受激发射损耗(STED)显微镜检查系统

摘要

本发明公开了一种用于对对象（O）进行受激发射损耗（STED）的光学显微镜检查系统（10）。应用光学元件（6）将第一激励射束（1）和第二损耗（2）射束聚焦到对象上，由此界定针对第一射束和第二射束两者的公共光学路径（OP）。在公共光学路径（OP）中插入相位修改构件（5），所述相位修改构件以光学方式被布置成用于使所述第一射束的波前基本不变，并改变所述第二射束（2'）的波前，以便在所述对象中生成未损耗的感兴趣区域（ROI）。第一射束和第二射束具有公共光学路径，因为相位修改构件调整波前或相位，使其对第一射束没有影响，而给第二射束带来波前或相位变化，从而在焦平面处在对象中获得损耗区域（例如，成为环形斑）。本发明便于STED显微镜检查的更小和/或改进型光学设计；这对于医学活体内成像（例如内窥镜和导管）尤其相关。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于受激发射损耗（STED）的光学显微镜检查 （microscopy）系统，以及利用这种系统执行显微镜检查的对应方法。本发 明还涉及用于医学成像的对应光学子单元，其优选形成内窥镜、导管或针 或类似装置的一部分。

背景技术

在受激发射损耗（STED）显微镜检查中，能够实现远低于常规显微镜 检查的衍射极限的图像分辨率（例如，参见图2：B.Harke，J.Keller，C.K. Ullal，V.Westphal，A.和S.W.Hell，“Resolution scaling In STED  microscopy”，Optics Express 16（2008）第4154-4162页）。在STED显微镜 检查中，由脉冲激光系统激励荧光标记。在这种激励之后不久，即在荧光 的衰减时间之内，施加第二激光脉冲，其波长接近荧光的发射波长的波长。 这一第二激光脉冲具有环（donut）形斑（或与第一脉冲形状不同的其他类 似形状）。由于受激发射的原因，这一第二脉冲将使环形斑区域之内的荧光 分子去激励。然而，环的中心之内的分子将不会被去激励。这一中心区域 通常小于常规显微镜的有限衍射的斑大小。因此从小于衍射极限的区域发 出两个激光脉冲之后探测来自剩余受激分子的荧光，因此产生了亚有限衍 射分辨率的成像。这近来在本技术领域中受到了一些关注。

为了产生两个脉冲激光束，通常使用上文Harke等人的参考文献的图1 中所示的光学装置。这在所有三个空间维度中都给射束对准带来严重约束， 并且通常由于光学装置中的机械、热和/或光束漂移需要周期性地进行重新 对准。此外，损耗射束需要不同的光学部件以便产生环形斑。类似地，两 个激光束给光学STED显微镜检查的可能下缩（downscaling）带来约束， 这对于活体内医学和生物学成像而言是极为重要的。

至于光纤扫描器，例如参考本申请人的国际专利申请WO2009087527， 可以提到的是，对于这样的应用，通常优选具有针对激励射束和STED射 束的公共光束路径。

本发明的发明人意识到，改进的STED显微镜检查系统是有益的，因 此设计了本发明。

发明内容

实现一种改进型显微镜检查系统将是有利的。还希望能够实现一种更 为紧凑和/或鲁棒的显微镜检查系统。总体而言，本发明优选试图单独地或 以任何组合来缓和、减轻或消除上述缺点中的一个或多个。具体而言，可 以将提供一种解决现有技术的上述问题或其他问题的方法作为本发明的目 的。

为了更好地解决这些关注中的一个或多个，本发明的第一方面涉及一 种用于相关联的对象的受激发射损耗（STED）的光学显微镜检查系统，该 系统包括：

辐射发生器件，其能够发射第一射束和第二射束，第一射束为激励射 束，而第二射束为相对于第一射束的损耗射束，

光学元件，其用于将第一射束和第二射束聚焦到对象上，所述光学元 件相对于辐射发生器件被布置成用于界定针对第一射束和第二射束两者的 公共光学路径，以及

相位修改构件，其插入所述公共光学路径中，

其中，所述相位修改构件以光学方式被布置成用于使所述第一射束的 波前基本不变，并改变所述第二射束的波前，以便在所述对象中生成未损 耗的感兴趣区域。

本发明对于获得更为紧凑和/或鲁棒的STED显微镜检查系统尤其有 利，但并非唯一有利，其中，第一激励射束和第二损耗射束具有由聚焦射 束的光学元件界定的公共光学路径，这是由于相位修改构件调整波前或相 位，使其对第一射束没有影响，而给第二射束带来波前或相位变化，从而 在焦平面处在相关联的对象中获得损耗区域（例如，成为环形斑）。

应当指出的是，在本技术领域中，迄今为止为了提供例如“环”形射 束，在STED装置的两个脉冲激光束之一中使用了相位板。这种构造的缺 点是相位板必须要在射束之一中，不能放在两个射束中。于是，当向微型 显微镜（诸如纤维扫描器）中实施STED技术时，这种限制以前限制了微 型显微镜的可能下缩。至于光纤扫描器，例如参考本申请人的国际专利申 请WO2009087527（在此通过引用将其全文并入），可以提到的是，对于这 样的应用，可以将相位修改构件定位在WO2009087527中图4的光纤2和 物镜6a之间。

应当理解，在本发明的语境中，相位修改构件对第一激励射束没有影 响，或者基本没有影响，即从实践角度讲，通常会诱发小的波前或相位变 化，但这种变化对获得的受激发射损耗图像没有影响，或至少没有显著影 响。下文将更详细地解释这种情况。

在特别有利的实施例中，相位修改构件可以能够通过使表面具有多个 区域来修改第二射束的波前，所述多个区域包括第一区域和第二区域，第 一区域具有高于第二区域的高度的突出高度。通过在第一区域和第二区域 的高度之间具有突出或梯级（step），能够以相对简单的方式生产相位修改 构件，例如，在单种材料中，应用高精度制造方法以生产精确度通常为亚 微米的梯级高度。显然，可以将这种处理推广到超过两个区域，即三个、 四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等区域，每个区域都具有突 出，以匹配相位修改构件的总体技术目的。利用从高精度透镜制造了解的 技术可能实现这种目的；例如，参考如下文献：B.H.W.Hendriks等人， Japanese Journal of Applied Physics，44卷，No.9A，2005，第6564-6567页， Miniaturised High-Numerical Aperture Singlet Plastic Objective for Optical  Recording，以及M.A,H，van der Aa等人在Proceedings from Joint  International Symposium on Optical Memory and Optical Data Storage 2002， IEEE，第251-253页的文章“Small Form Factor Optical Drive：Miniaturized  Plastic High-NA Objective and Optical Drive”，在此通过引用将两者都全文并 入。与利用两种或更多种光学材料实现本发明的技术效果相比，这尤其是 有益的，后者通常需要光学、热和机械参数的较为复杂的匹配/接口连接。

在另一有利实施例中，相位修改构件可以能够通过将第一射束的相位 改变2pi（π）的模数而使第一射束的波前基本不变。通过这种方式，不需 要匹配两种或更多种不同材料的例如光学性质。

值得一提的另一优点是，对于相位修改构件，所需的梯级高度一般较 小（大约数微米），从制造的角度讲，使得构件较为容易制造。此外，梯级 的宽度能够相对于梯级高度较大。成梯级的相位结构的这些性质使得它们 较容易利用当前的透镜制造技术制造，参见上文引用的参考文献。

在上述优选实施例中，其中，相位修改构件可以能够通过使表面具有 多个区域来修改第二射束的波前，所述多个区域包括第一区域和第二区域， 第一区域具有高于第二区域的高度的突出高度，所述表面可以是能够实现 简单制造的相位修改构件的外表面。此外或备选地，相位修改构件可以能 够通过将第一射束的相位改变2pi（π）的模数而使第一射束的波前基本不 变。为了提高制造的简单性和/或容易程度，可以在一种光学材料中制造相 位修改构件的表面的多个区域，优选可以在一种光学材料中制造整个相位 修改构件。

在有利实施例中，至少所述光学元件和相位修改构件被定位在内窥镜、 导管或针中以用于医学成像，例如用于活体内光学成像，其中，对小型化 的要求尤其高。

在一个实施例中，相位修改构件可以具有方位角配置，其中，来自所 述多个区域的每个区域都定位在方位角间隔之内。优选地，公共光学路径 通过相位构件的中央或基本中央的位置。此外，所述多个区域可以在相位 修改构件的表面处具有连续增大的高度，例如沿着方位角坐标分立的梯级， 3、4、5或更多，参见图3和下文的对应解释。在其他变型中，所述多个区 域可以在相位修改构件的表面处没有相继升高的高度，而是沿着方位角坐 标增大和减小的高度。

在特定实施例中，相位修改构件的表面处的高度具可以有高度分布， 使得所述第二射束的根据所述方位角的函数修改的相位近似等于方位 角：

其中，

严格来说，仅能够针对连续高度分布实现这一目的，但对于各种高度 分布，可以合理地近似这种情况。或者，可以在各段的平均角处近似该条 件。

在另一具体实施例中，通过要求所述相位修改构件大致满足如下方程， 所述聚焦光学元件焦平面处的第二射束斑幅度U在所述光学路径的中心位 置（r=0）处可以大致为零：

$\underset{k}{\Sigma }{w}_k{e}^{i{\Phi }_k}=0,$

其中，k表示段号，Φ_k表示段相位，w_k表示等于段k的结束角减去开始角 的段尺寸。作为所谓“环”配置的备选，这一方程涵盖一定范围的满足实 质STED要求的修改构件其他光学配置。

在备选实施例中，通过要求所述相位修改构件大致满足如下方程，所 述聚焦光学元件焦平面处的第二射束斑幅度U可以是关于所述公共光学路 径大致旋转对称的：

并且

其中，k表示段号，Φ_k表示段相位，w_k表示等于段k的结束角减去开始角 的段尺寸。于是，这两个方程为技术人员定义了设计规则，能够实现根据 本发明的相位修改构件的很多不同光学实施例。

在相当不同的实施例中，相位修改构件的第一区域和第二区域可以是 关于公共光学路径是旋转对称的。这能够实现本发明的其他简单和有利实 施例，参见图10和下文对应的描述。

在第二方面中，本发明涉及一种光学子单元，其被布置成利用相关联 的光学显微镜检查系统中的受激发射损耗（STED）对相关联的对象进行光 学成像，相关联的光学显微镜检查系统包括辐射发生器件，其能够发射第 一射束和第二射束，第一射束为激励射束，而第二射束为相对于第一射束 的损耗射束，该光学子单元包括：

光学引导器件，其用于引导第一射束和第二射束通过子单元，

光学元件，其用于将第一射束和第二射束聚焦到对象上，所述光学元 件相对于辐射发生器件被布置成用于界定针对第一射束和第二射束的公共 光学路径，以及

相位修改构件，其插入所述公共光学路径中，

其中所述相位修改构件以光学方式被布置成用于使所述第一射束的波 前基本不变，并改变所述第二射束的波前，以便在所述对象中生成未损耗 的感兴趣区域。

优选地，光学子单元可以被布置成利用根据第一方面的相关联的光学 显微镜检查系统中的受激发射损耗（STED）对相关联的对象进行光学成像， 其中，光学子单元形成内窥镜、导管、针或活检针的一部分以用于医学成 像。在本发明的教导和一般原理之内还想到了其他种类的成像装置，包括 非医学装置。在医学领域中，这是尤其有利的，因为在医学领域中，由于 卫生法规的原因，这种装置通常在单次使用之后被丢弃，根据本发明的这 些医学装置制造较简单，便于有利医学装置的更广泛使用和应用。

在第三方面中，本发明涉及一种利用对象的受激发射损耗（STED）执 行光学显微镜检查的方法，该方法包括：

发射包括第一射束和第二射束的辐射，第一射束为激励射束，第二射 束为相对于第一射束的损耗射束，

利用光学元件将所述第一射束和第二射束聚焦到对象上，所述光学元 件界定针对第一射束和第二射束的公共光学路径，以及

在所述公共光学路径中提供相位修改构件，

其中，所述相位修改构件以光学方式被布置成用于使所述第一射束的 波前基本不变，并改变所述第二射束的波前，以便在所述对象中生成未损 耗的感兴趣区域。根据这一方面，本发明尤其有利，因为可以修改和/或更 新一些光学STED显微镜检查系统以根据本发明工作。

总体而言，可以在本发明的范围之内以任何可能方式组合和耦合本发 明的各方面。参考下文描述的实施例，本发明的这些和其他方面、特征和/ 或优点将变得显而易见并得以阐述。

附图说明

将参考附图仅以举例方式描述本发明的实施例，在附图中：

图1是根据本发明的光学显微镜检查STED系统的示意图；

图2是根据本发明的第一射束和第二射束的波前的示意图；

图3是根据本发明的来自具有方位角配置的相位修改构件的不同视图 的更详细的示意图；

图4-6示出了3组图，其示出了对应的相位与角度关系（左侧），以及 焦平面中所得的斑分布与缩放的径向距离的关系（右侧）；

图7和8分别示出了表2-4的相位修改构件生成的斑的二维强度分布， 以及具有等尺寸段的理想相位修改构件的强度分布；

图9示出了由具有7段的相位修改构件生成的斑的二维强度分布；

图10示出了根据本发明另一实施例具有圆形配置的梯级相位修改构件 的实施例；

图11示出了根据本发明的光学子单元；以及

图12是根据本发明的方法的流程图。

具体实施方式

图1是根据本发明的光学显微镜检查STED系统10的示意图。光学显 微镜检查系统10适于对相关联的对象O（不形成光学系统自身的一部分） 的受激发射损耗（STED）成像，参见Harke，J.Keller，C.K.Ullal，V.Westphal， A.和S.W.Hell，“Resolution scaling in STED microscopy”，Optics  Express 16（2008），第4154-4162页以获得STED方法的更多技术细节，在 此通过引用将其全文并入。

光学系统10包括辐射发生器件5，例如两个或更多个脉冲激光器或单 个可调谐激光器或其他适当的辐射发生器，其能够至少发射第一射束1和 第二射束2。第一射束1为激励射束，例如用于对对象进行荧光成像，第二 射束2是相对于第一射束1的损耗射束，通常具有红移的能量，即更低能 量，用于导致对象O中的一区域中损耗。

另外，提供了光学元件6，例如透镜或光功率非零的其他部件，用于在 对象O上聚焦第一射束1和第二射束2。所述光学元件相对于辐射发生器 件7被布置成用于界定针对第一射束1和第二射束2两者的公共光学路径 OP。在图1中，第一射束1和第二射束2仅出于使图清晰的原因被垂直偏 移，通常在实际实现中尽可能地使空间交叠最大化，以利用射束。

此外，在所述公共光学路径OP中插入相位修改构件5，相位修改构件 5以光学方式被布置成用于使第一射束1的波前基本不变，并改变第二射束 2的波前，以便在对象O中生成未损耗的感兴趣区域。等价地讲，可以说， 相位修改构件5以光学方式被布置成用于使第一射束的相位改变2pi（π） 的整数倍，即实际使相位不变，并且还使第二射束的相位改变与2pi的整数 倍不同的倍数，从而在对象中生成未损耗的感兴趣区域。这便于使用单一 射束路径，即沿着公共光学路径，对于STED显微镜检查，提供了诸多优 点，尤其是更容易使用和/或更紧凑的光学设计。

想到了可以将相位修改构件5和光学元件6组合成与两个独立实体具 有类似或等效功能的单个实体（未示出）。

图2是沿着光学路径OP的根据本发明的第一射束1和第二射束2的波 前的示意图，其中，两个射束被显示到两个不同的时间；在时间=A“EXCIT”， 第一激励射束1被示为通过相位修改构件5，并且波前不变，或者等效地， 第一射束没有光学象差。应当指出的是，这通常高度取决于第一射束1的 波长。

接下来，在时间=B“STED”，第二损耗射束2的波前被示为通过相位 修改构件5，结果波前2'变化，由波前2'中的中断示意性地表示。应当对第 二射束2的波前变化标以尺度以在对象O中生成未损耗的感兴趣区域ROI。 在下文中将更详细地描述这种情况。

在图2右侧，针对不同时间示出了对应的焦平面FP，在时间=A “EXCIT”，利用能够在对象O中导致例如荧光作用的辐射来辐照圆。在时 间=B“STED”，修改的损耗射束2'导致圆周区域中损耗；在图2中用圆形 未损耗区域周围的黑色示意性表示。在稍晚的时间=C“ROI”，荧光作用将 仅仅，或者主要取决于损耗程度，来自中央感兴趣区域ROI，其可能具有 所发射荧光波长以下，即衍射极限以下的空间尺度（例如，圆的直径）。

图3是根据本发明的来自具有方位角配置的相位修改构件5的不同视 图的更为详细的示意图。方位角配置表示可以由中心轴，即公共光学路径 OP周围的常规柱面坐标描述的配置合理代表或近似的配置。图3中所示的 构件5包括三个区域或方位角段31、32和33，其中，相位修改构件5能够 通过如下方式修改第二射束2的波前：使表面具有多个区域，至少包括第 一区域31、第二区域32和第三区域33，第二区域32具有突出的高度h， 其高于第一区域31的高度，并且此外，第三区域或段33具有高于第二区 域32的高度。在构件5下方的图中图示了这种情况，其示出了高度h与方 位角的关系。

应当提到的是，构件5的表面可以与另一种光学材料或介质，例如玻 璃、聚合物或空气，界面相连，使得在设计相位修改构件时，有效的波前 改变应当考虑到这种情况。通常，为了简单的原因，在制造过程中，在单 种材料中制造构件5，所述材料例如是聚合物，像PMMA、聚碳酸酯纤维、 COC、可固化树脂，像二丙烯。于是，不同区域的不同高度可以在构件5 的外表面上，同样如图3中所示。

图4-6示出了3组图，其针对具体范例示出了对应的相位与角度关系（左 侧），以及焦平面中所得的斑分布与缩放的径向距离的关系（右侧）。

令相位修改构件5由PMMA制成。在激励波长635nm，PMMA的折 射率为1.490，而在损耗波长735nm，折射率为1.487。令相位板向波前引 入相位令损耗射束的数值孔径（aperture）NA为NA=0.6。由下式给 出焦平面处的STED斑幅度：

其中，k＝2π/λ（参见Born和Wolf，“Principles of Optics”，第七版，Pergamon 出版社，第9章）利用焦平面处的柱面坐标；（r，ψ），并且在积分以下，ρ是无量纲的。如果利用积分下的方位角近似相位

获得：

通过这种方式在635nm定义梯级高度，该步骤引入2π的相位，获得：

$h=\frac{\lambda }{n-\mathrm{ns}}.---\left(5\right)$

其中，λ是波长635nm，n是制造梯级的材料的折射率，而ns是周围介质 的折射率。在此假设周围介质为空气，因此ns=1。

在这一具体范例中，然后发现h_ex=1.2959微米。这些梯级因此不影响 激励射束。

在735nm，这一梯级不再产生2π的相位梯级，但相位等于0.8587*2π。 在表1中，列出了针对各种梯级高度在735nm波长处引入的相位。

表1：在635nm波长产生2π倍数相位，在735nm波长引入对应相位 的各种梯级高度的列表。

 n 高度（微米）   (相位mod2pi)/2pi735nm  1 1.2959   0.8587  2 2.5918   0.7173  3 3.8877   0.5760  4 5.1836   0.4347  5 6.4795   0.2933  6 7.7754   0.1520  7 9.0713   0.0107

为了在焦平面FP处产生环形斑分布，由相位修改构件5或“相位板” 产生的相位可以等于角度以弧度为单位表示。

为了在激励射束处没有影响，可以通过梯级分布近似这种分布。在表2、 表3和表4中，示出了构成具有三、四和五个等尺寸段的相位修改构件5 的范例的各种梯级列表。在图4-6中，绘制了针对损耗射束2'的焦平面中通 过对应斑分布的截面。这幅图表明，相位修改构件5确实为斑分布引入了 中心的下陷或最小值。这种情况下的最佳结果是五个梯级的相位修改构件 5，因为在这种情况下，在r=0处的强度值是最低的。再次对于激励射束1， 相位修改构件5没有效果或几乎没有效果。

表2：对于三个梯级的相位板，对于损耗射束而言，各个梯级和梯级引 入的相位列表。

表3：对于四个梯级的相位板，对于损耗射束而言，各个梯级和梯级引 入的相位列表。

表4：对于五个梯级的相位板，对于损耗射束而言，各个梯级和梯级引 入的相位列表。

图7和图8分别示出了表2-4的相位修改构件生成的斑的二维强度分 布，以及具有等尺寸段的理想相位修改构件的强度分布。

图7示出了表2-4的相位板生成的斑的二维强度分布。显然，强度分布 远非旋转对称的。表2（左）、表3（中）和表4（右）的相位板生成的斑的 二维强度分布。x轴和y轴具有[-2λ，2λ］的范围。

为了进行比较，图8示出了具有等尺寸段的理想相位板的强度分布。 具有（从左至右）3、4和5个等尺寸段的理想相位板的光斑强度分布被示 为相位不限于表1的值但具有其理想值。所得的斑显示出预期的3、4和5 重对称。显然，相对于3段相位板更优选4段和5段相位板，因为后者与 完全旋转对称偏离最远，不能提供荧光作用的均匀损耗。

在允许段并非全部尺寸相同时，可以改善相位值限于表1中那些的相 位板生成的斑形状。这样生成的额外自由度可以用于生成更加旋转对称的 斑。现在将示出如何可以从所谓的衍射积分，方程（2）导出相位板的设计 准则。可以解析地进行方程（2）中在半径上的积分，获得：

其中，

可以按照a和NA的幂展开方程（6）的右侧，给出：

$\frac{1}{a^2}(1+(\mathrm{aNA}-1)e^{\mathrm{aNA}})=\frac{{\left(\mathrm{NA}\right)}^2}{2}+a\frac{{\left(\mathrm{NA}\right)}^3}{3}+O\left(a^2{\left(\mathrm{NA}\right)}^4\right)---\left(8\right)$

向方程（2）中插回方程（6-8）并利用

得到：

在段上细分积分范围时，可以解析地执行方程（10）中出现的φ上的 积分，因为在每段上都是常数，结果给出该段上的和：

其中，k表示段号，Φ_k段相位（从表1选择），w_k段尺寸（即段k的结束角 减去开始角），而平均段角度（即开始角和结束角的平均值）。在推导方 程（11）时，使用正弦和余弦差异的公知关系：

$\sin p-\sin q=2\cos \frac{p+q}{2}\sin \frac{p-q}{2}$

(2)

$\cos p-\cos q=-2\sin \frac{p+q}{2}\sin \frac{p-q}{2}$

在检查方程（11）时，注意到，如果希望在光轴（r=0）上具有零强度， 右侧第一项应当为零：

$\underset{k}{\Sigma }{w}_k{e}^{i{\Phi }_k}=0---\left(13\right)$

此外，为了获得尽可能是旋转对称的光轴附近损耗射束的强度分布， 会希望强度|U(r，ψ)|²变得独立于ψ。在方程(11)中与cosψ和sinψ一起出现 的因子比率如下时将实现这种情况：

通过考虑以下关系可以理解这种情况：

${|A\cos \psi +B\sin \psi |}^2={\left|A\right|}^2({\cos }^2\psi +{\left|\frac{B}{A}\right|}^2{\sin }^2\psi +[\frac{B}{A}+{\left(\frac{B}{A}\right)}^{*}\left]\sin \psi \cos \psi \right)$

(15)

$={\left|A\right|}^2(1+({\left|\frac{B}{A}\right|}^2-1){\sin }^2\psi +\mathrm{Re}\left(\frac{B}{A}\right)\sin 2\psi )$

(A、B为复数)。当B/A＝±i时，方程(15)变得独立于ψ，在这种情况下， |B/A|²＝1并且Re(B/A)＝0。在方程(15)中，A和B代表方程(11)中与 cosψ和sinψ一起出现的因子，其形成方程(14)中的分母和分子。利用这 一条件，按照与强度随ψ的变化成比例的因子，方程（14）的替代但等价的 公式为：

总之，方程(13)和(14′)为相位修改构件或相位板5提供了设计规 则：给定一组相位Φ_k，必须要选择段的开始角和结束角，使得尽可能满足 方程(13)和(14′)。或者，如果段尺寸是以一些方式预定的，也可以使用 这些设计规则从一组可能的相位选择相位Φ_k：应当选择尽可能满足方程 (13)和(14′)的那些相位。

原则上，可以通过将方程（8）扩展到a的更高次并重复包括这些更高 次的以上推导来生成更多设计规则。

图9中示出了利用方程（13）和（14'）设计的7段相位修改构件5生 成的斑范例。注意斑中心附近的接近完美的旋转对称。表5中列出了相位 板设计的参数。

表5：对于七个梯级的相位板，对于损耗射束而言，各个梯级和梯级引 入的相位列表。

光学元件6（还充当聚光物镜）俘获的荧光在其被纤维末端俘获之前必 须要通过相位板5。这也将具有环形形状。为了避免探测的问题，可以采用 交替的方法，像探测返回通过光纤包层的光那样，例如，如LingFu等人的 下文所述：OPTICS EXPRESS 5528，2005年7月，13卷，14期，Nonlinear  optical microscopy based on double-clad photonic crystal fibers。

图10示出了根据本发明的另一实施例具有圆形配置的梯级相位修改构 件的实施例。产生空心斑的另一种方式是利用图7所示的梯级相位板。让 梯级出现在入射光瞳半径b的分数倍处。此外，令分布的强度是各向同性 的，梯级引入的相位为Q。那么由下式给出焦平面处的振幅分布：

当例如Q=π并且时，在r=0处强度分布将为零。以和上述类似 的方式，现在可以选择梯级使其具有5.1836微米的高度（n=4），对于损耗 射束而言相位梯级为2π的0.4347倍，对于激励束没有影响。由于对于损耗 射束而言相位梯级接近π，所以斑将具有基本环形形状。

除了图3的方位角梯级相位板实施例和图10的旋转对称径向梯级实施 例之外，在本发明的教导和一般原理之内可以使用在方位角和径向都有梯 级的实施例，例如，但不限于图10中的径向梯级与方位角梯级环组合，或 在方位角梯级相位板中沿径向（可能每段的边界半径不同）细分一些或所 有段，以便优化斑分布。

图11示出了光学子单元100，其被布置成利用光学显微镜检查系统10 中的受激发射损耗（STED）对对象O进行光学成像，光学显微镜检查系统 具有辐射发生器件7，其能够发射根据本发明的第一射束1和第二射束2（图 11中未示出的射束），如双箭头示意性所示，该器件7光学连接到子单元 100。光学子单元100包括光学引导器件110，例如光纤或其他适当的光学 元件，用于通过子单元引导第一和第二射束，该子单元还包括：

光学元件6，其用于在对象O上聚焦第一和第二射束，所述光学元 件相对于辐射发生器件被布置成用于界定针对第一和第二射束的公共 光学路径，以及

相位修改构件5，其插入公共光学路径中，

光学子单元100或其元件可以构成内窥镜、导管或针或用于医学成 像的活检针（例如用于活体内光学成像和诊断）的一部分。

图12是根据本发明的方法的流程图，该方法包括如下步骤：

S1发射包括第一射束1和第二射束2的辐射，第一射束为激励射束， 第二射束为相对于第一射束的损耗射束，

S2利用光学元件6将第一射束和第二射束聚焦到对象上，该光学元件 界定针对第一射束和第二射束的公共光学路径OP，以及

S3在所述公共光学路径中提供相位修改构件5，

其中，相位修改构件5以光学方式被布置成用于使第一射束的波前基 本不变，并改变第二射束2'的波前，以便在对象中生成未损耗的感兴趣区 域。

尽管已经在附图和前面的描述中详细例示和描述了本发明，但这样的 例示和描述被认为是例示性或示范性的，而非限制性的；本发明不限于所 公开的实施例。通过研究附图、公开和所附权利要求，本领域技术人员在 实践请求保护的本发明时，能够理解和实现所公开实施例的其他变型。在 权利要求中，“包括”一词不排除其他元件或步骤，不定冠词“一”或“一 个”不排除多个。单个处理器或其他单元可以完成权利要求中列举的若干 项目的功能。在互不相同的从属权利要求中列举特定手段的简单事实并不 表示不能有利地使用这些手段的组合。可以在适当的介质上存储和/或分布 的计算机程序，介质例如是与其他硬件一起供应或作为其他硬件一部分供 应的光存储介质或固态介质，但也可以在其他形式中分布，例如通过互联 网或其他有线或无线电信系统。权利要求中的任何附图标记不应被解释为 限制范围。