

3.厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇中各基因的功能分析

在克隆、分析了完整的厦霉素和氧厦霉素的生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可 能的功能的基础上，本发明对厦霉素A和氧厦霉素的生物合成机制进行了探讨，采用 PCR-targeting技术针对20个生物合成基因，进行了灭活突变（检测引物参见表2，灭活引物 参见表3），获得了XM31，XM33-XM51等20个突变株。

表2：构建突变株所需的检测引物名称和序列

表3：构建突变株所需的灭活引物名称和序列

我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分离鉴定，阐明了部分生物合成基因的功能， 为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得厦霉素活性类似物提供了可能。同时本发 明也从突变株XM42和X44中获得了一批新的中间产物（如图5、图6和图7所示）：

（1）敲除了orf(-1)-乙醇脱氢酶基因，获得的突变株XM31发酵仍然能产生化合物厦霉 素A和氧厦霉素；（2）敲除了xiaB-黄素还原酶基因，获得的突变株XM33发酵仍然能产生 化合物厦霉素A和氧厦霉素；（3）敲除了xiaC-IclR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变 株XM34发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（4）敲除了xiaD-4-羟基-3-甲基-2-丁 烯基-焦磷酸还原酶，获得的突变株XM35发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（5） 敲除了xiaE-1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因，获得的突变株XM36发酵仍然能产生了化合 物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降低；（6）敲除了xiaF-4-羟基-3-甲基-2-丁烯-1-基磷酸 合酶基因，获得的突变株XM37发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降 低；（7）敲除了xiaG-LuxR家族调控蛋白基因，获得的突变株XM38失去了产生厦霉素A和 氧厦霉素的能力；（8）敲除了xiaH-假定的膜蛋白基因，获得的突变株XM39失去了产生厦霉 素A和氧厦霉素的能力；（9）敲除了xiaJ-柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶基因，获得的突变株 XM40发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（10）敲除了xiaI-吲哚氧化酶/乙酰辅酶 A脱氢酶基因，获得的突变株XM41失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（11）敲除了 xiaK-芳香环羟化酶基因，获得的突变株XM42发酵不能产生化合物氧厦霉素，厦霉素A的产 量也大幅降低，而且产生了新化合物3，4和5；（12）敲除了xiaL-铁氧化还原蛋白基因，获 得的突变株XM43失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（13）敲除了xiaM-细胞色素P450 氧化酶基因，获得的突变株XM44发酵不能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产生了新化 合物6和7；（14）敲除了xiaN-聚异戊二烯二磷酸合酶基因，获得的突变株XM45发酵仍然 能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（15）敲除了xiaO-单加氧酶基因，获得的突变株XM46 失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（16）敲除了xiaP-聚异戊二烯合成酶基因，获得的 突变株XM47失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（17）敲除了xiaQ-LuxR家族的转录 调控蛋白基因，获得的突变株XM48失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（18）敲除了 xiaR-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM49失去了产生厦霉素A和氧厦霉素 的能力；（19）敲除了orf1-锌金属蛋白酶基因，获得的突变株XM50发酵仍然能产生化合物 厦霉素A和氧厦霉素；（20）敲除了orf2-通透酶基因，获得的突变株XM51发酵仍然能产生 化合物厦霉素A和氧厦霉素。

为了进一步确定以下基因在厦霉素A和氧厦霉素生物合成途径中的位置，在这些基因的 突变株发酵培养基中分别加入DMSO、厦霉素A或化合物3，通过对比各组发酵产物的差异 来确定基因的作用位点（加入DMSO的为阴性对照）（图8）：

（1）敲除了xiaI-吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶基因后获得的突变株XM41加入厦霉素 A发酵后能产生氧厦霉素；加入化合物3发酵后，没有产生厦霉素A和氧厦霉素，也没有产 生新产物。说明XiaI负责催化的反应位于化合物3合成以后，厦霉素A合成以前。

（2）敲除了xiaL-铁氧化还原蛋白基因后获得的突变株XM43加入厦霉素A发酵后产生 了氧厦霉素；加入化合物3发酵后，能产生厦霉素A和氧厦霉素。说明XiaL负责的反应位 于化合物3合成之前。

（3）敲除了xiaM-细胞色素P450氧化酶基因后获得的突变株XM44加入厦霉素A发酵 后产生了氧厦霉素；加入化合物3发酵后，能产生厦霉素A和氧厦霉素。说明XiaM负责的 反应位于化合物3合成之前。

（4）敲除了xiaO-单加氧酶基因后获得的突变株XM46加入厦霉素A发酵后没有产生 氧厦霉素；加入化合物3发酵后能产生厦霉素A，但不能产生氧厦霉素。说明XiaO负责把厦 霉素A合成氧厦霉素过程中的反应。

（5）敲除了xiaP-聚异戊二烯合成酶基因后获得的突变株XM47加入厦霉素A发酵发酵 后产生了氧厦霉素；加入化合物3发酵后，能产生厦霉素A和氧厦霉素。说明XiaP负责的 反应位于化合物3合成之前。

4.厦霉素A生物合成基因xiaI的生化功能鉴定及其应用：

携带厦霉素A生物合成基因xiaI表达载体的大肠杆菌能将化合物3生物转化为化合物8 和厦霉素A（图9A），实验发现，化合物8为化合物3生成厦霉素A过程的中间产物，通过 扩大的生物转化体系，分离到化合物8（图9B）。同时，XiaI还能够催化化合物6和7最终 形成化合物9和10（图9D）。

厦霉素A生物合成基因xiaI在大肠杆菌中获得了可溶性表达（图10A），经过生化反应 鉴定XiaI为环化酶，能以NAD(P)H和FAD(FMN)为辅酶，催化化合物3环化，形成化合物8， 化合物8再通过自发氧化，最终形成厦霉素A（图10B）。

以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明 的应用范围。

实施例1

厦霉素A和氧厦霉素产生菌链霉菌SCSIO 02999基因组DNA的提取：

将新鲜链霉菌SCSIO 02999的菌丝体按照5%的接种量接种于50mL的TSB培养基（胰 蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，加水至1L，pH 7.2-7.4） 中，28-30℃，振荡培养约3-4天，4000rpm离心10分钟收集菌丝体。菌丝体用STE溶液(NaCl 75mM，EDTA25mM，Tris-Cl 20mM)洗涤两次，向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液 和终浓度3mg/mL的溶菌酶，涡旋均匀，37℃温浴3小时，加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的 蛋白酶K，混匀，37℃温浴10分钟，加入至终浓度1-2%的SDS，混匀，放入55℃水浴约1 小时，期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（V/V/V=25:24:1），混合均匀，置于冰上 冷却30分钟。12000rpm，4℃离心10分钟，然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的 离心管中，用同样的方法反复处理3次，然后用等体积的氯仿洗涤两次，12000rpm，4℃离 心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加入1/10体积3mol/LNaAc (pH5.2)，混匀后再加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒将 DNA纤维团转移至新的离心管中，用70%乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37℃下略微烘干， 加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶，由此得到链霉菌SCSIO 02999基因组DNA。

实施例2

厦霉素A生产菌链霉菌SCSIO 02999基因组文库的建立：

首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶Sau3A I的用量，在20μL体系中， 含有17μL的链霉菌SCSIO 02999基因组DNA，2μL的10×反应缓冲液和1μL不同稀释度 的Sau3A I，其终止反应为4μL 0.5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了 0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组 DNA片段，用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。

用于构建文库的载体SuperCos 1质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序列中间切 开，然后进行去磷酸化处理，再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开，获得两个 臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组DNA片段连接过夜，连接体系 为10μL，含有1.25μg制备的基因组DNA片段和0.5μg处理后的SuperCos 1质粒，1μL的 10×Buffer，0.3U的连接酶。连接产物于65℃处理15分钟，使连接酶失活。从-80℃冰箱中 取出一管包装混合物(50μL)置于冰上，将包装混合物在指间迅速融化，小心吸取一半包装 混合物(25μL)至一个新的离心管中，加入10μL热处理后的连接产物，其余包装混合物于-80℃ 保存。小心混匀，30℃温浴90分钟，加入另外一半包装混合物(25μL)，30℃温浴继续90分 钟。加入500μL噬菌体稀释缓冲液（100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl₂,10mmol/L pH 8.3 Tris-HCl），再加入25μL氯仿，轻轻混匀，于4℃保存。

将冻存于-80℃的菌株E.coli LM392MP涂布在LB培养基上复苏。包装反应前一天，挑 取单克隆接种于LB培养基中（添加0.2%麦芽糖和10mM MgSO₄)，37℃振荡培养过夜，包 装反应当天，取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中（添加0.2%麦芽糖 和10mM MgSO₄)，37℃，200rpm振荡至培养物OD₆₀₀达到0.8-1时，4℃保存备用。取100μL 如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀，于37℃温浴15分钟，然后涂布 于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。将长出来 的单个克隆子，用无菌牙签点种于25块含以上所述抗生素的LB培养基的96孔板上，37℃ 培养过夜，加入终浓度为20%的甘油，混合均匀，置于-80℃保存。

实施例3

从厦霉素A生产菌链霉菌SCSIO 02999基因组文库中筛选含有厦霉素A合成的生物基因 的阳性克隆子：

将链霉菌SCSIO 02999基因组DNA送国家人类基因组南方研究中心进行全基因组扫描 和注释，根据扫描和注释的结果，通过生物信息学分析，初步确定厦霉素A和氧厦霉素生物 合成基因簇位于contig101的第32-49号基因(xiaA-xiaR)。根据其中的第35号基因（xiaD）和 第45号基因（xiaN）设计筛选引物XiaD-1F：5′-CGT CGA GCG GGC GCT GGA ATC-3′和 XiaD-1R：5′-TCA GCC ACG TCA CCA CCT CCG-3′以及XiaN-1F：5′-CGC AGA TGA ACA GGA TCG CC-3′和XiaN-1R：5′-ATC TGC CGG TCC GCC TCG TTC T-3′，通过PCR对2400 个克隆子进行筛选，获得6个阳性克隆，其中4个同时为两对引物的阳性克隆。采用限制性 核酸内切酶EcoRI和BglII对阳性克隆进行分别酶切和双酶切，通过酶切图谱和基因组扫描结 果比对，确定了其中两个cosmid pCSG2403和pCSG2407包含了整个厦霉素A和氧厦霉素生 物合成基因簇，其他4个cosmid包含部分基因簇（图3）。

实施例4

厦霉素A产生菌链霉菌SCSIO 02999遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得：

xiaK-芳香环羟化酶基因敲除突变菌株（XM42）的获得

利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的厦霉素A和氧厦霉素的生物 合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对xiaK基因的敲除引物，引物 序列见于表3中的xiaK敲除引物。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入 到接合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将含有厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇 的cosmid质粒pCSG2407转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/pCSG2407，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制 备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，回收其中约 1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用XiaK-2F 和XiaK-2R引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA 聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA 模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性 45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产 物回收纯化待用。（3）将PCR产物电转入（1）步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂 布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL阿泊拉霉素)上， 37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组质粒命名为pCSG2514，该质粒 中的xiaK基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质 粒pCSG2514转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/ pCSG2514，作为接合转移的供体菌。

野生型链霉菌SCSIO 02999菌株在38#培养基（麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄 糖4g，维生素B1 1mg，维生素B6 1mg，核黄素1mg，烟素1mg，生物素1mg，苯丙氨 酸1mg，丙氨酸0.3mg，海盐30g，加水至1L，pH 7.2）平板中划线培养3-5天，长出的孢 子用无菌棉签收集于含3%海盐的TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散。过滤分离菌丝体 和孢子，孢子悬浮于5mL含3%海盐的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2 小时，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG2514在50mL含50 μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长 至OD₆₀₀值约为0.8时，离心收集菌体（4000rpm，10min），用LB清洗菌体3遍，悬浮于 300μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均 匀，涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上，吹干后，于28℃培养18-20h。然后将平 板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄 氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养5-7天后观察。

当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有35μg/mL阿泊拉霉素和 50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的ISP4平板上，28℃培养3天后，抽取各个突变株的基因组DNA， 利用检测引物（引物序列见于表2中的xiaK的检测引物序列）通过PCR检测获得阳性克隆， 即获得xiaK-芳香环羟化酶基因敲除双交换突变菌株（XM42）。

其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表3和表2，参照上述方法，利用PCR-targeting 技术获得各个基因敲除的突变菌株。

具体如下：

敲除了orf(-1)-乙醇脱氢酶基因，获得突变株XM31；敲除了xiaB-黄素还原酶基因，获 得突变株XM33；敲除了xiaC-IclR家族的转录调控蛋白基因，获得突变株XM34；敲除了 xiaD-4-羟基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸还原酶，获得突变株XM35；敲除了xiaE-1-脱氧-D-木酮糖 -5-磷酸合酶基因，获得突变株XM36；敲除了xiaF-4-羟基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸合酶基因，获 得突变株XM37；敲除了xiaG-LuxR家族调控蛋白基因，获得突变株XM38；敲除了xiaH-假 定的膜蛋白基因，获得突变株XM39；敲除了xiaI-吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶基因，获得 突变株XM41；敲除了xiaJ-柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶基因，获得突变株XM40；敲除了xiaL- 铁氧化还原蛋白基因，获得突变株XM43；敲除了xiaM-细胞色素P450氧化酶基因，获得突 变株XM44；敲除了xiaN-聚异戊二烯二磷酸合酶基因，获得突变株XM45；敲除了xiaO-单 加氧酶基因，获得突变株XM46；敲除了xiaP-聚异戊二烯合成酶基因，获得突变株XM47； 敲除了xiaQ-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得突变株XM48；敲除了xiaR-LuxR家族的 转录调控蛋白基因，获得突变株XM49；敲除了orf1-锌金属蛋白酶基因，获得突变株XM50； 敲除了orf2-通透酶基因，获得突变株XM51。

实施例5

厦霉素A及其衍生物的生物发酵与检测:

将链霉菌SCSIO 02999野生菌或突变株活化后，按5%的接种量分别接入到250mL三角 瓶的50mL发酵培养基AM6（可溶性淀粉20g，葡萄糖10g，酵母抽提物5g，细菌学蛋白 胨5g，CaCO₃ 5g，海盐30g，加水至1L，pH 7.0）中，于28℃培养6-8天后，加入等体 积的丁酮，超声30min破碎细胞，搅拌30min，然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离， 用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于二甲基亚砜（DMSO）形成样品，进行高效液相色 谱（HPLC）检测，检测条件为：Phenomex C184.6×150mm反相柱，流动相A相为10%乙腈， 含0.1%甲酸，流动相B相为90%乙腈；流速为1mL/min，检测波长为254nm。HPLC程序： 0-20min，5%-100%B相；20-21min，100%B相；21-22min，100%-5%B相，22-30min 为5%B。

实施例6

厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的应用-对生物合成基因的遗传修饰获得结构类 似物:

通过实施例4和实施例5中所描述的方法，对厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇中 的一系列基因进行了敲除，获得了新的化合物，并进行了结构鉴定，结果如下（图5和图6）： （0）野生型链霉菌SCSIO 02999经发酵获得了厦霉素A和氧厦霉素；（1）敲除了orf(-1)-乙 醇脱氢酶基因，获得的突变株XM31发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（2）敲除 了xiaB-黄素还原酶基因，获得的突变株XM33发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素； （3）敲除了xiaC-IclR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM34发酵仍然能产生化合 物厦霉素A和氧厦霉素；（4）敲除了xiaD-4-羟基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸还原酶，获得的突变 株XM35发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（5）敲除了xiaE-1-脱氧-D-木酮糖-5- 磷酸合酶基因，获得的突变株XM36发酵仍然能产生了化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量 有所降低；（6）敲除了xiaF-4-羟基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸合酶基因，获得的突变株XM37发 酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降低；（7）敲除了xiaG-LuxR家族调 控蛋白基因，获得的突变株XM38失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（8）敲除了xiaH- 假定的膜蛋白基因，获得的突变株XM39失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（9）敲除 了xiaJ-柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶基因，获得的突变株XM40发酵仍然能产生化合物厦霉素 A和氧厦霉素；（10）敲除了xiaI-吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶基因，获得的突变株XM41 失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（11）敲除了xiaK-芳香环羟化酶基因，获得的突变 株XM42发酵不能产生化合物和氧厦霉素，厦霉素A的产量大幅降低，而且产生了新化合物 3；（12）敲除了xiaL-铁氧化还原蛋白基因，获得的突变株XM43失去了产生厦霉素A和氧 厦霉素的能力；（13）敲除了xiaM-细胞色素P450氧化酶基因，获得的突变株XM44失去了 产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（14）敲除了xiaN-聚异戊二烯二磷酸合酶基因，获得的突 变株XM45发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（15）敲除了xiaO-单加氧酶基因， 获得的突变株XM46失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（16）敲除了xiaP-聚异戊二烯 合成酶基因，获得的突变株XM47失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；（17）敲除了 xiaQ-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM48失去了产生厦霉素A和氧厦霉素 的能力；（18）敲除了xiaR-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM49失去了产生 厦霉素A和氧厦霉素的能力；（19）敲除了orf1-锌金属蛋白酶基因，获得的突变株XM50发 酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；（20）敲除了orf2-通透酶基因，获得的突变株XM51 发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素。

实施例7

厦霉素A生产菌链霉菌SCSIO 02999及突变株发酵培养基的优化：

对发酵培养基AM6的配方进行改良，厦霉素A生产菌链霉菌SCSIO 02999野生型的厦 霉素A和氧厦霉素在不同培养基中产量不同。其中链霉菌SCSIO 02999在改良的培养基 AM6-4（甘油10g，细菌学蛋白胨5g，CaCO₃ 5g，5%海盐，加水至1L，pH 7.0）中产量提 高（图7A）。

采用AM6-4培养基对各突变株进行发酵培养，部分突变株发酵产生了新产物（1）敲除 了xiaK-芳香环羟化酶基因后获得的突变株XM42发酵产生了新化合物4和5（图7A和B）； （2）敲除了xiaM-细胞色素P450氧化酶基因后获得的突变株XM44发酵产生了新化合物6 和7（图7A和B）。

实施例8

厦霉素A合成基因突变株添加厦霉素A和化合物3进行发酵培养：

将按照实施例6的方法分离出来的厦霉素A和化合物3分别溶解于DMSO，各自配制成 20mM的溶液。在试管中加入2mL发酵培养基AM6，分别接种XM41、XM42、XM43、XM44、 XM46、XM47，各突变株接种3支试管，分别加入3μLDMSO、3μL20mM厦霉素A、3μL 20mM化合物3。接种后的试管于28℃振荡培养7天后，加入3mL丁酮，超声30min破碎 细胞，然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离，用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于 二甲基亚砜（DMSO）形成样品，进行高效液相色谱（HPLC）检测（图8），检测条件为： Phenomex C184.6×150mm反相柱，流动相A相为10%乙腈，含0.1%甲酸，流动相B相为90% 乙腈；流速为1mL/min，检测波长为254nm。HPLC程序：0-20min，5%-100%B相； 20-21min，100%B相；21-22min，100%-5%B相，22-30min为5%B。

实施例9

吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶XiaI的高效表达工程菌的生物转化反应及其在获得厦霉 素结构类似物中的应用:

应用PCR方法从野生型链霉菌SCSIO 02999的基因组中扩增获取了xiaI基因，采用高保 真酶fast PFU和引物XiaI-3F：5′-AGT GGT GCA TAT GAC AGA CAT CCG A-3′(NdeI)， XiaI-3R：5′-AGG GGA GGA TCC GAA AGG AGG GT-3′(BamHI)。PCR产物用限制性核酸内 切酶NdeI和BamHI双酶切回收后，连接到用同样的酶处理的表达载体pET28a上，构建成表 达质粒pCSG2604。含有pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μg/mL卡那霉素的 LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右，取2mL菌液，加入终浓度为0.1mM的异丙 基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和60μM化合物3，28℃培养分别4小时和24小时 后，加入3mL丁酮，超声30min破碎细胞，然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离，用 旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于二甲基亚砜（DMSO）形成样品，进行高效液相色谱 （HPLC）检测，色谱条件同实施例8（图9A）。结果表明：如图9C所示，XiaI可以先将化 合物3环化成化合物8，紧接着在化合物8在空气中自发氧化形成厦霉素A。化合物8通过 扩大反应体积至500mL，培养4小时后分离纯化而得，其结构经过了核磁共振鉴定（图9B）。

XiaI也能以化合物6和7为底物，催化它们成环。把培养体系中的化合物3分别换成化 合物6和7，按照上述条件培养24小时，HPLC的结果显示，XiaI能将化合物6催化生成化 合物9，将化合物7催化生成化合物10（图9D）。

实施例10

吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶XiaI的生化反应及其在获得厦霉素结构类似物中的应用:

含有pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中于 37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右，然后加入终浓度为0.mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 （IPTG），继续在20-28℃培养10-12小时诱导蛋白表达。离心收集细胞，重悬于缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0)中，利用超声波破碎法释放内容物。重组XiaI的分离纯化利用快速蛋白质液 相色谱层析法完成，纯化后的蛋白，其电泳图如图10A所示。具体而言，细胞破碎后的上清 液加入到1mL规格的HisTrap柱中，然后用250mM的咪唑溶液洗脱。纯化后的蛋白通过 PD-10柱脱盐，于-80℃保存在酶贮存缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0;100mM NaCl;10%甘油) 中。

100μL的XiaI的反应液一般包括400μM化合物3，1mM黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）， 2mM NADH，5μM重组XiaI，缓冲液为50mM Tris-HCl(pH 8.0)，在28℃反应4小时。用 NADPH取代NADH，黄素单核苷酸(FMN)取代FAD按上述体系进行反应。对照组的反应体 系中XiaI则经过10min沸水浴加热处理。反应液用3倍体积的丁酮萃取抽干后，残留物溶解 于DMSO并利用高压液相分析，分析条件同实施例8。结果表明，如图10B所示，XiaI能以 NADH和FAD为辅酶，先将化合物3环化成化合物8，化合物8在空气中自发氧化形成厦霉 素A；用NADPH取代NADH，FMN取代FAD，反应同样能进行，但NADPH取代NADH 后，催化效率有所下降；在缺乏NAD(P)H或FAD(FMN)时，反应不能进行；XiaI经过10min 沸水浴加热处理会失活。