一种反硝化细菌培养及测定水体硝态氮同位素组成的方法

摘要

本发明涉及水体硝酸盐污染治理与控制技术领域，是培养一种反硝化细菌并利用该细菌测定水体硝酸盐氮同位素组成的方法，它包括以下步骤：①反硝化细菌的富集培养，②检测反硝化细菌是否将培养液中NO

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养反硝化细菌并用该细菌辨别硝态氮同位素组成，属于水体硝酸盐污 染治理与控制技术领域。

背景技术

地下水是我国经济和社会发展以及人民生活所必需的、不可替代的重要资源。全世界超 过15亿的人口主要依靠地下水作为饮用水。我国部分城市和广大农村地区，地下水往往是唯 一的供水水源。近些年来，硝态氮污染地下水已是国际上普遍关注的问题。欧美许多国家和地 区都存在地下水硝态氮含量严重超标的现象，我国许多地区也在不同程度上受到了硝态氮的 污染，尤其是农村地区硝态氮污染非常普遍，且有日益严重的趋势。硝态氮本身对人体虽无直 接危害，但被还原为亚硝态氮后却可诱发高铁血红蛋白症、消化系统癌症等疾病而威胁人体健 康。因此，为保证供水安全，有效治理被污染的地下水体，确定地下水中硝态氮污染的来源非常 重要。

在人类活动影响下，硝态氮污染来源复杂，既有天然源，又有人为源，一般认为地下水 中大量的硝态氮主要来源于居民生活污水与垃圾粪便、化肥、工业废水、大气氮氧化合物干 湿沉降以及污水灌溉等。判断地下水NO_3-N污染源的方法很多，其最简单和传统的方法是通 过调查污染区的土地利用类型并结合地下水化学特征分析辨明污染源。但这一方法得到的结 果较为粗糙。这主要是因为不同来源的N通过氮转化作用形成易迁移的NO₃^-流入地表水和地 下水中。不同来源NO₃^-的化学形式都是NO₃^-，没有什么区别，单纯从化学形式上很难区分其 确切来源。但是，在同位素水平上，NO₃^-可进一步区分为¹⁵NO₃^-和¹⁴NO₃^-、N¹⁸O^-₃和N¹⁶O^-₃， 不同来源的NO₃^-具有不同的¹⁵N/¹⁴N和¹⁸O/¹⁶O比值特征，这些比值可通过同位素质谱仪精 确测定，因此，硝酸盐中氮氧同位素组成的差异为识别硝酸盐的污染来源提供了直接手段， 目前常用测定方法主要有高温燃烧法及反硝化细菌法，而反硝化细菌法具有低成本、前处理 简单、所需样品量少等优点，已成为先进的硝酸盐氮氧同位素测试方法。目前国内反硝化细 菌法测试硝态氮同位素应用还较少，而已有的文献方法也存在如下弊端：(1)反硝化细菌的 培养需要特制培养瓶，这在普通实验室难以找到；(2)反硝化细菌富集培养后是否将培养液 中的硝酸盐完全转化会N₂O，而不会影响后续样品测定，目前此指标检测方法缺乏；(3)与 样品产生的N₂O气体不能直接进行分析，需要将N₂O气体一次性全部注入连接在质谱仪上的样 品瓶后再进行分析，需要样品量大。综合分析目前国内没有形成一种详细可操作的反硝化细 菌法测试水体硝酸盐氮同位素的方法，因而限制了这一方法在水体硝酸盐污染溯源与治理中 的应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种反硝化细菌的培养及利用该反硝化细菌测定水体 硝酸盐氮同位素组成的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种反硝化细菌的培养及测定水体硝酸盐氮同位素方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)反硝化细菌的富集培养

将缺乏N₂O还原酶活性的反硝化细菌接种含有NO₃^-的TSB灭菌培养液在摇床上(26℃， 180rpm)培养，进行反硝化细菌的富集培养；

(2)检测反硝化细菌是否将培养液中NO₃^-转化完全

取步骤(1)所得菌液与磺胺显色液进行显色反应，如果菌液变为粉红色，说明反硝化细 菌并没有将培养液中NO₃^-完全转化为N₂O，而是停留在NO₂^-阶段，此瓶抛弃处理；如果菌液 不变色，可以进行后续实验；

(3)反硝化细菌的浓缩

将步骤(1)及通过步骤(2)检测的菌液在超高速离心机30000rpm，18℃离心20分钟， 倒出上层清液，剩余菌体用无NO₃^-的TSB培养液悬浮，浓缩成2倍的菌液；

(4)在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的N₂O

取步骤(3)所得浓缩菌液3mL注入容积为12mL试管中，每个试管用高纯氦气(流速为 10～20mL/min)吹扫3h以上；

(5)样品中NO₃^-转化为N₂O

在步骤(4)的试管中用注射器注入小于4mL的水样(总硝态氮量为0.5μg)，样品注入 后，上下颠倒以充分混匀；试管倒置放入设置26℃的恒温箱3h-24h；培养时间完毕后注入0.10 mL浓度为10mol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO₂；

(6)N₂O氮同位素测定

将步骤(5)所得试管产生的N₂O气体利用痕量气体分析仪(TraceGas)-同位素比质谱 仪(IRMS)测定，得到N₂O氮同位素组成测定值。

(7)氮同位素测试结果的校正

δ¹⁵N的标准采用δ¹⁵_NUSGS34＝-1.8‰，δ¹⁵N_USGS32＝+180‰；

氮同位素校正方程如下：+180‰＝m×δ¹⁵N_USGS32-meas+b①

-1.8‰＝m×δ¹⁵N_USGS34-meas+b②，

根据这两个标准样品的真实值(T)和测定值(M)，得到m和b，从而得到δ¹⁵N的校正方程。

然后重新培养反硝化细菌，进行下一批样品的测定。

步骤(1)所说的TSB培养液(含NO₃^-)配制方法为：30g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)，1.0 g KNO₃，0.5g(NH₄)₂SO₄，6.15g K₃PO₄·3H₂O，1000mL去离子水，分装到500mL盐水瓶中高压 灭菌60min。

步骤(1)所说的盐水瓶为总容积为580mL的医院常用输液瓶，瓶盖采用橡胶塞，盐水瓶内 装有460mL-480mL带有NO₃^-的TSB培养液，121℃灭菌60分钟，反硝化细菌转接后，将瓶 塞用封口膜密封，防止与外界的空气交换。

步骤(2)所说的磺胺显色液配制方法为：4g磺胺，10mL优质纯85％磷酸，0.1g N-1-萘基乙 二胺盐酸盐，定容到100mL，应为无色，如果变成粉红色就不能再用。

步骤(3)所说的无NO₃^-的TSB培养液配制方法为：30g TSB，0.5g(NH₄)₂SO₄，4.9g KH₂PO₄， 2000mL去离子水，分装到100mL的血清瓶中，高压灭菌60min备用。

步骤(4)所说的试管为内径10mm高100mm的试管，采用特氟龙硅胶垫及螺旋盖。

步骤(4)所说的高纯氦气吹扫采用氦气吹扫仪，试管倒立插在氦气针上，另外在硅胶垫上插 一个8cm长25gauge的针头，将试管中的空气及菌液中的N₂O用氦气置换出。

步骤(5)所说的水样加入量如果大于4mL，就需要在试管垫上加一个排气针以防止压力过大。

步骤(6)所说的痕量气体分析仪(TraceGas)-同位素比质谱仪(IRMS)，TracsGas配有Gilson 自动进样器，高纯氦气为载气，流量为50-60mL/min，参考标准气体为校正过的99.9％N₂O 气体。将步骤(5)所得试管放置于自动进样器配置的试管架上，通过Gilson自动进样器将 N₂O气体输送至TraceGas，经TraceGas提取纯化和捕集N₂O气体，最后由同位素比质谱仪测 定氮同位素组成。

相对于现有技术，本发明具有以下优良效果：

1、采用易获得的普通盐水瓶培养反硝化细菌，减少了特制培养瓶的寻找、订制生产等一系 列繁琐手续，同时降低了反硝化细菌的培养成本；

2、本发明采用磺胺显色液检测反硝化细菌培养过程中是否将培养液本身的硝酸盐消耗完 毕，操作简单，排除了培养液内部硝酸盐对样品硝酸盐的影响，提高了测定结果的可信度。

3、本发明的方法测定硝酸盐氮同位素组成省时省力，降低了测试成本，为硝酸盐污染溯源 工作提供了重要的研究手段。

4、本发明的方法针对了我国目前水体硝酸盐污染严重亟需治理的现状，具有科学性、简便 性、可操作性强的优势，推广前景广阔。

具体实施方式

以下给出本发明一种反硝化细菌培养及测定水体硝态氮同位素组成的方法的具体实施方 式，以对本发明的方法进行详细的说明，但本发明的保护范围不限于以下的实施介绍，凡依 照本发明的方法所作的等效的变化或变通，都应视为本发明保护的范畴。

实施例1：

一种反硝化细菌培养及测定水体硝态氮同位素组成的方法，包括以下步骤：

(1)反硝化细菌的富集培养

在每升去离子水中加入30g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)，1.0g KNO₃，0.5g(NH₄)₂SO₄， 6.15g K₃PO₄·7H₂O，分别取480mL装到两个盐水瓶中，另外取2个5mL装到试管中，胶塞 封口，高压灭菌60min，构成反硝化细菌富集培养液；将缺乏N₂O还原酶活性的反硝化细菌 致金色假单胞菌P.aureofaciens接种到5mL有NO₃^-的TSB灭菌培养液的试管中，在摇床上 (26℃，180rpm)培养一天，第二天将这5mL菌液转接到含NO₃^-的480mLTSB灭菌培养液 的盐水瓶中并在摇床上(26℃，180rpm)培养一周，进行反硝化细菌富集培养；

(2)检测反硝化细菌是否将培养液中NO₃^-转化完全

步骤(1)所得菌液取1mL，加80μL磺胺显色液，如果菌液变为粉红色，说明反硝化细 菌并没有将培养液中NO₃^-完全转化为N₂O，而是停留在NO₂^-阶段，此瓶抛弃处理；如果菌液 不变色，可以进行后续实验；

(3)反硝化细菌的浓缩

将步骤(1)及通过步骤(2)检测的菌液200mL倒入200-mL离心瓶中，在超高速离 心机30,000rpm，18℃离心20分钟(细菌应该在瓶底成团状)，弃掉上层清液(注意不要搅 乱细菌团)，从一个100-mL无NO₃^-的培养基中分别取出10ml加到每个瓶中，充分震荡以 重新悬浮细菌，把重新悬浮的细菌转移到一个200-mL的烧杯中，用剩余的无NO₃^-培养基清 洗离心瓶，把它们都合到200-mL的烧杯中，加10滴止泡剂B(购自Sigma公司)；

(4)在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的N₂O

取步骤(3)所得浓缩菌液3mL注入容积为12mL试管中，试管为内径15mm高100mm 的试管，采用特氟龙硅胶垫及螺旋盖，每个试管用高纯氦气(流速为10～20mL/min)吹扫3h 以上；

(5)样品中NO₃^-转化为N₂O

在步骤(4)的试管中用注射器注入0.8mL河水样品(硝态氮含量为1.58mg/L)，样品 注入后，上下颠倒以充分混匀；试管倒置放入恒温箱26℃过夜培养。第二天注入0.10mL浓 度为10mol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO₂；

(6)N₂O氮同位素测定

将步骤(5)所得试管产生的N₂O气体利用痕量气体分析仪(TraceGas)-同位素比质谱 仪(IRMS)测定，得到测定值δ¹⁵N＝-2.35‰。

(7)氮同位素测试结果的校正

δ¹⁵N的标准采用δ¹⁵N_USGS34＝-1.8‰，δ¹⁵N_USGS32＝+180‰；

氮同位素校正方程如下：+180‰＝m×δ¹⁵N_USGS32-meas+b①

-1.8‰＝m×δ¹⁵N_USGS34-meas+b②，

根据USGS34和USGS32的测定值和真实值，得到δ¹⁵N的校正方程为T＝1.07*M+5.56，从而 得到该河水样品的硝态氮δ¹⁵N＝3.03，根据文献，这个值溯源表明该河水硝酸盐污染来自于化 肥。

由此可见，用本发明的方法测试河水硝态氮同位素组成是完全可行的。

实施例2：

一种反硝化细菌培养及测定水体硝态氮同位素组成的方法，其具体操作步骤为：

步骤(1)到(3)同实施例1。

(4)在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的N₂O

取步骤(3)所得浓缩菌液3mL注入容积为20mL钳口顶空样品瓶中，每个样品瓶用高 纯氦气(流速为10～20mL/min)吹扫3h以上；

(5)样品中NO₃^-转化为N₂O

在步骤(4)的试管中用注射器注入0.5mL地下水样品(硝态氮含量为25.75mg/L)，样 品注入后，上下颠倒以充分混匀；试管倒置放入恒温箱26℃过夜培养。第二天注入0.10mL 浓度为10mol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO₂；

(6)N₂O氮同位素测定

将步骤(5)每个顶空样品瓶产生的N₂O气体用气密性注射器抽取2mL注入提前抽真空 的试管中，通过Gilson自动进样器将N₂O气体输送至TraceGas，经TraceGas提取纯化和捕 集N₂O气体，最后由同位素比质谱仪测定氮同位素组成，得到测定值δ¹⁵N＝6.20‰。

步骤(7)同实施例1，得到该地下水样品的硝态氮δ¹⁵N真实值为12.21，根据文献，这个值表 明该地下水样品中硝酸盐污染主要来自于粪肥。

由此可见，用本发明的方法测试地下水硝态氮同位素组成是完全可行的。

实施例3：

一种反硝化细菌培养及测定水体硝态氮同位素组成的方法，其具体操作步骤为：

(1)反硝化细菌的富集培养

在每升去离子水中加入30g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)，1.0g KNO₃，0.5g(NH₄)₂SO₄， 6.15g K₃PO₄·7H₂O，分别取520mL装到两个500-mL三角瓶中，另外取2个5mL装到试管中， 胶塞封口，高压灭菌60min，构成反硝化细菌富集培养液；采用反硝化细菌菌株为绿针假单 胞菌P.chlororaphis，富集培养步骤同实施例2(1)；

步骤(2)到步骤(4)同实施例2；

(5)样品中NO₃^-转化为N₂O

在步骤(4)的钳口顶空瓶中用注射器注入5mL雨水样品(硝态氮含量为0.21mg/L)， 样品注入后，上下颠倒以充分混匀，并在瓶垫上加一个排气针，倒置放在一个试管架上放入 恒温箱26℃过夜培养。第二天注入0.10mL浓度为10mol/L的NaOH，消散细菌后终止反应， 同时吸收产生的CO₂；

步骤(6)-(7)同实施例2，得到该雨水样品的硝态氮δ¹⁵N真实值为0.16，根据文献，这个值 表明该雨水中硝酸盐来源主要与空气中氮沉降及地面化肥氨挥发有关。

由此可见，用本发明的方法测试雨水硝态氮同位素组成是完全可行的。