自目标多核苷酸和非目标多核苷酸的混合物富集目标多核苷酸或非目标多核苷酸的方法和组合物

摘要

提供了从非目标和目标多核苷酸的混合物富集非目标多核苷酸的组合物和方法，其中目标多核苷酸与非目标多核苷酸之间的差异包括修饰碱基的程度，其以比在非目标多核苷酸中更大的密度存在于目标多核苷酸中。这使目标多核苷酸选择性地和快速地结合至亲和基质如亲和蛋白质涂布的磁珠，在上清液中提供非目标多核苷酸的富集。该富集的一种应用是从得自人组织样本的DNA混合物去除人基因组DNA以富集微生物多核苷酸，从而通过DNA测序表征微生物。

说明书

背景

病毒、细菌、酵母菌和真核多细胞生物在自然界可以以复合群丛共存。该类型群丛的实例是微生物，其寄居于哺乳动物宿主中。快速DNA测序技术已被用于考察微生物。关于样本中哺乳动物基因组DNA的存在和含量——其影响信噪比——的不确定性不利地影响物种识别的准确性。这在目标DNA以极少量存在于高本底宿主基因组物质中的情况下特别有问题。

Zhigang Wu，等(Lab Chip，9：1193-1199(2009))开发了微流体装置以将细菌细胞与人血液细胞物理分离，其基于柔和惯性力引起的迁移，利用微流体装置中流动限定的、曲线的和聚集的样本流动，导致细菌300倍富集。此细胞分离类型仅可减少两种细胞类型之间的DNA本底污染——如细胞可存活。

用于分离血液中脓毒症致病细菌DNA的另一方法取决于用离液剂选择性裂解人有核细胞(MolYsis，Molzym GmbH，Bremen，Germany)。该方法还取决于活细胞。利用抗盐DNA酶降解裂解的细胞中的人DNA，而DNA酶不影响完整的细菌细胞。然后将DNA酶灭活，提取和提纯细菌DNA用于分析。该技术使样本中的人DNA总浓度降低99.5％。但是，细菌DNA的总回收率很低，仅为预期总量的30％(Horz，等，Anaerobe 16：47-53(2010))。

在目标DNA的损失最小化和不要求活细胞是DNA来源的条件下，目前没有从包含DNA混合物的环境样本富集目标DNA的令人满意的方法。

概述

在本发明的实施方式中，提供了这样的组合物：其包含大小各自在10-100kb范围内的非目标多核苷酸和目标多核苷酸的混合物。该组合物还包含基质，该基质涂布有蛋白质或多肽结构域以形成亲和基质。该亲和基质的实例包括选自UHRF1(SRA)、CXX1、DNMT1、MBD或其甲基结合变体的甲基结合结构域(MBD)。这些甲基结合蛋白质可借助融合于MBD——其结合涂布于基质上的蛋白质A——的Fc部分连接于基质。该基质的实例包括磁珠。

亲和基质选择性地结合包含修饰碱基——例如碱基是甲基化的胞嘧啶——的目标多核苷酸。修饰碱基可以200个碱基中至少1个修饰碱基的频率存在。组合物进一步包含缓冲液，该缓冲液包含有效量如10mM-800mM的盐和非离子型洗涤剂。

在本发明的实施方式中，提供了从混合物富集核苷酸的方法，包括：(a)得到上述组合物；(b)使目标多核苷酸结合亲和基质；和(c)在上清液部分得到非目标多核苷酸的富集制备物。

在上述方法的进一步实施方式中，上清液中的非目标多核苷酸由富集前混合物中至少90％的非目标多核苷酸组成，和/或上清液中的目标多核苷酸由富集前混合物中不高于10％的目标多核苷酸组成。

在上述方法的进一步实施方式中，富集前多核苷酸混合物得自生物样本，包含原核生物和哺乳动物基因组DNA，其中混合物包含至少50％哺乳动物基因组DNA。

在上述方法的进一步实施方式中，通过测序、克隆或扩增分析上清液中的非目标多核苷酸以确定非目标多核苷酸的基因组同一性。

在本发明的进一步实施方式中，提供了增强包含与鸟嘌呤相邻的甲基化的胞嘧啶(CpG)的多核苷酸与未甲基化的多核苷酸分离的方法，包括：提供上述组合物，其中修饰碱基是甲基化的CpG；使CpG-甲基化的多核苷酸结合亲和基质，以形成固定化在基质上的产物；和对结合多核苷酸或未结合多核苷酸中的至少一种进行扩增和/或测序。

此外，甲基化和未甲基化的多核苷酸的混合物可包含一种或多种细菌基因组和一种或多种哺乳动物基因组的片段。

在本发明的另一个实施方式中，提供了组合物，其包含：含甲基化CpG的目标DNA，目标DNA能结合MBD珠；非目标DNA，不能容易地结合缓冲液中的MBD珠，该缓冲液包含100mM-800mM NaCl；和非离子型洗涤剂。目标DNA和非目标DNA优选大小在10-100kb的范围内。

附图简述

图1显示了富集目标DNA(1)和包含5-甲基CpG(3)的非目标DNA(2)的混合物中的目标DNA的示意性工作流程。将(1)和(2)与磁珠(4)混合，磁珠(4)已涂布有蛋白质A(7)，该蛋白质A(7)上的甲基结合结构域(MBD2A)在非离子型洗涤剂(5)存在的情况下融合Fc(6)以形成MBD2A-Fc珠。真核生物基因组DNA(3)结合MBD珠(4)。磁体(8)吸引结合MBD珠的非目标DNA，将目标DNA(1)留在上清液中。

图2显示NaCl对于MBD珠降低甲基化DNA的影响。凝胶上的带相应于Hela细胞或大肠杆菌(E.coli)细胞的DNA混合MBD珠后上清液中的DNA。显示由50mM至450mM以50mM增量递增的不同盐浓度的结果。上清液中可见一些HelaDNA高达200mMNaCl。

图3显示MBD珠降低甲基化DNA的1％琼脂糖凝胶上得到的结果。将500ng提纯的哺乳动物基因组DNA和50ng大小为10-20kb的氚化大肠杆菌DNA组合不同量的MBD珠，并回收和用(Life Technologies，Carlsbad，CA)染色在1％琼脂糖凝胶上分析DNA。利用密度测定法测定用不同浓度的珠处理后保留在上清液中的哺乳动物DNA量。通过闪烁计数法测定与珠混合前和后的大肠杆菌DNA量。

利用无珠(c)或20μl或40μl(200μg/ml)MBD珠测试各个样本。上图从左至右开始的基因组DNA提纯自：Jurkat 2，HCT 1161，HCT 1162，IMR 90，3T3鼠，Hela和Jurkat 1细胞系。IMR 90细胞用20μl MBD珠以及其他细胞类型用40μl MBD珠实现这些DNA的有效去除。

与起始量相比时，单个样本高于92％的哺乳动物基因组DNA(所有测试样本平均97％)被MBD珠去除，而至少80％大肠杆菌DNA——平均90％——保留在上清液中。

图4显示利用不同体积的MBD珠(200μg/ml)对恒定量的人(IMR 90)和细菌(大肠杆菌)DNA(10∶1)的富集效果，其中DNA片段的大小为至少20kb。在Ion Torrent^TM Personal Genome Machine(PGM)^TM System(Life Technologies，Carlsbad，CA)中分析上清液。如比对的序列读取确定，MBD珠结合的DNA为99.5％人DNA，而上清液中DNA的比对序列读取为96％大肠杆菌。在MBD珠不存在的情况下，人DNA与大肠杆菌DNA的比对序列读取比为约80％比约20％。

图5显示自人唾液样本提纯的DNA的SOLiD^TM 4测序结果(Life Technologies，Carlsbad，CA)。在MBD珠不存在的情况下，输入DNA样本显示96％的DNA的读取与人类比对，而仅4％的DNA测序读取与口腔微生物数据库(人口腔微生物数据库(HOMD)(www.HOMD.org))比对(Chen等，Database(Oxford).doi：10.1093/database/baq013(2010))。用20μl MBD珠富集后，上清液包含10％与人比对的DNA读取和90％与HOMD比对的序列读取。用40μl MBD珠处理后，上清液包含6.5％与人DNA比对的读取和93.4％与HOMD的比对读取。

图6A和6B显示相比MBD珠富集不存在时得到的结果，通过去除宿主DNA利用MBD珠提供细菌DNA富集而分析人唾液样本中微生物的有效性的提高。

图6A显示对富集前和后150种已知口腔微生物(x轴上编号1-150)绘制的测序读取。利用Bowtie 0.12比对软件(Langmead等.Genome Biology 10：R25(2009).doi：10.1186/gb-2009-10-3-r25)，将读数与HOMD中特定的150种不同的细菌物种进行比对。总体上，富集样本的比对读取数增加10倍，并且无物种多样性损失。

图6B提供了相应于图6A的图中X轴编号的细菌物种。

实施方式详述

“目标”多核苷酸可指具有特定所需特征的多核苷酸，其中该特征可以是多核苷酸中的核苷修饰。“非目标”多核苷酸没有该特征。该特征可使多核苷酸能够特异性结合固定在固体支持物或基质上的亲和结构域。

目标多核苷酸的实例包括以高于1/200碱基的密度天然包含修饰碱基——例如甲基化胞嘧啶——的哺乳动物基因组DNA。非目标多核苷酸的实例包括不含有修饰碱基或以低于1/200碱基的密度含有修饰碱基的原核生物基因组DNA。在某些情况下，可能希望有效地得到具有修饰碱基的DNA，其中修饰碱基以能使该DNA从包含修饰或未修饰DNA的DNA混合物富集的密度存在，而在其他情况下，修饰或未修饰DNA是特别感兴趣的，可优先被回收以用于进一步分析。

“修饰”多核苷酸是由于添加侧基如甲基、羟甲基、5-甲酰基甲基或羧基甲基而包含至少一种不同于A、G、T或C的特定碱基的多核苷酸。修饰碱基的实例包括：5-甲基胞嘧啶、N-6甲基腺嘌呤和N-4甲基胞嘧啶。修饰碱基可进一步衍生为包含标记剂，然后其可被亲和剂捕获。例如，5-hmC可用修饰的葡萄糖糖基化，该修饰的葡萄糖包含生物素。

本发明的实施方式提供了从非目标多核苷酸分离目标多核苷酸的方法。这些方法利用目标DNA与非目标DNA中修饰核苷酸的密度的天然存在差异实现了目标多核苷酸的富集。例如，为测序微生物DNA(目标DNA)，需要从得自生物样本(如人源性唾液、粘膜、血液或组织活组织检查)的DNA混合物去除污染性哺乳动物基因组DNA(非目标DNA)。微生物DNA与哺乳动物基因组DNA中修饰碱基的密度差异导致哺乳动物基因组DNA选择性结合亲和基质，而微生物DNA留在上清液中。

该方法提供了可在15分钟内完成的目标DNA快速一步富集。该方法具有这样的优势：快速且避免进一步提纯步骤以从亲和基质去除非特异性结合的目标DNA。然后可用标准技术测序富集的DNA，和快速测定微生物含量(参见图6A)。

发现在目标和非目标多核苷酸的快速、选择性和特异性富集中发挥作用的参数包括下列中的一个或多个：

(a)用于结合修饰多核苷酸的蛋白质涂布的亲和结合基质

本文所用的“亲和基质”与亲和蛋白质或结构域连接以结合含修饰碱基的多核苷酸的基质。在本发明的实施方式中，珠，更具体地磁珠，被用作亲和基质，其中磁珠类型是，例如，羧基化聚苯乙烯珠(例如Seradyn，来自Thermo Scientific，Waltham，MA的珠)或羧基化聚氯乙烯珠(例如，来自Chemagen，PerkinElmer，Waltham，MA)，更具体地聚苯乙烯珠。各实例示例了亲和蛋白质涂布的聚苯乙烯磁珠的应用，其中聚苯乙烯磁珠可获自England Biolabs，Inc.(NEB)，Ipswich，MA。

亲和蛋白质或结构域包括，例如，抗体如蛋白质A、限制性内切核酸酶如PvuRts1I或其修饰形式、葡萄糖基转移酶结构域和/或修饰核苷结合结构域或其变体如甲基结合结构域。对DNA或RNA中的CpG-甲基化胞嘧啶具有结合特异性的亲和蛋白质实例包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3或MBD4(美国7,670,773)。这些实例共享70个残基的MBD(美国专利申请公开号2008/0260743)。这些蛋白质或其变体中任一个均可用于涂布上述珠，在此被称为MBD。其他能结合DNA中的甲基化胞嘧啶的分子包括核酶或其他多核苷酸、蛋白质如抗体、UHRF1(SRA结构域、如来自人UHRF1的结构域)或鼠NP95、CXXC1、DNMT1蛋白及其修饰形式或不再具有切割活性但保持其DNA结合特异性的限制性内切核酸酶变体(参见例如，Qian，J.Biol.Chem.283：34490-34494(2008)；Voo，等，Mol Cell Biol.20(6)：2108-2121(2000)；Pradhan，等，J.Biol.Chem.，274：33002-33010(1999))。

上述蛋白质可连接至间隔区以设计结合蛋白质以期望的距离间隔珠表面，该由样本缓冲液中所用非离子型洗涤剂的聚合物长度确定。

各实例描述了“MBD珠”的应用。这些为涂布蛋白质A的磁珠，该蛋白质A结合MBD2a-Fc，其比例为2分子MBD2a-Fc比1分子蛋白质A。

MBD2a-Fc具有如下氨基酸序列：

人MBD2[AA 144-230]

ESGKRMDCPALPPGWKKEEVIRKSGLSAGKSDVYYFSPSGKKFRSKPQLARYLGNTVDLSSFDFRTGKMMPSKLQKNKQRLRNDPL(SEQ ID No.1)。

挠性连接体

AAADPIEGRGGGGG(SEQ ID No.2)。

人IgG1[AA 99-330]Fc区域

DPKSSDKPHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID No.3)。

本方法的实施方式利用MBD珠以有效且快速地分离相对于包含约4％与鸟嘌呤相邻的甲基化胞嘧啶(mCpG)的哺乳动物DNA少含或不含甲基化CpGs的原核生物DNA。

(b)缓冲液中的盐

包含多核苷酸和亲和结合基质的混合物的缓冲液中的盐含量被发现用于测定能结合上述亲和基质的多核苷酸中甲基化碱基的密度。适用于富集的盐包括在10mM-800mM范围内的NaCl、KCl或其他盐。实例是150-450mM的NaCl。

盐浓度可如图2所示改变以确定包含对于多核苷酸结合亲和基质的修饰碱基阈含量的多核苷酸的结合。在此，由NaCl示例的盐的存在增强修饰DNA与亲和基质(MBD珠)的结合，这导致宿主基因组DNA的去除，如上清液中Hela DNA减少所示。例如，在300mM盐存在时，仅比未修饰DNA多至少3倍至6倍甲基化CpG的多核苷酸片段结合亲和基质。对于约4％甲基化的人基因组多核苷酸片段，预期20kb片段包含800个甲基化碱基，使得这些多核苷酸在300mM盐中容易地结合亲和基质。相反，可具有少于3个甲基化CpG的多核苷酸在该盐浓度下不结合亲和基质。

(c)非离子型洗涤剂

虽然不希望被理论约束，但在此提出非离子型洗涤剂增强亲和基质的疏水性，以减少基本未甲基化的多核苷酸的非特异性结合。一种或多种特征在于不带电的亲水首基的非离子型聚合洗涤剂可以以低于1％的浓度，更特别是低于0.5％的浓度应用，如X(Union Carbide Corp.，Midland，MI)、(Uniquema AmericasLLC，Wilmington，DE)、Nonidet^TM P-40(Shell Brands International，Zug，Switzerland)，或优选地聚山梨醇酯(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)(Uniqema Americas LLC，Wilmington，DE)如Tween 20、Tween 80、Tween 100。

上述非离子型洗涤剂和盐的应用导致未甲基化CpG多核苷酸至MBD珠的非特异性吸附明显减少。

(d)珠的体积

以适当的分析测试提供预期富集效果的珠的体积，如实施例3所述。在所述条件下，该实施例中显示，20μl-40μl珠(4-8μg MBD2a-Fc负载于200μg-400μg蛋白质A涂布的磁珠上)对于结合250ng DNA是最佳的。

(e)多核苷酸的大小

目标或非目标多核苷酸的富集优选以大小在约10-100kb范围内的大分子量多核苷酸分子实现，例如，大小在约10kb-20kb范围内的多核苷酸。富集前从细胞提纯DNA的方法在本领域已知。优选利用不造成剪切的方法，因此应避免超声波法或喷雾法。取而代之，优选裂解细胞和利用蛋白酶K，然后进行温和的有机提取程序(利用氯仿和苯酚(或乙醇)进行相分离和用乙醇进行沉淀)和/或分级柱提纯和/或琼脂糖制备型凝胶电泳(Sambrook，等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rd ed.pp.6.4-6.12，Cold Spring Harbor Lab Press，Cold Spring Harbor，NY，(2001))。

在此将本文应用的全部参考文献以及2011年4月2日提交的美国临时申请号61/471,134、2011年9月22日提交的美国临时申请号61/537,761、2012年2月14日提交的美国临时申请号61/598,715和2012年2月15日提交的美国临时申请号61/599,253并入作为参考。

实施例

实施例1：MBD珠用于未修饰DNA富集的适用性

MBD珠得自NEB，Ipswich，MA(目录#E2600)。

DNA通过裂解细胞和氯仿-苯酚提取而制备——其导致相比于超声波法(超声处理)DNA剪切减少，并且提供长度至少10-20kb，优选地至少20kb的片段。

盐浓度的滴定：将250ng输入性提纯的DNA(来自HeLa或大肠杆菌)与40μl MBD珠在缓冲液中温育，该缓冲液包含10mM Tris，pH 7.5、1mM EDTA、1％Triton×100、0.1％ Tween 80(聚山梨醇酯80，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和增加浓度的NaCl(50mM至450mM)。在室温下温育样本10分钟，然后在反应容器外部存在磁体的情况下从其余样本分离MBD珠。将各个样本的上清液加载于1％琼脂糖凝胶上，并通过溴化乙锭染色进行分析。图2显示，在所有NaCl浓度下Hela DNA通过MBD珠从上清液有效去除，而大肠杆菌DNA留在上清液中。

珠的体积：将250ng来自哺乳动物细胞系(Hela、Jurkat、HCT 116、3T3)和正常非癌症胎儿肺成纤维细胞细胞系(IMR 90)的各种提纯基因组DNA与20μl或40μl MBD珠或仅涂布蛋白质A的珠一起温育。(20μl MBD珠＝4μg MBD2a-Fc加载于200μg蛋白质A涂布的磁珠上，40μl MBD珠＝8μg MBD2a-Fc加载于400μg蛋白质A涂布的磁珠上。(贮存蛋白质A磁珠(NEB)具有10mg/ml的浓度。贮存MDB2a-Fc具有2mg/ml的浓度(NEB))。

温育样本15分钟，将上清液去除、加载于1％琼脂糖凝胶上，并通过SYBR绿色DNA染色分析。当40μl MBD珠用于反应时，实现DNA从上清液有效去除。在20μl珠时观察到IMR 90DNA的有效去除。

实施例2：从原核生物DNA分离哺乳动物DNA的效力

向如上述制备的40μl MBD珠(200μg/ml)添加DNA混合物(约250ng总DNA)——该DNA混合物由长度至少20kb的哺乳动物DNA(人Jurkat)和细菌DNA(大肠杆菌菌株ER 1506)的50∶50混合物组成，并温育约10分钟。然后将样本管置于磁机架上5分钟以浓缩结合双链CpG甲基化的DNA的MBD珠。

小心地去除含有原核生物、病毒或宏基因组(metagenomic)DNA的上清液，留下粘附于MBD珠的真核生物或人DNA。利用热和含有蛋白酶K的Tris缓冲液从MBD珠提取该DNA。在1％琼脂糖凝胶上分析上清液DNA。

利用Ion Torrent PGM测序仪进一步分析琼脂糖凝胶上相应于上清液中20kb未结合的大肠杆菌DNA的带，从而分析存在的DNA(参见图5)。

发现至少95％的人DNA(CpG-甲基化)保持结合于磁珠基质，而未CpG-甲基化的细菌DNA留在上清液中，其回收率高于95％。

实施例3：分析人唾液的微生物基因组

任何提纯无RNA和无蛋白质基因组DNA的方法均可被应用，如，例如，蛋白酶K处理，然后进行苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀、溶菌酶消化、Qiagen(Valencia，CA)柱制备(对于基因组DNA)或其他方法。避免超声波法(超声处理)、喷雾法、离液盐、酶处理、粗处理或任何其他会引起DNA剪切的程序，因为从哺乳动物DNA分离微生物DNA在DNA片段大小大于10-20KB且不包含小分子量片段时是最佳的(Sambrook，等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版.第6.4-6.12页，Cold Spring Harbor Lab Press，Cold Spring Harbor，NY，(2001))。从唾液提取的DNA质量和数量可通过附有DNA标记的样本的琼脂糖凝胶电泳确定(2-log DNA梯带，NEB#N3200S，Ipswich，MA)。

在本实施例中，正常人唾液获自创新研究(Innovative Research)(Novi，MI)。将250ml唾液加至10μl 1M Tris-HCL pH.7.5、5μl 500mM EDTA、5μl 20％SDS、3μl 20mg/ml蛋白酶K(NEB#P8102S，Ipswich，MA)，在50℃下温育2小时，并进行乙醇提取。将小球风干，悬浮于25ml缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA、100μl RNA酶A(10mg))中，并在37℃下温育1小时。用Tris-EDTA平衡的苯酚提取分离的产物，用二氯甲烷提取一次释放的产物，并加入2体积乙醇(ETOH)。然后将产物旋转，并将小球如上风干和重新悬浮于250μl TE中，给出最终浓度150μg/ml，总计37.5μg。

琼脂糖凝胶分析显示，～50％DNA降解至10kb以下。为进一步纯化DNA和富集高分子量片段，将样本加载于1％低熔融琼脂糖凝胶，加上1×SYBR安全DNA凝胶染色(1×SYBR Safe DNA Gel Stain)(Life Technologies，Carlsbad，CA)。将～10-15kb的大带切离凝胶，加热至50℃，并且将10单位β琼脂水解酶I(BetaAgarase I)(NEB #M0392S，Ipswich，MA)加100μl 10×反应缓冲液，总体积为1ml，加至样本，并在42℃下温育30分钟。将2体积ETOH加至样本，旋转，干燥，和悬浮于上述TE。

对第二个250ml集中的等份额量唾液样本重复上述程序，并将两个纯化DNA样本组合，将DNA浓度调节至70μg/ml；总产量为40μg。

将上述提纯的人唾液DNA以如下比例与MBD珠混合：250ng DNA比20μlMBD珠或40μl MBD珠。在不利用MBD珠富集原核生物DNA时，DNA样本显示96％的DNA读取与人类比对，而仅4％的DNA测序读取与HOMD比对。

在用20μl MBD珠富集后，10％DNA读取与人类比对，90％读取与HOMD比对。在用40μl MBD珠处理后，6.5％读取与人类比对，93.4％与HOMD比对(图6A)。

实施例4：富集人线粒体DNA

人线粒体DNA是约16.5kb的环状DNA分子。其编码37个基因：13个是呼吸复合物I、III、IV和V亚基的基因，22个是线粒体tRNA的基因(20种标准氨基酸，和另外的亮氨酸和丝氨酸基因)，2个是rRNA的基因。一个线粒体可包含2至10个其DNA拷贝(Chan，Cell，125(7)：1241-1252(2006).doi：10.1016/j.cell.2006.06.010.))。许多疾病与线粒体DNA缺陷有关，因此需要富集线粒体DNA。利用本文所述的方法，将两个输入样本(4.75×10⁵碱基)与四个富集的上清液样本(1.6×105碱基)和两个小球样本(1.5×10⁶碱基)进行比较，其利用在Ion Torrent PGM System中分析IMR 90DNA。利用Bowtie 0.12比对软件将所有碱基读取均与人基因组(hg19)比对，并进行染色体分布。发现MBD上清液样本与输入样本相比具有160倍的线粒体DNA富集。相反，小球不包含可检测到的线粒体DNA。