藏药唐古特乌头及其制剂中生物碱的质量检测方法

摘要

本发明公开了一种藏药唐古特乌头及其制剂中生物碱的质量检测方法，包括鉴别、检查和含量测定项目，鉴别是以唐古特乌头对照药材为对照、以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂的薄层色谱法；检查是以乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品的混合溶液为对照，以乙腈-四氢呋喃为流动相A，以醋酸铵水溶液加冰醋酸为流动相B进行梯度洗脱的高效液相色谱法；大麦芽碱含量测定是以大麦芽碱对照品为对照，以乙腈-磷酸二氢钾水溶液为流动相的高效液相色谱法；总生物碱含量测定采用反滴定法。本发明稳定可靠，专一性强，能够确保藏药唐古特乌头及其制剂中生物碱的安全、有效、质量可控，有较大的科学性和应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种质量检测方法，具体涉及一种藏药唐古特乌头及其制剂中生物碱的质量 检测方法。该方法包括唐古特乌头中生物碱及其制剂八味獐牙菜丸中生物碱、十一味金色丸 中生物碱、十三味榜嘎散、安儿宁颗粒中生物碱的质量检测方法。

背景技术

唐古特乌头(Herba Aconiti Tangutici)，为毛茛科植物甘青乌头(唐古特乌头)Aconitum  tanguticum(Maxim.)Stapf和船盔乌头Aconitum naviculare(Bruhl.)Stapf的干燥全草。夏末秋 初开花期连根采挖，除去杂质，阴干。本品性凉，味苦，具有清热解毒，生肌收口，燥湿之 功效。功能主治清热解毒，主要用于肝热、胆热、肺热、肝炎、肺炎、胃肠炎、流行性感冒、 传染病引起的发烧、食物中毒、蛇蝎咬伤以及黄水病。

乌头属药用植物大多以块根、根入药，多具有祛风除湿、温经止痛之功效，其中主要成 分是双酯型生物碱，约占总重的7%~10%，具有显著的生理活性，一般需要进行炮制以降低 药性。唐古特乌头以全草入药，草本高10～30cm，块根2，小形，其主要药效成分生物碱主 要为内酯型二萜生物碱，含有少量的双酯型生物碱成分，不需进行炮制即可入药，但服用过 量有可能带来健康隐患。唐古特乌头收载于《藏药部颁标准》，藏药名榜嘎，为藏药成方制剂 中常用药材，同时是具有藏药特色的药材代表，部颁标准仅使用显微鉴别控制其药材质量， 很难保证药材使用安全、有效，因此有必要建立一种科学的质量检测方法对唐古特乌头及其 制剂的质量进行评价。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种藏药唐古特乌头及其制剂中生物 碱的质量检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种藏药唐古特乌头的质量检测方法，它包括鉴别、检查和含量测定项目，所述鉴别是 以唐古特乌头对照药材为对照、以体积份数比为5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为 展开剂在硅胶G薄层板上展开、以碘化铋钾溶液为显色剂的薄层色谱法；所述检查是对药材 中所含双酯型生物碱的检查，其是以乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品的等 量混合溶液为对照，以体积份数比为25:15的乙腈-四氢呋喃为流动相A，以每1000ml0.1mol/l 醋酸铵水溶液加0.5ml冰醋酸为流动相B进行梯度洗脱的高效液相色谱法；所述含量测定包 括对药材中所含大麦芽碱的含量测定和总生物碱的含量测定，所述大麦芽碱含量测定是以大 麦芽碱对照品为对照，以体积份数比为10:90的乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液并用三乙 胺调节PH至7.2为流动相的高效液相色谱法；所述总生物碱含量测定是采用体积份数比100:1 氯仿-氨水的混合溶液提取，合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，加入活性炭脱色， 振摇，脱色，加入硫酸滴定液，使用氢氧化钠滴定液，以甲基红为指示液的反滴定法。

所述检查中梯度洗脱的过程如下：

所述鉴别具体为：

取待检测药材粉末（过三号筛）1g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250 W，频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取 唐古特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上， 以体积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 稀碘化铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

所述检查具体为：

取待检测药材粉末（过三号筛）2g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放 冷，称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精 密量取续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml， 振摇使溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中， 用二氯甲烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨 试液调PH至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l 硫酸溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、 次乌头碱对照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、 次乌头碱、新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共 和国药典》2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数 比25:15的乙腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml） 为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计 算应不低于2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定， 即得。

本品按干燥品计算，含双酯性生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO₁₁）、次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₀） 和新乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₁）的总量计，不得过0.1mg/g。

所述大麦芽碱含量测定具体为：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测药材粉末（过三号筛）1g，精密称定，置锥形瓶中，加入 体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重 量，用体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压 低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000 转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提 取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）不得少于0.2mg/g。

所述总生物碱含量测定具体为：

取待检测药材粉末（过三号筛）5g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

本品按干燥品计算，含生物碱以大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）计，不得少于3.6mg/g。

本发明还提供了一种药物制剂中唐古特乌头生物碱的质量检测方法，采用上述方法对制 剂中唐古特乌头生物碱进行质量检测。

药物制剂中唐古特乌头生物碱的质量检测方法具体为：

薄层色谱鉴别：

取待检测制剂粉末（过三号筛）5-8g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250 W，频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取 唐古特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

双酯型生物碱检查：

取待检测制剂粉末（过三号筛）8-15g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份 数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放冷， 称定重量，用体积份数比1:100的盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量 取续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，振摇 使溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中，用二氯 甲烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨试液调PH 至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l硫酸溶解， 转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、次乌头碱对 照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比25:15的乙 腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

大麦芽碱含量测定：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测制剂粉末（过三号筛）4-6g，精密称定，置锥形瓶中，加 入体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定 重量，用体积份数比100:1的氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml， 减压低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速 为8000转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯 振摇提取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

总生物碱含量测定：

取待检测制剂粉末（过三号筛）20-30g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1 氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色；每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

所述制剂为八味獐牙菜丸、十一味金色丸或十三味榜嘎散、安儿宁颗粒。

本发明的有益效果是，采用薄层色谱法定性鉴别唐古特乌头及其制剂中含有的生物碱成 分，该法简便、可靠、专属性强；采用高效液相色谱法检查唐古特乌头及其制剂中含有的双 酯型生物碱成分；采用高效液相色谱法定量测定唐古特乌头及其制剂中含有的大麦芽碱含量， 大麦芽碱具有药理活性很多方面类似麻黄碱，为唐古特乌头指标性成分，控制其质量，可有 效保证唐古特乌头质量，进而保证了患者用药的安全。本发明质量控制方法稳定可靠，专一 性强，能够确保藏药唐古特乌头及其制剂中生物碱的的安全、有效、质量可控，有较大的科 学性和应用价值。

附图说明

图1是唐古特乌头中双酯型生物碱检查空白溶剂的高效液相色谱图；

图2是唐古特乌头中双酯型生物碱检查乌头碱对照品的高效液相色谱图色谱图；

图3是唐古特乌头中双酯型生物碱检查次乌头碱对照品的高效液相色谱图色谱图；

图4是唐古特乌头中双酯型生物碱检查新乌头碱对照品的高效液相色谱图色谱图；

图5是唐古特乌头中双酯型生物碱检查供试品的高效液相色谱图色谱图；

图6是乌头碱测定标准曲线图；

图7是次乌头碱测定标准曲线图；

图8是新乌头碱测定标准曲线图；

图9是唐古特乌头中大麦芽碱含量测定大麦芽碱对照品的高效液相色谱图色谱图；

图10是唐古特乌头中大麦芽碱含量测定供试品的高效液相色谱图色谱图；

图11是大麦芽碱测定标准曲线图。

其中，图1、图2、图3、图4、图5、图9、图10的横坐标是时间，单位：Minutes；纵 坐标是电压，单位：Volts；图6、图7、图8、图11的横坐标是浓度C，单位：μg/ml；纵坐 标是峰面积A，单位：μV·s。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释 本发明，并不对其内容进行限定。

实验例1：唐古特乌头薄层色谱鉴别实验

唐古特乌头，青海金诃藏药药业股份有限公司提供。

薄层色谱鉴别：

取待检测药材粉末（过三号筛）1g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250W， 频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取唐古 特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

结果分析：分别考察了氯仿-甲醇，氯仿-甲醇-甲酸，二甲苯-乙酸乙酯-二乙胺、正己烷- 乙酸乙酯-甲醇等不同展开剂及其不同体积份数比的展开剂条件下，唐古特乌头的展开效果。 结果发现，以体积份数比5:4:1.5的正己烷-乙酸乙酯-甲醇为展开剂时，唐古特乌头中的生物 碱成分有较好的展开效果，但是斑点略有拖尾，加入氨水后，拖尾消失，其中，体积份数比 为5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水的展开剂展开效果最好。

实验例2：唐古特乌头中双酯型生物碱检查

1.仪器、试药和供试样品

仪器：高效液相色谱仪：日立L-2100泵，日立L-2400紫外检测器；

电子天平：岛津AUW220D型。

对照品：乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所），批号：110720-200410；次乌头碱 （中国药品生物制品检定所），批号：110798-200805；新乌头碱（中国药品生物制品检定所）， 批号：110799-200505。

样品：唐古特乌头（青海金诃藏药药业股份有限公司提供），批号分别为：110701、110702、 110703。

2.检测波长的选择

取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品混合溶液，于190-400nm波长范围 内进行扫描，结果表明混合对照在235nm处有最大吸收，根据紫外吸收图谱选定235nm为检 测波长。

3.流动相选择

分别考察了甲醇-体积份数比为0.1％三乙胺水溶液，甲醇-0.04mol/l三乙胺（磷酸调节pH 值至6），乙腈-5mmol/l NaH₂PO₄溶液(磷酸调至pH4.5)，[体积份数比25：15的乙腈-四氢呋 喃]-[0.1mol/1醋酸铵水溶液（用冰醋酸调至pH9.74）]等不同体积份数比为流动相时供试品溶 液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的分离效果，研究发现，以体积份数比25:15的乙腈-四氢 呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B，选用 合适的条件进行梯度洗脱时，能够达到较好的分离效果，且峰形较好。洗脱梯度见表1。

表1洗脱梯度表

4.专属性试验

取0.05mol/l硫酸作为空白溶剂。

取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，分别加0.05mol/l 硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、新乌头碱各50μg的溶液，分别作为对照品溶液。

取待检测药材粉末（过三号筛）2g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放 冷，称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精 密量取续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml， 振摇使溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中， 用二氯甲烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨 试液调PH至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l 硫酸溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

在上述色谱条件下，分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入液 相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱与其相邻峰 的分离度均大于1.5，分离效果好，能够用于双酯型生物碱的检测。对照品的峰保留顺序依次 为新乌头碱、次乌头碱、乌头碱。结果见附图1、图2、图3、图4、图5。

5.标准曲线的制备和线性关系的考察

精密称取乌头碱对照品（11.42mg）、次乌头碱对照品（10.04mg）、新乌头碱（11.32mg）， 分别置10ml的容量瓶中，用0.05mol/l的硫酸溶解并稀释至刻度，取上述对照品溶液各5ml 至同一50ml的容量瓶中，用0.05mol/l的硫酸稀释到刻度，摇匀，作为对照品储备液；取对 照品储备液1ml、3ml、5ml、7ml、10ml，分别置10ml容量瓶中，0.05mol/l硫酸稀释至刻 度，摇匀，各精密进样20μl，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。结 果见表2-1、表2-2、表2-3和附图6、图7、图8。

表2-1乌头碱标准曲线结果

回归方程：A=12284C+3132.7

相关系数：R=0.9999

结果表明：在11.42μg/ml~114.20μg/ml范围内，乌头碱的峰面积(A)与浓度(C)线性关系良 好。

表2-2次乌头碱标准曲线结果

回归方程：A=11756C+5608.5

相关系数：R=0.9999

结果表明：在10.04μg/ml~100.40μg/ml范围内，次乌头碱的峰面积(A)与浓度(C)线性关系 良好。

表2-3新乌头碱标准曲线结果

回归方程：A=13338C+274.47

相关系数：R=0.9999

结果表明：在11.32μg/ml~113.20μg/ml范围内，新乌头碱的峰面积(A)与浓度(C)线性关系 良好。

6.精密度试验

在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次， 记录峰面积并计算相对标准偏差。结果表明，仪器精密度良好。结果见表3-1、表3-2、表3-3。

表3-1乌头碱精密度试验结果

表3-2次乌头碱精密度试验结果

表3-3新乌头碱精密度试验结果

7.定量限

分别取乌头碱对照溶液（57.10μg/ml）、次乌头碱对照溶液（50.20μg/ml）、新乌头碱 （56.60μg/ml）各1ml至25ml容量瓶中，分别用0.05mol/l的硫酸溶液稀释并定容至刻度，摇 匀，进样。结果信噪比均约为30。再分别取上述溶液3ml至10ml的容量瓶中，用0.05mol/l 的硫酸溶液稀释并定容至刻度，摇匀，进样。结果信噪比均约为10。结果表明：乌头碱浓度 为0.685μg/ml时，信噪比约为10，即乌头碱定量限为13.70ng；次乌头碱浓度为0.602μg/ml 时，信噪比约为10，即次乌头碱定量限为12.05ng；新乌头碱浓度为0.679μg/ml时，信噪比 约为10，即新乌头碱定量限为13.58ng。

8.重复性试验

取本品（批号：110701），重复测定6次，记录峰面积并分别计算样品中乌头碱、次乌头 碱、新乌头碱的含量及相对标准偏差。结果表明，该分析方法重复性良好。结果见表4-1、表 4-2、表4-3。

表4-1乌头碱重复性试验结果

表4-2次乌头碱重复性试验结果

表4-3新乌头碱重复性试验结果

9.回收率试验

对照品储备液取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品各5mg，精密称定， 分别置10ml量瓶中，加0.05mol/l硫酸溶解并稀释至刻度，各取1ml置同一100ml的量瓶中， 盐酸-甲醇（1:100）稀释并定容至刻度，作为混合对照品储备液。

回收率试验供试品溶液取已知双酯型生物碱含量的待检测药材粉末（过三号筛）1g（批 号：110701），精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入2ml混合对照品储备液，再加入体积 份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液48ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃）， 放冷，称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密量取续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml， 振摇使溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中， 用二氯甲烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨 试液调PH至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l 硫酸溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。共配制6份。

按含量测定方法测定，计算回收率及其相对标准偏差。结果表明：该测定方法测定结果 准确。结果见表5。

表5回收率试验结果

10.样品测定

取唐古特乌头药材3批，按上述含量测定方法对双酯型生物碱的含量进行检查。结果见 表6。

表6唐古特乌头中双酯型生物碱测定结果

实验例3：唐古特乌头中大麦芽碱的含量测定实验

1.仪器、试药和供试样品

仪器：高效液相色谱仪：日立L-2100泵，日立L-2400紫外检测器；

电子天平：岛津AUW220D型。

对照品：大麦芽碱对照品（中国药品生物制品检定所），批号：100762-200901。

样品：唐古特乌头（青海金诃藏药药业股份有限公司提供），批号分别为：110701、110702、 110703。

2.检测波长的选择

取大麦芽碱对照品溶液，于190-400nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定 225nm为检测波长。

3.流动相及色谱柱选择

分别考察了乙腈-体积份数比为0.5％三乙胺水溶液（磷酸调pH3.0），乙腈-0.025mol/l磷 酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2），乙腈-0.1mol/l磷酸二氢钠溶液-0.025mol/l十二烷 基硫酸钠溶液等不同体积份数比为流动相时供试品溶液中大麦芽碱的分离效果，研究发现， 选用乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相时，能够得到较好 的分离效果，乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）体积份数比为10： 90时，大麦芽碱主峰保留时间为7.9min，分离效果最好。

分别研究了Waters C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo C₈（250mm×4.6mm，5μm）、 WelchPhenyl-Ether（250mm×4.6mm，5μm）等不同色谱柱大麦芽碱的的分离效果， 结果发现使用Thermo C₈（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，大麦芽碱的峰形较好。

4.系统适用性试验

在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪， 记录色谱图。结果表明，对照品、供试品色谱中大麦芽碱与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5。 见附图9、图10。

5.对照品制备

精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱20μg的溶液，即得。

6.供试品制备

文献报道大麦芽碱具有热不稳定性，分别考察了超声、振揺两种方法的提取效果；大麦 芽碱极易溶于乙醇、氯仿，而且碱性溶液能够使得生物碱充分游离，分别考察了体积份数比 100:1的乙醇-氨水、体积份数比100:1的甲醇-氨水、体积份数比100:1的氯仿-氨水三种溶剂 的提取效果；还分别考察了20ml、40ml、60ml不同提取溶剂量的提取效果。结果见表7、表 8和表9。

表7提取方法考察试验结果

表8提取溶剂考察试验结果

表9提取溶剂量考察试验结果

结果表明，采用超声提取比较充分，提取溶剂优选体积份数比100:1氯仿-氨水，提取溶 剂量选用50ml保证大麦芽碱提取完全。具体方法如下：

取待检测药材粉末（过三号筛）1g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重量，用体积份数比100:1 氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压低温（50℃以下）蒸干， 残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，取 上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提取5次，每次20ml， 合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

7.标准曲线的制备和线性关系的考察

精密量取大麦芽碱对照品贮备液溶液（41.60μg/ml）1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分别 置10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密进样10μl，以峰面积（A）对对照品浓度 （C）进行线性回归，得大麦芽碱回归方程：A=9280.2C+2913.0，相关系数：R=0.9997。结 果表明：大麦芽碱在4.16μg/ml~41.60μg/ml范围内，大麦芽碱的峰面积（A）与浓度（C）线 性关系良好。结果见表10和附图11。

表10大麦芽碱线性关系考察结果

8.精密度试验

精密吸取大麦芽碱对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并 计算相对标准偏差，相对标准偏差RSD=0.72%。结果表明，仪器精密度良好。结果见表11。

表11精密度试验结果

9.稳定性试验

供试品溶液制备完成后，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以后每隔2小 时测定一次，考察6小时，计算峰面积的相对标准偏差，RSD=0.66%。结果表明：供试品中 大麦芽碱在6小时内测定结果稳定。结果见表12。

表12样品稳定性试验结果

10.重复性试验

取本品（批号：110701），重复测定6次，计算样品中大麦芽碱的含量，相对标准偏差 RSD=1.17%。表明分析方法重复性良好。结果见表13。

表13重复性试验结果

11.回收率试验

精密称取同一批样品6份（批号：110701），精密加入大麦芽碱对照品，测定其含量，计 算回收率，大麦芽碱平均回收率为97.92%，相对标准偏差RSD=1.32%。表明该测定方法测 定结果准确。结果见表14。

表14回收率实验结果

12.样品测定

取唐古特乌头药材3批，按上述含量测定方法对大麦芽碱对含量进行测定。结果见表15。

表15大麦芽碱含量测定结果

实验例4：唐古特乌头中总生物碱的含量测定实验

1.仪器、试药和供试样品

仪器：电子天平：岛津AUW220D型；滴定管（北京玻璃仪器厂，25ml）。

对照品：大麦芽碱对照品（中国药品生物制品检定所），批号：100762-200901。

样品：唐古特乌头（青海金诃藏药药业股份有限公司提供），批号分别为：110701、110702、 110703。

2.空白试验

精密量取乙醇5ml，置250ml锥形瓶中，精密加入15ml硫酸滴定液（0.0116mol/l），15ml 水与甲基红指标液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.0205mol/l）滴定滴至黄色。结果消耗碱液 16.95ml，表明该溶剂系统未对测定结果产生干扰。

3.重现性试验

取110701批号样品6份，按样品中总生物碱含量测定项下方法测定，计算总生物碱含量 及其相对标准偏差。结果表明：该方法重复性良好。结果见表16。

表16总生物碱含量测定重现性试验结果

4.回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品6份（批号：110701），分别精密加入大麦芽碱对照品， 按样品中总生物碱含量测定项下方法测定，计算回收率及其相对标准偏差。结果表明：该测 定方法测定结果准确。结果见表17。

表17回收率实验结果

5.样品中总生物碱含量测定

取待检测药材粉末（过三号筛）5g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15ml；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。结果见 表18。

表18总生物碱含量测定结果

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

通过查阅国内外文献资料发现，唐古特乌头化学成分研究很少，其中化合物结构十分相 似，在薄层鉴别时，很难将其专属化合物与其它杂质分开，干扰成分多，因此对其薄层鉴别 带来了很大困难，对此我们通过大量实验摸索，最终采用唐古特乌头对照药材为对照，筛选 出展开效果好、重复性佳的展开剂，其相对于原有鉴别方法，更简便、可靠和专属性强。对 于检查项目和含量测定而言，文献报道及质量标准中唐古特乌头均无毒性介绍及含量测定方 法，为了保证唐古特乌头正确使用及其制剂的安全有效，所以有必要对乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱等为代表的双酯型生物碱毒性成分进行限量检查，同时建立唐古特乌头中主要生物 碱成分大麦芽碱以及总生物碱的含量测定方法。因此我们通过实验摸索，双酯型生物碱检查 首先对供试品进行前处理，去除大部分干扰成分，然后选用不同的流动相、不同流动相体积 份数比等色谱条件进行优化，筛选出分离效果好的色谱条件，并且对所建立的检查方法进行 了方法学考察；大麦芽碱含量测定分别对不同色谱柱填料、不同流动相及其体积份数比等色 谱条件，不同提取方法、不同提取溶剂、不同提取溶剂量等供试品处理方法进行优化，优选 最佳条件，并且对所建立的含量测定方法进行方法学考察；总生物碱含量测定采用反滴定法， 并且考察了空白、重现性、加样回收率等方法学考察。结果表明，所建立的检查和含量测定 方法，精密度高，重复性好，回收率高，结果准确可靠，具有较强的专属性。

实施例1：唐古特乌头中生物碱的质量检测方法

薄层色谱鉴别：

取待检测药材粉末（过三号筛）1g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250W， 频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取唐古 特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

双酯型生物碱检查：

取待检测药材粉末（过三号筛）2g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放冷， 称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取 续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，振摇使 溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中，用二氯甲 烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨试液调PH 至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l硫酸溶解， 转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、次乌头碱对 照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比25:15的乙 腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含双酯性生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO₁₁）、次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₀） 和新乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₁）的总量计，不得过0.1mg/g。

大麦芽碱含量测定：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测药材粉末（过三号筛）1g，精密称定，置锥形瓶中，加入 体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重 量，用体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压 低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000 转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提 取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品按干燥品计算，含大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）不得少于0.2mg/g。

总生物碱含量测定：

取待检测药材粉末（过三号筛）5g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

本品按干燥品计算，含生物碱以大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）计，不得少于3.6mg/g。

鉴别检测中，所述唐古特乌头对照药材来源依照以下标准选用：

唐古特乌头为毛茛科植物唐古特乌头Aconitum tanguicum（Mazxim.）Stapf和船盔乌头 Aco-nitum naviculare(Bruhl.)Stapf的干燥全草。主产于青海、甘肃、西藏、四川等地，唐古特 乌头对照药材应符合藏药部颁标准85页项下标准（由青海省药品检验所起草）。标准如下：

唐古特乌 头藏药名：榜嘎

拼音名：Tanggute Wutou

英文名：HERBA ACONITI TANGUTICI

书页号：C1-85

标准编号：WS3-BC-0085-95

本品为毛茛科植物唐古特乌头Aconitum tanguticum(Maxim.)Stapf和船盔乌头Aco-nitum  naviculare(Bruhl.)Stapf的干燥全草。夏末秋初开花期连根采挖，除去杂质，阴干。

【性状】本品块根细小，纺缍形或圆锥形，母根头部有子根着生痕迹2～7个；子根 顶端有一个偏斜的疤痕，大小不一，长2～3cm，直径3～4mm，表皮黄褐色至黑褐色，断 面类白色。茎圆柱状，皱缩，长短不等，直径2～3mm，表皮灰绿色至暗绿色，质脆，易折 断，断面中空。叶片皱缩卷曲，完整叶片肾圆形、椭圆形，掌状深裂，裂片2～3浅裂。总 状花序梗和小花梗被短柔毛；花萼5,紫色或蓝紫色，上萼片盔形；花瓣2,极小；雄蕊多数； 花丝极短，压扁，具毛，花药黑色；子房无毛。气微，味苦。

【鉴别】本品粉末棕褐色。导管少见，梯纹和螺纹，以绨纹导管为主，直径18～32μm。 纤维常碎断，直径18～28μm，端壁尖，厚壁稍弯曲，有少数倾斜单纹孔。

【炮制】除去杂质。

【性味】苦，凉。

【功能与主治】清热解毒，生肌收口，燥湿。用于传染病引起的发热,肝胆热病,血症， 胃热，疡疮，蛇蝎咬伤以及黄水病。

【用法与用量】0.6～1.2g。

【贮藏】置通风干燥处。

本专利使用的唐古特乌头对照药材来源经青海省藏医院名誉院长、青海省藏医首席专家 尼玛依照以上标准鉴定。

实施例2：八味獐牙菜丸中生物碱的质量检测方法

八味獐牙菜丸来自藏药部颁标准，标准编号：WS3-BC-0241-95。由獐牙菜300g、兔耳草 200g、波棱瓜子80g、角茴香200g、榜嘎200g、小檗皮160g、岩参240g、木香200g组成。

薄层色谱鉴别：

取待检测制剂粉末（过三号筛）5g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250W， 频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取唐古 特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

双酯型生物碱检查：

取待检测制剂粉末（过三号筛）8g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放冷， 称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取 续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，振摇使 溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中，用二氯甲 烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨试液调PH 至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l硫酸溶解， 转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、次乌头碱对 照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比25:15的乙 腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含双酯性生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO₁₁）、次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₀）和新乌头碱 （C₃₃H₄₅NO₁₁）的总量计，不得过0.012mg/g。

大麦芽碱含量测定：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测制剂粉末（过三号筛）4g，精密称定，置锥形瓶中，加入 体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重 量，用体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压 低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000 转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提 取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品含大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）不得少于0.025mg/g。

总生物碱含量测定：

取待检测制剂粉末（过三号筛）20g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色；每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

本品含生物碱以大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）计，不得少于0.45mg/g。

实施例3：十一味金色丸中生物碱的质量检测方法

十一味金色丸来自藏药部颁标准，标准编号：WS3-BC-0168-95。由诃子(去核)75g、黑冰 片50g、石榴子40g、渣驯膏25g、波棱瓜子20g、榜嘎26g、角茴香40g、酸藤果35g、蔷薇 花100g、铁棒锤20g、麝香2.5g组成。

薄层色谱鉴别：

取待检测制剂粉末（过三号筛）8g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250W， 频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取唐古 特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

双酯型生物碱检查：

取待检测制剂粉末（过三号筛）15g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放冷， 称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取 续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，振摇使 溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中，用二氯甲 烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨试液调PH 至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l硫酸溶解， 转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、次乌头碱对 照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比25:15的乙 腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含双酯性生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO₁₁）、次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₀）和新乌头碱 （C₃₃H₄₅NO₁₁）的总量计，不得过0.005mg/g。

大麦芽碱含量测定：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测制剂粉末（过三号筛）6g，精密称定，置锥形瓶中，加入 体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重 量，用体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压 低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000 转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提 取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品含大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）不得少于0.011mg/g。

总生物碱含量测定：

取待检测制剂粉末（过三号筛）30g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色；每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

本品含生物碱以大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）计，不得少于0.21mg/g。

实施例4：十三味榜嘎散中生物碱的质量检测方法

十三味榜嘎散系藏族验方，由榜嘎60g、波棱瓜子30g、秦艽花40g、獐牙菜40g、巴夏嘎 40g、苦荬菜40g、洪连40g、小檗皮40g、节裂角茴香40g、金腰草30g、牛黄3g、红花20g、止 泻木子30g组成。

薄层色谱鉴别：

取待检测制剂粉末（过三号筛）5g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250W， 频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取唐古 特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

双酯型生物碱检查：

取待检测制剂粉末（过三号筛）8g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放冷， 称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取 续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，振摇使 溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中，用二氯甲 烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨试液调PH 至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l硫酸溶解， 转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、次乌头碱对 照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比25:15的乙 腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含双酯性生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO₁₁）、次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₀）和新乌头碱 （C₃₃H₄₅NO₁₁）的总量计，不得过0.013mg/g。

大麦芽碱含量测定：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测制剂粉末（过三号筛）4g，精密称定，置锥形瓶中，加入 体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重 量，用体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压 低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000 转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提 取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品含大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）不得少于0.026mg/g。

总生物碱含量测定：

取待检测制剂粉末（过三号筛）20g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色；每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

本品含生物碱以大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）计，不得少于0.47mg/g。

实施例5：安儿宁颗粒中生物碱的质量检测方法

安儿宁颗粒系藏族验方，由天竺黄66.7g、红花53.3g、人工牛黄5.3g、岩白菜53.3g、甘草 53.3g、高山辣白菜53.3g、短管兔儿草66.7g、白檀香66.7g、唐古特乌头66.7g组成。

薄层色谱鉴别：

取待检测制剂粉末（过三号筛）8g，加氨水5ml，加二氯甲烷50ml，超声处理（功率250W， 频率40kHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取唐古 特乌头对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积份数比5:4:1.5:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化 铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点。

双酯型生物碱检查：

取待检测制剂粉末（过三号筛）15g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入体积份数 比1:100盐酸-甲醇的混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟（温度不超过25℃），放冷， 称定重量，用体积份数比1:100盐酸-甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取 续滤液25ml，在40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，振摇使 溶解，离心（转速为8000转/分钟）20分钟，精密量取上清液20ml，置分液漏斗中，用二氯甲 烷洗涤4次（20ml、20ml、15ml、15ml），弃去二氯甲烷液，待上层澄清后，用氨试液调PH 至8-9，再用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣用0.05mol/l硫酸溶解， 转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品、次乌头碱对 照品、新乌头碱对照品适量，精密称定，加0.05mol/l硫酸制成每1ml含乌头碱、次乌头碱、 新乌头碱各50μg的混合溶液，作对照品溶液。照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录VI D）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比25:15的乙 腈-四氢呋喃为流动相A，以0.1mol/l醋酸铵水溶液（每1000ml加冰醋酸0.5ml）为流动相B， 按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含双酯性生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO₁₁）、次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₀）和新乌头碱 （C₃₃H₄₅NO₁₁）的总量计，不得过0.005mg/g。

大麦芽碱含量测定：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比10:90的 乙腈-0.025mol/l磷酸二氢钾水溶液（三乙胺调节PH至7.2）为流动相；检测波长225nm；理 论板数按大麦芽碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备精密称取大麦芽碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中含大麦芽碱 20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取待检测制剂粉末（过三号筛）6g，精密称定，置锥形瓶中，加入 体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30分钟，放置过夜，称定重 量，用体积份数比100:1氯仿-氨水的混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，减压 低温（50℃以下）蒸干，残渣精密加入0.05mol/l硫酸溶液25ml，使溶解，离心（转速为8000 转/分钟）20分钟，取上清液，置分液漏斗中，用氨试液调PH至8-9，再用乙酸乙酯振摇提 取5次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，摇匀，滤过， 取续滤液，即得。

测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品含大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）不得少于0.009mg/g。

总生物碱含量测定：

取待检测制剂粉末（过三号筛）30g，精密称定，置锥形瓶中，加入体积份数比100:1氯 仿-氨水的混合溶液50ml，称定重量，超声30min，放置过夜，滤过，残渣加入体积份数比 100:1氯仿-氨水的混合溶液50ml，振摇1小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1氯仿-氨水 的混合溶液洗涤3次，每次15m；合并洗液及滤液，低温减压（50℃以下）蒸干，残渣加入 乙醇10ml使溶解，加入活性炭1g，振摇，使脱色，再精密量取续滤液5ml，精密加入硫酸滴 定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴 定至黄色；每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于1.65mg的大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）。

本品含生物碱以大麦芽碱（C₁₀H₁₅NO）计，不得少于0.16mg/g。