在自组装单层上固定A蛋白的方法

摘要

本发明的目的是提供一种提高在自组装单层上固定的A蛋白的量的方法。通过如下化学式(II)所示结构，将A蛋白固定到自组装单层可以达到此目的。[化学式2]

说明书

技术领域

本发明涉及在自组装单层上固定A蛋白的方法。

背景技术

生物传感器用于检测或定量样品中的靶物质，即抗原。抗原与抗体、A 蛋白与抗体之间的高亲和力可用于生物传感器之中。具体来说，将A蛋白 固定在生物传感器上。进一步将抗体固定在A蛋白上。当向生物传感器提 供抗原时，抗原就会由于抗原与抗体之间的高亲和力被固定在生物传感器 上。

专利文件1公开了现有的利用A蛋白与生物素之间高亲和力的生物传 感器。图2显示公开于专利文件1图7的生物传感器。

根据专利文件1图7的描述，该传感器用于筛选活体分子的活性。该 传感器包含单层7、亲和标签8、接头分子9和蛋白质10。单层7包含化学 式：X-R-Y所示的自组装单层(见专利文件1的第24页的23至26行、第 25页的3至20行，第25页的27行至第26页的13行、第26页的14至 22行)。X、R和Y的实例分别为HS-、烷烃和羧基(见专利文件1的第25 页的3至20行，第25页的27行至第26页的13行、第28页的21至23 行)。

引用列表

专利文献

PTL1：WO00/04382，对应于日本公开特许公报No.2002-520618(见第 [0080]、[0082]、[0084]、[0085]、[0095]和[0109]、[0119]段)

发明概述

技术问题

为了提高对靶物质的检测灵敏度或定量准确性，需要增加固定于生物 传感器的A蛋白的量。

本发明的发明人已发现，使自组装单层与一分子氨基酸结合之后再固 定A蛋白，可以使得每单位面积固定的A蛋白的量显著增加。以此发现为 基础提供本发明。

本发明的目的是提供一种增加固定在自组装单层上的A蛋白的方法， 以及提供具有使用此方法固定的A蛋白的传感器。

问题解决方案

以下的A1至C6项用于解决以上问题。

A1：在自组装单层上固定A蛋白的方法，包含以下步骤(a)和步骤(b)， 其顺序为：

步骤(a)，制备包含一分子氨基酸和自组装单层的基材，其中所述一分 子氨基酸通过如下化学式(I)所示肽键与所述自组装单层结合：

[化学式1]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)

所述一分子氨基酸选自以下十九种氨基酸：半胱氨酸、赖氨酸、组氨 酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色氨酸、 亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸和缬氨酸；

步骤(b)，向所述基材提供A蛋白，通过所述一分子氨基酸的羧基与A 蛋白的氨基之间的反应形成如下化学式(II)所示的肽键

[化学式2]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

A2：根据A1的方法，其中步骤(a)包含以下步骤(a1)和步骤(a2)，其顺 序为：

步骤(a1)，制备在其表面包含自组装单层的基材，所述自组装单层在一 端具有羧基；和

步骤(a2)，提供所述一分子氨基酸，通过所述自组装单层一端的羧基与 所述一分子氨基酸的氨基之间的反应形成化学式(I)所示的肽键。

A3：根据A1的方法，还包含在步骤(a)和(b)之间的如下步骤(ab)：

步骤(ab)，使用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二 亚胺盐酸盐的混合物活化所述一分子氨基酸的羧基。

A4：根据A2的方法，还包含在步骤(a1)和(a2)之间的以下步骤(a1a)：

步骤(a1a)，使用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳 二亚胺盐酸盐的混合物活化所述自组装单层的羧基。

A5：根据A1的方法，其中化学式(II)以如下化学式(III)表示

[化学式3]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

A6：根据A1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色 氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸 和天冬氨酸。

A7：根据A1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色 氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。

A8：根据A1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸和色 氨酸。

A9：根据A1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。

B1：包含自组装单层、一分子氨基酸和A蛋白的传感器，其中

所述一分子氨基酸位于所述自组装单层和A蛋白之间，

所述A蛋白通过如下化学式(II)所示的两个肽键与所述自组装单层结 合，

[化学式2]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)

所述一分子氨基酸选自以下十九种氨基酸：半胱氨酸、赖氨酸、组氨 酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色氨酸、 亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸和缬氨酸。

B2：根据B1的方法，其中化学式(II)以如下化学式(III)表示

[化学式3]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

B3：根据B1的传感器，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色 氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸 和天冬氨酸。

B4：根据B1的传感器，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色 氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。

B5：根据B1的传感器，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸和色氨酸。

B6：根据B1的传感器，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。

C1：使用传感器检测或定量样品中含有的靶物质的方法，包含以下步 骤(a)至(c)，其顺序为：

步骤(a)，制备包含自组装单层、一分子氨基酸、A蛋白和抗体的传感 器，其中

所述一分子氨基酸位于所述自组装单层和A蛋白之间，

所述A蛋白位于所述抗体和所述一分子氨基酸之间，

所述抗体特异性结合靶物质，

所述A蛋白通过如下化学式(II)所示的两个肽键与所述自组装单层结 合，

[化学式2]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)

所述一分子氨基酸选自以下十九种氨基酸：半胱氨酸、赖氨酸、组氨 酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色氨酸、 亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸和缬氨酸；和

步骤(b)，向传感器提供样品，使靶物质与A蛋白结合；

步骤(c)，从所捕获的靶物质或其量检测或定量所述样品中含有的靶物 质。

C2：根据C1的方法，其中化学式(II)以如下化学式(III)表示

[化学式3]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

C3：根据C1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色 氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸 和天冬氨酸。

C4：根据C1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色 氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。

C5：根据C1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸和色 氨酸。

C6：根据C1的方法，其中所述一分子氨基酸选自半胱氨酸、赖氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。

发明的有益效果

本发明可以极大地提高每单位面积固定的A蛋白的量。

附图简述

图1显示本发明的方法的示意图。

图2是专利文件1的图7。

图3显示根据现有技术的方法的示意图。

发明详述

本发明实施方案参考图1描述如下。

(实施方案1)

图1显示根据本发明的在自组装单层上固定A蛋白的方法。

基材1优选使用金基材。金基材的实例为表面包含金的基材。具体来 说，金基材可以通过在玻璃、塑料或二氧化硅(SiO2)表面喷镀金形成。

首先，将基材1浸入含有烷基硫醇(alkanethiol)的溶剂当中。在浸泡之 前，优选清洗所述基材。所述烷基硫醇在其末端带有羧基。对于烷基硫醇， 优选地可采用碳原子数在6至18之间的一级(primary)烷基硫醇。这样，在 基材1上形成自组装单层2。

烷基硫醇的优选浓度大约为1至10mM。溶剂不受限制，只要溶解所 述烷基硫醇即可。优选的溶剂例如乙醇、DMSO(二甲基亚砜)和二恶烷。优 选浸泡时间大约为12至48小时。

然后，向自组装单层2提供氨基酸3。位于自组装单层2上端的羧基 (-COOH)与氨基酸3的氨基(-NH2)反应，形成如下化学式(I)所示的肽键

[化学式1]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

在化学式(I)中，一分子氨基酸3与自组装单层2结合。

氨基酸3选自以下十九种氨基酸：半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、 谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和缬 氨酸。也就是说，在化学式(I)中，R是这十九种氨基酸的侧链。

在向自组装单层2提供氨基酸3时，可以同时提供两种或超过两种的 氨基酸。也就是说，在向自组装单层2提供含有氨基酸3的溶液时，所述 溶液中可以含有两种或超过两种的氨基酸3。为了使A蛋白与氨基酸3结 合均匀(后文介绍)，优选所述溶液含有单一一种氨基酸。

如后面的实施例所述，不使用精氨酸作为氨基酸3。这是因为在提供精 氨酸的情况下，蛋白质固定量低于不提供氨基酸的固定量。在不提供氨基 酸的情况下，位于自组装单层2末端的羧基直接与A蛋白结合。

随后，提供A蛋白4。A蛋白4的5'-末端氨基与氨基酸3的羧基反应。 A蛋白所含有的赖氨酸的氨基也与氨基酸3的羧基反应。所以，形成了如 下化学式(II)所示的两个肽键来获得传感器

[化学式2]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

一个A蛋白4分子只有一个5'-末端，但是一个A蛋白4分子含有大 量的赖氨酸基团。因此，几乎所有的化学式(II)都特别地与如下的化学式(III) 相关

[化学式3]

(其中R代表所述一分子氨基酸的侧链)。

所获得的传感器用于检测或定量样品中含有的靶物质。

具体来说，向传感器中提供可以特异性结合靶物质的抗体，使所述抗 体与A蛋白结合。也就是说，A蛋白捕获所述抗体。接下来，向传感器提 供样品，使样品中的靶物质，即抗原，与抗体结合。不用说，抗体会与靶 物质特异性结合。

最后，利用常规的分析方法，如表面等离子体共振分析法(SPR)，检测 或定量靶物质。也可以使用其它分析方法，如石英晶体微天平(QCM)。

实施例

通过以下的实施例和比较例，对本发明进行详细描述。

比较例1

如图3所示，A蛋白通过酰胺偶联反应与在金基材上形成的自组装烷 基硫醇上端的羧基直接结合，从而固定所述A蛋白。步骤与结果描述如下。

(样品溶液的制备)

制备终浓度为10mM的16-巯基十六烷基酸样品溶液。其溶剂为乙醇。

(自组装单层的形成)

使用金基材(其中金被蒸镀在玻璃上，可从GE healthcare公司获得， BR-1004-05)作为基材1。基材1使用含有浓硫酸和30％过氧化氢水溶液的 食人鱼溶液(piranha solution)洗涤10分钟。组成食人鱼溶液的浓硫酸与30 ％过氧化氢水溶液的体积比是3:1。

随后，将金基材在样品溶液中浸泡18小时以在金基材表面形成自组装 单层。最后，用纯水清洗基材1并干燥。

(A蛋白的固定)

使A蛋白与位于形成自组装单层的16-巯基十六烷基酸的上端的羧基 结合，从而固定A蛋白。

具体来说，使用35微升的0.1MNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和0.4M EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)的混合物活化位于16- 巯基十六烷基酸上端的羧基。接下来，以5微升/分钟的流速，加入35微升 的A蛋白(40微克/毫升)。这样，16-巯基十六烷基酸的羧基与A蛋白的氨 基偶联。

实施例1

与比较例类似地进行实验，只是在自组装单层的形成和A蛋白的固定 中间提供甘氨酸作为所述一分子氨基酸。步骤与结果描述如下。

(氨基酸(甘氨酸)的固定)

使甘氨酸与位于形成自组装单层2的16-巯基十六烷基酸上端的羧基结 合，从而固定甘氨酸。具体来说，在与比较例1类似地活化羧基之后，以5 微升/分钟的流速加入35微升0.1M的甘氨酸(pH值8.9)。这样，16-巯基十 六烷基酸的羧基与甘氨酸的氨基偶联。

(A蛋白的固定)

随后，使A蛋白与甘氨酸的羧基结合来固定A蛋白。具体来说，在与 上面类似地活化甘氨酸羧基之后，以5微升/分钟的流速加入35微升的A 蛋白(浓度：250微克/毫升)。这样，所述羧基与A蛋白的5'-末端氨基酸或 者A蛋白中的赖氨酸的氨基偶联。

(固定量的比较)

使用表面等离子体共振设备Biacore3000(可从GE healthcare公司获得) 测定实施例1和比较例1的固定量。

“固定量”一词，是指每单位面积固定的A蛋白的量。

实施例1中测定的固定量与比较例1中测定的固定量的比值约为8:1。

实施例2-19

分别使用苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮 氨酸、谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、精氨酸和酪氨酸替代甘氨酸。与实施 例1类似地测定各自的固定量。这些氨基酸是除精氨酸外的20种天然氨基 酸。

表1显示所测量的固定量。

比较例2

与实施例1类似地进行试验，只是使用精氨酸代替甘氨酸用作所述一 分子氨基酸，测定固定量。

表1

  氨基酸   固定量   实施例11   半胱氨酸   185   实施例14   赖氨酸   147   实施例12   组氨酸   117   实施例9   苯丙氨酸   112   实施例1   甘氨酸   100   实施例8   天冬酰胺   95   实施例3   甲硫氨酸   94   实施例6   丝氨酸   92   实施例19   酪氨酸   87   实施例10   色氨酸   86   实施例15   亮氨酸   80   实施例7   谷氨酰胺   76   实施例13   丙氨酸   75   实施例4   异亮氨酸   57   实施例2   苏氨酸   54   实施例5   脯氨酸   42   实施例16   谷氨酸   33   实施例18   天冬氨酸   25   实施例17   缬氨酸   21.7   比较例2   精氨酸   6.4   比较例1   (无)   12.7

技术人员可以明白以下来自表1的内容。

当使用除精氨酸之外的十九种氨基酸时，固定量都相对比较例有所提 高。另外，固定量的变化取决于氨基酸。

优选半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬 酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨 酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，因为在使用这些氨基酸其中一 种的情况下，测定的固定量都等于或者大于二十。

更优选半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天 冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮 氨酸和苏氨酸，因为在使用这些氨基酸其中一种的情况下，测定的固定量 都等于或者大于五十。

更加优选半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、 天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸和色氨酸，因为在使用这些氨基酸其中一种 的情况下，测定的固定量都大于平均值(83.3％)。

最优选半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，因为在使用 这些氨基酸其中一种的情况下，测定的固定量都等于或者大于一百。

工业实用性

本发明实现了每单位面积固定的A蛋白的量的极大提高。这使得传感 器的灵敏度或准确度得以提高。所述传感器在临床实践中用于需要对患者 活体样品中抗原或抗体进行检测或定量的检查或诊断。

附图标记列表

1：金基材

2：烷基硫醇

3：氨基酸

4：A蛋白