治疗增殖性疾病和病原性疾病的方法和组合物

摘要

本发明的特征在于包含抗体或其功能衍生物的蛋白，其与hCD59结合并具有中间链球菌中间链球菌溶素(ILY)蛋白结构域4活性。为了阻止CDC和ADCC的独立诱导，本发明的抗体可与ILYd4结合相同的hCD59表位和/或含有破坏抗体和补体间相互作用的修饰。

说明书

发明背景

本发明涉及增殖性疾病和病原性疾病的治疗。

补体调节蛋白CD59在哺乳动物细胞表面表达，以保护宿主细胞免遭补体激活的旁观者效应(bystander effect)。CD59活性通过结合补体蛋白C8和C9并阻止C9掺入和聚合而抑制补体膜攻击复合物(MAC)的形成。在出芽成熟期间，多种包膜蛋白，例如人巨细胞病毒、HCMV、人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)、HIV-1、猿猴免疫缺陷病毒、依波拉病毒、流感病毒和痘苗病毒，捕获CD59并用它来逃避补体系统(Stoiber等.Mol.Immunol.42：153-160(2005)，Bernet等.J Biosci28：249-264(2003)，Rautemaa等.Immunology 106：404-411(2002)，Nguyen等.J Virol 74：3264-3272(2000)，Saifuddin等.J.Exp.Med.182：501-509(1995)，Spiller等.J Infect Dis 176：339-347(1997))。其它病毒(例如松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirus saimiri))表达帮助病毒避开补体系统的CD59样分子。另外，已经鉴定出也表达CD59样分子的微生物寄生虫(例如福纳氏虫(Naegleria fowleri)和Schistosoma manosni(Parizade等.J Exp Med 179：1625-1636(1994)，Fritzinger等.InfectImmun 74：1189-1195(2006)))。这些寄生虫(其许多是胞内的)被保护，以免遭由CD59导致的人补体介导的溶解，并且还利用CD59用于感染性(出处同上)。

癌症是以异常细胞不受控生长为标志的疾病。癌细胞克服了有限寿命的正常细胞所具有的阻碍，从而无限生长。随着癌细胞的不断生长，遗传改变可持续，直到癌细胞自身表现出更具侵袭性的生长表型。如果仍不治疗的话，就可发生转移(癌细胞经由淋巴系统或血流向机体的远端区扩散)，破坏健康组织。

CD59在许多癌细胞中过量表达。补体是抗体介导的癌细胞溶解的一种主要介质。CD59的上调和高表达可驱使针对以激活补体(作为其活性机制的组分)任何抗体介导的癌症治疗的抗性。由CD59过量表达所介导的抗性的实例是针对用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cellnon-Hodgkin lymphoma，B-NHL)的抗CD20嵌合MAb利妥昔单抗的抗性。

因此，需要使病原体和癌细胞对补体介导的细胞死亡敏感的化合物和方法。

发明概述

一方面，本发明的特征在于包含抗体或其功能衍生物(例如单链抗体(scFv)、Fv、Fab、Fab′或F(ab′)₂)的蛋白，其与hCD59结合，抑制hCD59与补体蛋白C8和/或C9的结合，并且不独立诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞溶解(CDC)或细胞凋亡。这些蛋白可与ILYd4结合hCD59的相同表位和/或含有破坏ADCC、CDC和细胞凋亡的独立诱导的修饰。

在上述任何方面，所述抗体或其功能衍生物的轻链可变区含有至少1个(例如2或3个)以下互补决定区(CDR)：包含序列GASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：11)的CDRL1，包含序列GASSRATGIPD(SEQ ID NO：12)的CDRL2，和包含序列YGSSPPVT(SEQ ID NO：13)的CDRL3；和所述抗体或其功能衍生物重链可变区包含至少1个(例如2或3个)以下CDR：包含序列SYDIN(SEQ ID NO：14)的CDRH1，包含序列WMNPNSGNTGYAQKFQG(SEQ ID NO：15)的CDRH2，和包含序列GKGSGYYNY(CDRH3；SEQ ID NO：16)的CDRH3。在一个实施方案中，所述抗体或其功能衍生物具有SEQ IDNO：4所示的轻链可变区序列(例如与SEQ ID NO：4具有80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列)和SEQ ID NO：6所示的重链可变区序列(例如与SEQ ID NO：6具有80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列)。

另一方面，所述抗体或其功能衍生物的轻链可变区包含至少1个(例如2或3个)以下互补决定区(CDR)：包含序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：17)的CDRL1，包含序列DVSNRPSGVSN(SEQ ID NO：18)的CDRL2，和包含序列YAGSSTLV(SEQ ID NO：19)的CDRL3；和所述抗体或其功能衍生物的重链可变区包含至少1个(例如2或3个)以下CDR：包含序列SYDIN(SEQ ID NO：14)的CDRH1，包含序列WMNPNSGNTGYAQKFQG(SEQ ID NO：15)的CDRH2，和包含序列GRGFDWLKNFDY(SEQ ID NO：20)的CDRH3。在一个实施方案中，所述抗体或其功能衍生物具有SEQ ID NO：8所示的轻链可变区序列(例如与SEQ ID NO：8具有80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列)和SEQ ID NO：10所示的重链可变区序列(例如与SEQ IDNO：10具有80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列)。

另一方面，本发明的特征在于在有需要的患者中治疗增殖性疾病(例如其中癌细胞表达hCD59的一种疾病)的方法，其通过给予所述患者上述任何蛋白和治疗性抗体(例如利妥昔单抗、MT201、17-1A、herceptin、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、lym-1、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)或针对IL-2受体α的单克隆抗体)来进行，其中同时给予本发明的蛋白和所述治疗性抗体(例如在同一制剂中)，或在彼此相隔30(例如14)天之内给予，其总量足以治疗所述增殖性疾病。

另一方面，本发明的特征在于在有需要的患者中治疗病原性疾病(例如表达CD59或CD59样分子的病原体的相关疾病)的方法，其通过给予所述患者任何上述蛋白来进行。该方法还可包括给予治疗性抗体(例如对选自以下的病毒具有特异性的治疗性抗体：人巨细胞病毒、HCMV、人T细胞白血病病毒1型、HIV-1、猿猴免疫缺陷病毒、依波拉病毒、松鼠猴疱疹病毒、流感病毒和痘苗病毒或微生物寄生虫例如福纳氏虫和Schistosoma manosni)，其中同时给予本发明的蛋白和治疗性抗体(例如在同一制剂中)，或在彼此相隔30(例如14)天之内给予，其总量足以治疗所述病原性疾病。

再一方面，本发明的特征在于包含上述任何蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

再一方面，本发明的特征在于包含上述任何蛋白和治疗性抗体的药盒。

在某些实施方案中，所述蛋白是基本上纯的抗体。

“患者”是指任何哺乳动物，例如人、小鼠、猪、马、狗、猫或大鼠。

“增殖性疾病”是指以细胞群体在组织中不适当积聚为特征的疾病。这种不适当积聚可能是发生在细胞群体的一个或多个细胞中的遗传变异或外遗传变异所致的结果。这种遗传变异或外遗传变异导致细胞群体的细胞与周围正常组织相比生长更快，死亡更慢，或分化更慢。增殖性疾病的实例在本文给出。

“本发明的抗体”是指具有ILYd4活性的抗体或其功能衍生物。

“CD59样分子”是指病原体所表达的、能与ILY多肽结构域4结合的分子。表达CD59样分子的细胞通过抑制补体的膜攻击复合物的完全形成而抵抗补体的溶解作用。

“表达CD59或CD59样分子的病原体”是指在其外膜上含有CD59或CD59样分子的微生物(例如病毒、细菌或微生物寄生虫)。该术语是指包括在出芽成熟过程中从宿主细胞捕获CD59分子的病毒，以及含有CD59或CD59样分子的编码基因的病原体。

“中间链球菌溶素(intermedilysin)”或“ILY”是指具有中间链球菌(Streptococcus intermedius)中间链球菌溶素多肽活性的多肽。ILY可从中间链球菌中纯化或可经重组产生。对应于ILY核酸序列的示例性Genbank检索号是AB029317，对应于ILY多肽序列的示例性Genbank检索号是BAE16324。

“ILY多肽结构域4”、“ILY结构域4多肽”或“ILYd4”是指含有肽序列GALTLNHDGAFVARFYVYWEELGHDADGYETIRSRSWSGNGYNRGAHYSTTLRFKGNVRNIRVKVLGATGLAWEPWRLIYSKNDLPLVPQRNISTWGTTLHPQFEDKVVKDNTD(SEQ ID NO：1)或RNIRVKVLGATGLAWEPWRLIYSKNDLPLVPQRNISTWGTTLHPQFEDKVVKDNTD(SEQ ID NO：2)的蛋白。该术语明确地排除了全长ILY。

“片段”是指优选含有全长多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％以上的多肽部分。片段可含有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或114个氨基酸或更多。

“ILY结构域4活性”是指肽的如下活性：能拮抗人CD59、但在本文所述的溶解测定中不直接引起人红细胞(RBC)大量溶解，不独立引起补体依赖性细胞溶解(CDC)，和不独立引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞凋亡。

“hCD59的拮抗”是指hCD59与补体蛋白C8和/或C9结合减少，导致补体膜攻击复合物(MAC)的形成增加。

“基本上纯的抗体”是指已经与其天然伴随的组分分离的抗体。通常，当抗体至少有60％重量不含其天然缔合的蛋白和天然存在的有机分子时，该抗体就是基本上纯的。优选抗体纯度为至少75％、更优选至少90％、和最优选地至少99％重量。

当抗体与那些在其天然状态中与其伴随的污染物分离时，该抗体基本不含天然缔合的组分。因此，经化学合成的或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中产生的抗体，就基本不含其天然缔合的组分。因此，基本上纯的抗体包括源自真核生物体、但在大肠杆菌或其它原核生物中合成的那些。

“治疗性抗体”是指用于治疗增殖性或病原性疾病的抗体或其功能衍生物。

可通过已知方法容易地计算两个核酸序列或多肽序列的“％序列同一性”，所述方法包括但不限于描述于以下文献的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.主编，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.主编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.主编，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov和Devereux主编，M.Stockton Press，New York，1991；和Carillo和Lipman，SIAM J.Applied Math.48：1073，1988。

测定同一性方法可在公众可得的计算机程序中使用。测定两序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，Nucleic Acids Research 12：387，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。BLAST程序是公众可从NCBI和其它来源获得的(BLAST Manual，Altschul，等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894)。可在例如以下URL中进行搜索：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/unfinishedgenome.html；或http://www.tigr.org/cgi-bin/BlastSearch/blast.cgi.。这些软件程序通过将同源性程度赋值给各种取代、缺失和其它修饰而匹配相似序列。保守取代通常包括以下各组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。

“互补决定区(CDR)”是指免疫球蛋白轻链和重链各自中的可变区的3个超变序列。“构架区(FR)”是指位于免疫球蛋白轻链和重链的3个超变序列(CDR)每一侧的氨基酸序列。

抗体或其功能片段的可变区之间的共同结构特征是本领域众所周知的。编码特定抗体的DNA序列通常可参见以下众所周知的方法：例如Kabat等.2987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda MD中所描述的，其通过引用结合到本文中。另外，来自抗体的功能性可变区的通用克隆方法可参见Chaudhary，V.K.等，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1066，其通过引用结合到本文中。

发明详述

一般而言，本发明的特征在于包含抗体或其功能衍生物的蛋白，其与hCD59结合并具有中间链球菌中间链球菌溶素(ILY)蛋白结构域4活性。以下描述集中在抗体和功能衍生物，但通常也可用于包含抗体和功能衍生物的重组蛋白(例如融合蛋白)，除非另有说明。为了阻止CDC和ADCC的独立诱导，本发明的抗体可与ILYd4结合相同的hCD59表位和/或含有能破坏抗体和补体间相互作用的修饰。

本发明的抗体通过减少人CD59与补体蛋白C8和/或C9的结合而拮抗hCD59，导致MAC形成的增加。此外，本发明的抗体在没有第二抗体与细胞结合时，不导致细胞凋亡或细胞死亡。第二抗体可以是治疗性抗体，或者它可以是天然产生的抗体。

I.本发明的抗体

本发明的特征在于例如具有ILYd4活性的与hCD59结合的蛋白，例如抗体和其功能衍生物。抗体的开发是本领域熟知的。具体地讲，本发明的抗体拮抗hCD59，而不独立诱导细胞凋亡或ADCC。这样的抗体可被修饰，使它们不直接与补体相互作用。例如，抗体可缺乏Fc区(例如Fab)，或可修饰Fc区(例如通过突变)，使其不与补体相互作用。

鉴定了与ILYd4竞争结合hCD59的2个Fab，其各自在以下说明。

Fab-2克隆3

VL-CL(核酸)

5’-

gagctcgtgttgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcggggcc

agtcagagtgtcagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccgctcccaggctcctcatctatgg

tgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcacca

tcagcagactggagcctgaagattttgcattattactgtcagcagtatggtagctcacctccagtcaccttcggcca

agggacacgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttg

aatcggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggat

aacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaggaagcacctacagcctcag

cagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcaggg

cctgagcttgcccgtcacaaagagcttcaacagggagatgt-3’(SEQ ID NO：3)

VL-CL(氨基酸)

(3个CDR有下划线；可变区为黑体字)

AAPSVFIFPPSDEQLSGTASVVCLLNNFYPR

EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH

KVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：4)

VH-CH1(核酸)

5’-

aaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggctt

ctggatacaccttcaccagttatgatatcaactgggtgcgacaggccactggacgggcttgagtggatgggatgg

atgaaccctaacagtggtaacacaggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccaggaacacct

ccataagcacagcctacatggagctgagcagctagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggcaa

agggagtggttattataactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctctgcctccaccaagggcccatc

ggtcttcccctgcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactac

ttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacctcccgctgtcctac

agtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatct

gcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacagaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactagt-

3’(SEQ ID NO：5)

VH-CH1(氨基酸)

(3个CDR有下划线；可变区为黑体字)

GPSVFLAPSSKST

SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS

SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS(SEQ IDNO：6)

Fab-3克隆7

VL-CL(核酸)

5’-

cagctcgccctgactcagcctccctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaacca

gcagtgacgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacaacacccagaaagcccccaaactcatgatttatga

tgtcagtaatcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgacaatct

ctgggctccaggctgaggacgagcgattattactgctgctcatatgcaggtagtagcactttggtgttcggcggag

ggaccaagctgaccgtcctaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggag

cttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggccgtgacagtggcctggaagg

cagatggcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcg

gccagcagctatctgagcctgacgcctgagcaggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaa

gggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgt-3’(SEQ ID NO：7)

VL-CL(氨基酸)

(3个CDR有下划线；可变区为黑体字)

AAPSVTLFPPSSELQANKATLVCLISD

FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQW

KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC(SEQ ID NO：8)

VH-CH1(核酸)

5’-

gaggtgcagctggtggagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggctt

ctggatacaccttcaccagctatgatatcaactgggtgcgacaggccactggacgggcttgagtggatgggatg

gatgaaccctaacagtggtaacacaggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccaggaacacc

tccataagcacagcctacatggagctgagcagctagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggcc

gaggttttgactggttaaaaaactttgactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcccctgcctccaccaa

gggcccatcgtttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtc

aaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcggcaaccttcccg

gctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccag

acctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaggtgacaagaaagttgagcccaaatcttgtgaca

aaact-3’(SEQ ID NO：9)

VH-CH1(氨基酸)

(3个CDR有下划线；可变区为黑体字)

GPVFPLAPSS

KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT(SEQ IDNO：10)

除了以上Fab的特征之外，本发明的另一特征在于产生这些Fab的方法，其使用例如含有例如具有SEQ ID NO：3、5、7和9的序列的核酸的质粒和宿主细胞来进行。另外，本发明的特征在于抗体或其功能片段，其含有上述Fab-2和Fab-3蛋白的至少1个(例如2、3、4、5或优选6个)CDR。这些方法在以下有更详细讨论。

用于产生单克隆抗体的鼠骨髓瘤细胞系可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC；Manassas，VA)获取。也已描述了人骨髓瘤和小鼠-人的杂交骨髓瘤细胞系(heteromyeloma cell line)(Kozbor等，J.Immunol.，133：3001-3005，1984；Brodeur  等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，第51-63页，1987)。

可在包括小鼠、大鼠、兔、山羊、骆驼和人在内的任何哺乳动物中制备抗体。抗体可以是以下免疫球蛋白种类之一的成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类，并且优选地为IgG抗体。尽管产生单克隆抗体的优选动物是小鼠，但是本发明并不限于此；事实上，人抗体也可使用并且可证明是优选的。通过使用人杂交瘤可获得这样的抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss Inc.，第77-96页，1985)。在本发明中，可使用这样的技术：所述技术开发用于通过将合适抗原特异性的小鼠抗体分子基因与人抗体分子基因剪接在一起以产生嵌合抗体(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等，Nature 312，604-608，1984；Takeda等，Nature 314，452-454，1985)。

本发明也包括具有ILYd4活性的抗体功能衍生物。功能衍生物包括其氨基酸序列与本发明抗体的可变区或高变区的氨基酸序列基本相同的多肽。功能衍生物具有相当于抗体的抗原结合特征，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体和单链抗体或抗体片段、抗原结合抗体片段、以及与第二蛋白融合的抗体、或本领域已知的其它衍生的抗体。产生这类功能衍生物的方法公开于例如PCT公布号WO93/21319；欧洲专利号0 239 400B1；PCT公布号WO89/09622；欧洲专利申请号0338,745；欧洲专利申请号0332424；美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984；Boulianne等，Nature，312：643-646，1984；Neuberger等，Nature，314：268-270，1985，Smith等，FASEB J.19：331-341(2005)；和美国专利申请公布号20050208043和20050276802，其各自通过引用结合到本文中。

嵌合抗体优选具有基本衍生自或唯独衍生自人抗体恒定区的恒定区和基本衍生自或唯独衍生自非人哺乳动物可变区序列的可变区。人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的(有关综述参见Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy Asthma Immunol.，81：105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1：118-129，2001)。通常，人源化抗体具有引入其中的来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为引入(import)残基，其通常来自引入的可变区。基本上按照本领域已知方法可进行人源化(Jones等，Nature，321：522-525，1986；Riechmann等，Nature，332：323-329，1988；和Verhoeyen等，Science，239：1534-1536 1988)，即通过用人抗体的相应序列取代啮齿类CDR或其它CDR序列。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人可变区已经被非人类物种的相应序列取代(参见例如美国专利号4,816,567)。在实践中，人源化抗体通常是其中某些CDR残基和可能某些FR残基被来自啮齿类抗体类似位置的残基取代的人抗体(Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596，1992)。

制备人源化抗体的额外方法可参见美国专利号5,821,337和6,054,297，以及Carter，(出处同上)，所述文献都通过引用结合到本文中。人源化抗体选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。尽管不需要细胞毒活性，例如在本发明中，但是恒定区优选为IgG₂类。人源化抗体可包含来自不止一种类型或同种型的序列，并且选择特定恒定区以优化所需效应子功能是在本领域普通技术人员能力范围之内。

也可使用本领域已知的多种技术产生人抗体，所述技术包括噬菌体展示文库(Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597，1991，Winter等.Annu.Rev.Immunol.，12：433-455，1994和Smith等，出处同上)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，出处同上；Boerner等，J.Immunol.，147：86-95，1991)。

合适的非人类哺乳动物包括从中可制备单克隆抗体的任何哺乳动物。非人类哺乳动物的实例包括例如兔、大鼠、小鼠、马、山羊或灵长类；优选小鼠。

抗体的“功能衍生物”包括单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)。单链抗体片段是通常与抗原或受体结合的重组多肽；这些片段含有抗体重链可变区氨基酸序列(V_H)的至少一个片段，其通过或不通过一个或多个交互接头(interconnecting linker)连接抗体轻链可变区序列(V_L)的至少一个片段。这样的接头可以是柔性短肽，经选择可保证当其连接时，V_L和V_H区发生合适的三维折叠，以维持作为单链抗体片段来源的完整抗体的靶分子结合特异性。通常，这样的肽接头将V_L序列或V_H序列的羧基端与互补V_L序列和V_H序列的氨基酸端共价连接。通过分子克隆、抗体噬菌体展示文库或类似技术可产生单链抗体片段。可在真核细胞或原核细胞包括细菌中产生这些蛋白。

单链抗体片段含有具有本说明书所述的完整抗体的至少一个可变区或CDR的氨基酸序列，但缺乏这些抗体的某些或全部恒定区。这些恒定区不是抗原结合所必需的，但组成完整抗体结构的主要部分。因此单链抗体片段可克服使用含有部分或全部恒定区相关的某些问题。例如，单链抗体片段倾向于没有不想要的生物分子与重链恒定区之间的相互作用，或其它不想要的生物活性。另外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此具有更大的毛细管渗透性，允许单链抗体片段更有效地定位于并结合到靶抗原结合位点。另外，可在相对大规模上，在原核细胞中产生抗体片段，由此便于它们的产生。此外，相对小尺寸的单链抗体片段使其不会象完整抗体那样在受体中引起免疫应答。

“功能衍生物”还包括具有与完整抗体相同或相当的结合特征的抗体片段。这样的片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab’)₂片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其它抗原结合亚序列)。优选抗体片段含有完整抗体的所有6个CDR，但含有少于全部这类区(例如3、4或5个CDR)的片段也可以是有功能的。

此外，功能衍生物可以是或可结合以下免疫球蛋白类别的任一成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类。

通过本领域已知方法制备抗体衍生物。例如，可从完整抗体经酶促反应制备抗体片段。优选地，从编码抗体等同物的DNA制备这样的等同物。可通过缺失编码全长抗体的DNA中所需部分之外的所有部分来制备编码抗体片段的DNA。

可通过将基本上或唯独编码人恒定区的DNA与基本上或唯独衍生自非人哺乳动物可变区序列的可变区的编码DNA重组，而制备编码嵌合抗体的DNA。可通过将不含基本上或唯独衍生自相应的人抗体区的CDR的恒定区和可变区的编码DNA与基本上或唯独衍生自非人哺乳动物的CDR的编码DNA重组，而制备人源化抗体的编码DNA。

编码抗体片段的合适DNA分子来源包括表达全长抗体的细胞，例如杂交瘤。片段本身可用作抗体衍生物，或可重组到衍生物中，如上所述。

以下方法用于鉴定本发明的抗体及其功能衍生物。

本发明的抗体可与ILYd4结合相同表位。

将只特异性表达人CD59的来自人或hCD59RBC转基因小鼠的红细胞与候选抗体一起预孵育(10分钟，在室温下)，再与ILYd4或小鼠抗hCD59单克隆抗体(0.2μg/ml)(BRIC 229，Bristol，英国)在室温下孵育30分钟，然后洗涤。将细胞再分别与FITC-缀合的抗His抗体或FITC-缀合的相应第二抗体一起孵育。细胞用PBS洗涤3次，再用FACScan(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)检测荧光强度。和能与ILYd4结合相同表位的本发明抗体一起预孵育的细胞，在用ILYd4加FITC抗HIS或者BRIC 229加FITC第二抗体时不染色。不与本发明抗体一起预孵育的细胞仅用BRIC 229加FITC第二抗体才染色。

本发明的抗体和ILYd4可功能性地相互作用于hCD59的相同表位。

将来自人或hCD59RBC转基因小鼠的红细胞与候选抗体和ILYd4(不同浓度)在室温下预孵育10分钟。加入全长ILY以诱导溶血。本发明的抗体阻断全长ILY-介导的溶血，并因此功能性地阻断ILY接近细胞中的人CD59。

本发明的抗体在人红细胞中诱导补体介导的溶解。

在候选抗体存在或不存在时，与ILYd4相比，通过两种方法评价人红细胞对人补体介导的溶解的敏感性：(1)眼镜蛇毒因子(CVF，5mg/L)溶解测定；和(2)抗人红细胞抗体(Ab)-致敏的红细胞方法，如以下文献所述：Hu等.Nat Med 14：98-103(2008)，其通过引用全部结合到本文中。人血清(HS，50％v/v)用作补体来源，热灭活人血清(HIS，50％，v/v)用作对照。与抗人红细胞抗体组合，本发明的抗体增强补体介导的溶解，其程度类似于ILYd4。此外，当单独测试时，本发明的抗体不诱导溶血。

本发明的抗体单独不引起细胞凋亡。

将候选抗体与表达hCD59的FL淋巴瘤细胞一起孵育48小时，并评价细胞凋亡(例如按照制造商使用指南，使用末端核苷转移酶-介导的缺口末端标记(TUNEL)测定(Roche))。类似于ILYd4，本发明的抗体在该测定中不诱导细胞凋亡。

本发明的抗体不单独引起ADCC。

FL淋巴瘤细胞用绿色荧光胞质染料5-和(6)-羧基荧光素二乙酯琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate，succinimidylester，CSFE；Molecular Probes，Inc.)染色。洗涤之后，将标记的FL细胞与候选抗体或ILYd4一起孵育。将外周血单核效应(E)细胞(PBMC)与靶(T)细胞混合，细胞比为50∶1E/T，并在37℃，5％CO₂孵育4小时。离心细胞并用Infinite F200(Tecan)检测染料释放。特异性溶解百分比如下确定：[(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)]X100。死细胞用碘化丙啶(50Ag/mL；Sigma-Aldrich)染色并在FACScalibur仪器上分析，以控制通过测定染料释放而得到的数据。类似于ILYd4，本发明的抗体不单独诱导ADCC。

测定ILYd4活性的额外实验方法描述于例如国际申请号PCT/US2008/004191和PCT/US2008004193，其各自通过引用全部结合到本文中。

II.给药方法

可单独或与另一治疗组合进行本发明的治疗并且可在家、医生办公室、诊所、医院的门诊部或医院内提供。治疗任选在医院开始，使医生能够密切观察治疗效果并作出所需的任何调整，或者可在门诊病人基础上开始。治疗持续时间取决于所治疗疾病或阻碍的种类、患者的年龄和状况、患者所患疾病的阶段和类型、以及患者对治疗的反应。另外，具有发展增殖性或病原性疾病的更大危险的人可接受治疗，以抑制或延缓症状的发生。

用于不同实施方案的给药途径包括但不限于局部、透皮、经颅(transcranial)、鼻腔和系统给药(例如静脉内、肌内、皮下、吸入、直肠、含服、阴道、腹膜内、关节内、眼部、耳部或口服给药)。本文所用的“系统给药”是指所有的非皮肤给药途径，并且特别不包括局部和透皮给药途径。

本发明的抗体可以片剂、胶囊剂、酏剂或糖浆剂形式口服给药、或以栓剂形式直肠给药。所述抗体也可以泡沫剂、洗剂、滴剂、乳膏剂、软膏剂、柔润剂或凝胶剂形式局部给药。化合物的胃肠外给药适宜例如以盐水溶液剂形式或将化合物掺入脂质体中给药。

剂量

本发明抗体的剂量取决于若干因素，包括：给药方法、所治疗疾病、疾病的严重程度、是要治疗还是预防疾病、以及所被治疗者的年龄、体重和健康。另外，具体患者的药物基因组学(pharmacogenomic)(基因型对治疗的药物动力学、药效动力学或功效概况的影响)信息会影响所用剂量。

连续每天给予本发明抗体可能是不需要的。治疗方案需要循环，在此期间不给予抗体，或者在急性病期间可视需要而提供治疗。本领域技术人员可确定合适剂量和治疗方案。

III.适应症

本发明的抗体可用于治疗以不想要的hCD59活性为特征的任何疾病。

本发明的抗体可用于治疗癌症和以过度增殖细胞为特征的其它疾病(增殖性疾病)。在这些实施方案中，可将本发明的抗体直接给予表达CD59的肿瘤(neoplasia)，或系统给予肿瘤患者。优选地，将本发明的抗体与抗癌用治疗性抗体一起给予。

在一个分离的实施方案中，可将本发明的抗体给予经诊断患有不以细胞表面表达CD59为特征的增殖性疾病的患者。在此，将化合物与抗癌用治疗性抗体联用，以阻止对基于治疗性抗体的治疗的抗性。

抗体治疗可单独或与其它治疗(例如手术、放疗、化疗、免疫治疗、抗血管生成治疗或基因治疗)联用。可以按照包括静息期(rest period)在内的开和关周期(on-and-off cycle)给予治疗，使患者身体有机会从任何无法预料的副作用中恢复过来。

癌症包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成肌细性白血病(myeloblastic leukemia)、急性前髓细胞性白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴性白血病和多发性骨髓瘤)、真性红细胞增多症(polycythemia vera)、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、以及实体瘤例如肉瘤和癌(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、血管内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilm′s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。

本发明的抗体可用于治疗以CD59或CD59样分子的表达为特征的病原体。例如，本发明的抗体可用于治疗在其包膜中含有CD59的病毒(例如人巨细胞病毒、HCMV、人T细胞白血病病毒1型、HIV-1、猿猴免疫缺陷病毒、依波拉病毒、流感病毒和痘苗病毒(痘病毒))，其中在从表达CD59的宿主细胞中出芽成熟期间捕获CD59(Stoiber等.Mol.Immunol.42：153-160(2005)，Bernet等.J Biosci 28：249-264(2003)，Rautemaa等.Immunology 106：404-411(2002)，Nguyen等.J Virol74：3264-3272(2000)，Saifuddin等.J.Exp.Med.182：501-509(1995)，Spiller等.J Infect Dis 176：339-347(1997)))。本发明的抗体也可用于治疗感染了直接表达CD59或CD59样分子的寄生虫或病毒(例如松鼠猴疱疹病毒、Schistosoma manosni和福纳氏虫)的患者(Parizade等.J ExpMed 179：1625-1636(1994)，Fritzinger等.Infect Immun 74：1189-1195(2006))。在这些实施方案中，可将本发明的抗体直接给予感染病原体的组织或系统给予感染病原体的患者。优选地，本发明的抗体可与对表达CD59或CD59样的病原体具有特异性的抗体一起给予。治疗可以单独进行或与其它抗微生物治疗一起进行。

IV.治疗性抗体

本发明的特征在于通过给予本发明的抗体以及治疗性抗体而治疗增殖性或病原性疾病。给予本发明的抗体可使抗体治疗所靶向的细胞对补体介导的细胞溶解敏感。用于本发明治疗增殖性疾病的方法的治疗性抗体的实例见表1。

表1：施用于癌症治疗的有关抗体

用于本发明治疗HIV的方法的治疗性抗体的实例是人源化抗体hNM-01(Nakamura等，Hybridoma，19：427(2000))和人源化KD-247抗体(Matsushita等，Hum Antibodies 14：81-88(2005))。治疗RSV的一个实例是帕利珠单抗(Palivizumab)。可使用标准方法，使用任何HIV表位或其它表达CD59的病原体来开发其它抗体(优选人源化抗体)。

除了以上列出的抗体和适应症之外，本发明的特征还在于共同给予本发明的抗体以及可通过抑制人CD59活性而增强的任何治疗。

V.实验结果

针对固定化CD59筛选人幼稚(naive)Fab文库。根据D408Y(ILY结构域4蛋白)的抑制作用，测定所选Fab与CD59的结合。首先，各板包被D408Y，加入CD59，然后用特异性抗CD59抗体检测D408Y和CD59的相互作用。然后，通过直接包被CD59而进行头三轮筛选，并通过包被溶解的表达CD59的红细胞而进行第4轮筛选。从第4次洗脱物中，鉴定40个克隆，再用包被CD59的板进行噬菌体ELISA。然后，鉴定32个阳性克隆。通过DNA测序，从32个阳性克隆中显示出3种独特Fab(Fab-1、2和3)。同时，从阴性克隆中也鉴定出另外3种Fab(Fab 4、5和6)。因为Fab-1和Fab-6的基因内存在意料之外的内部‘TAG’琥珀终止密码子，所以让4种Fab(Fab 2、3、4和5)进行可溶性表达和可溶性ELISA。在CD59存在下研究了2个阳性克隆(克隆3和7；分别称为Fab-2和Fab-3)的结合信号。Fab-2和Fab-3的可变区重链和轻链的氨基酸序列如上所示。

材料与试剂

靶蛋白：CD59

配体：D408Y(ILY结构域4蛋白)

抗CD59抗体

2管红细胞

预制的人幼稚Fab文库(HuFabL)

M13K07辅助噬菌体

抗HA mAb-HRP缀合物

测序引物：

(VL-引物)；5’-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3’(SEQ IDNO：21)

(VH-引物)：5’-ACCTATTGCCTACGGCAGCCG-3’(SEQ IDNO：22)

LB培养基：每升：10g Bacto-胰蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl。

LB板：LB培养基+15g/L琼脂糖.

2TY培养基：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，加去离子H₂O至1L，用1M NaOH调节至pH 7.0。高压灭菌。

2TY-G：含有1％(w/v)葡萄糖的2TY

2TY-AG：含有100μg/mL氨苄青霉素(AMP)和1％(w/v)葡萄糖的2TY

2TY-A：含有100μg/mL氨苄青霉素(AMP)的2TY

2TY-AK：含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素的2TY

TYE琼脂板：将15g琼脂加入到1L 2TY培养基中，高压灭菌，冷却后加入葡萄糖到1％(w/v)和AMP。

PBS：每升：8g NaCl，0.2g KCl，1.7g Na2HPO4，0.163g KH2PO4，用HCl调节pH至7.4。

封闭缓冲液：0.1M NaHCO3(pH 8.6)，5mg/mL BSA，0.02％NaN3，0.1μg/mL链霉抗生物素。过滤除菌，贮存于4℃。

包被缓冲液：0.1M NaHCO3(pH 8.6)。

酸性洗脱缓冲液：0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)，1mg/mL BSA。

噬菌体沉淀剂(PEG/NaCl)：20％(w/v)聚乙二醇-8000，2.5MNaCl。高压灭菌，在室温下贮存。

TE缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA。

50％甘油/PBS：PBS和甘油的等量混合物。

HRP-缀合的抗M13抗体。

HRP的底物：OPD，来自Sigma。

底物缓冲液：2.6g柠檬酸和6.9g Na2HPO4到500mL。如果需要，调节pH至5.0。

实验程序：

1.制备M13K07辅助噬菌体

通过在37℃用不同稀释度的M13K07噬菌体感染对数期TG1细菌细胞达30分钟并铺到2TY板的上层琼脂上，制备辅助噬菌体。

将小噬斑接种到3mL液体2TY培养基。加入30μL TG1过夜培养物并在37℃培养2小时。

将培养物在1L 2TY培养基中稀释并培养1小时。加入卡那霉素到50μg/mL并在37℃培养16小时。

通过离心(10min，5000g)除去细胞并通过加入0.25体积的噬菌体沉淀剂将噬菌体从上清液中沉淀下来。在冰上孵育30min之后，通过在5000g离心10min收集噬菌体颗粒。将沉淀物重悬于5mL PBS中并通过0.22μm滤器除菌。

在具有含100μL TG1(饱和培养物)和噬菌体稀释液的上层琼脂层的2TY板上测定噬斑形成单位(pfu)数来滴定辅助噬菌体。稀释噬菌体贮液至1×10¹³pfu/mL和以小等分试样贮存在-20℃。

2.制备文库噬菌体

用文库甘油贮液接种500mL 2TY-G并在37℃，在250rpm振摇孵育，直到600nm处光密度达到0.8-0.9。

加入M13KO7辅助噬菌体至终浓度5×10⁹pfu/mL，在37℃孵育30分钟，不振摇，再温和振摇(200rpm)30分钟，允许噬菌体感染。

在2200g离心15min以回收细胞并将沉淀重悬于同样体积的2TY-AK。在30℃下快速振摇(300rpm)孵育过夜。

在4℃，7000g离心15min以沉淀细胞，将含有噬菌体的上清液回收至预冷的1-L瓶中。

加入0.3体积的噬菌体沉淀剂。温和混合并让噬菌体在冰上沉淀1小时。

在4℃，在同一瓶子中以7000g离心15min 2次，以沉淀噬菌体。尽可能除去上清液并将沉淀重悬于8mL PBS中。

在更小的管子中，12,000g再次离心噬菌体达10min并经上清液回收噬菌体。确保不扰动任何出现的细菌沉淀。

通过用噬菌体贮液的稀释液感染TG1细胞，铺到2TY-AG上，孵育并统计出现的氨苄青霉素抗性菌落，来滴定噬菌体贮液。再将噬菌体的等分试样贮存于4℃，用于筛选。

3.淘选

通过在37℃孵育2小时，直接包被靶蛋白。

用封闭缓冲液，在4℃对淘选板(Nunc)封闭过夜。

用0.1％PBST(PBS加有0.1％吐温20(V/V))对已封闭的孔洗涤6次。

将等体积的噬菌体文库和4％PBSM(含有4％牛奶的PBS)混合并加入到淘选孔中。在室温下孵育60min。

用PBSMT(含有2％牛奶，一定百分率的吐温20的PBS)洗涤10-20次。

加入200μL酸性洗脱缓冲液并在室温下孵育5min。将含噬菌体的上清液移至新管中并用Tris-HCl缓冲液中和。

用洗脱的噬菌体感染新鲜的大肠杆菌TG1的对数生长培养物并扩增其半数，用于下轮筛选。将剩余洗脱物贮存于4℃。

4.噬菌体ELISA

1)制备抗体展示噬菌体的单克隆

将来自第4轮的洗脱物的单克隆接种到5mL 2YT-AG培养基并在37℃孵育过夜。

对于每个克隆都用过夜培养物制备甘油贮液。将100μL过夜培养物接种到20mL 2YT-AG培养基中。在37℃培养数小时，直到光密度OD600达到0.4-0.5。

以20的感染复数(即噬菌体颗粒/宿主细胞数)加入VCSM13辅助噬菌体。在37℃，不振摇，孵育30分钟，再边振摇边孵育30min，以感染细胞。

离心(10min，5000g)收集感染细胞。重悬于2YT-AK并在30℃使培养物生长16小时。

如上所述，从上清液中沉淀噬菌体颗粒。将噬菌体沉淀重悬于1mL PBS并通过离心(10min，5000g)去除细胞碎片。

为了除去未与噬菌体颗粒缔合的Ab片段，进行第二次沉淀。将噬菌体沉淀重悬于250μL PBS，通过离心再次澄清。

2)通过直接包被靶蛋白(CD59或红细胞膜)进行噬菌体ELISA。

在包被缓冲液中，通过在4℃孵育过夜而包被100μL靶蛋白(10μg/mL)。

振摇包被溶液并用洗涤缓冲液洗涤一次。用250μL封闭缓冲液封闭所有孔。为了测试每种所选序列与BSA包被的塑料表面的结合，也封闭足量的未包被孔。将已封闭的各板在4℃孵育1-2小时。

振摇封闭缓冲液并用洗涤缓冲液洗板6次。

每孔加入100μL含噬菌体溶液的洗涤缓冲液。在室温下孵育1-2小时。

用洗涤缓冲液洗涤6次。在封闭缓冲液中稀释HRP-缀合的抗M13抗体(GE healthcare)1∶5,000。每孔加入100μL稀释的缀合物并在室温下孵育1小时。

用洗涤缓冲液洗涤6次。如下制备HRP底物溶液：可提前制备OPD贮液，即通过将22mg OPD(Sigma)溶于100mL 50mM柠檬酸钠，pH 4.0中来制备。过滤除菌并贮存于4℃。临到检测步骤之前，将36μL 30％H₂O₂加入到21mL OPD贮液中。

每孔加入100μL底物溶液并在室温下孵育30分钟。

用微量板读板器在490nm处读板。

5.可溶性ELISA

在HB2151细胞的周质中可溶性表达。

从LB板上挑取带有Fab表达载体的HB2151细菌单菌落并在37℃在2TY中培养过夜。

将100μL HB2151培养物加入到50mL 2TY并在37℃(同时振摇)培养至OD600为0.6-0.8。

用经噬菌体ELISA鉴定的阳性克隆噬菌体感染HB2151。将1μL噬菌体接种到200μL对数期HB2151培养物的等分试样中。在37℃(不振摇)孵育30分钟。接种到LB-AG板并在37℃孵育过夜。

将单菌落接种到5mL 2TY生长培养基的等分试样中并在37℃(同时温和振摇)培养过夜。

从每孔取出250μL过夜培养物等分试样并移至25mL 2TY生长培养基。在37℃使培养物生长，直到OD600约为0.6。

加入250μL 2TY诱导培养基和在30℃培养过夜。

在3500g离心10min收集细胞。通过在1/10体积的PBS中超声处理细胞悬液而释放可溶性Fab。

在9000g离心10min，然后收集含可溶性Fab的上清液。

2)可溶性Fab ELISA

重复4-2中概述的步骤。

弃去封闭液并加入100μL含可溶性Fab的上清液。在室温下孵育2小时。

用200μL PBST洗涤各孔3次。

将100μL PBSM稀释的兔抗人Fab多克隆抗体的HRP缀合物加入各孔并在室温下孵育1小时。

用200μL PBST洗涤各孔3次。

用OPD进行HRP显色反应并在490nM读取光密度。

6.DNA测序

对于每种阳性克隆(经噬菌体ELISA和/或可溶性ELISA测定)，将2μL携带质粒的TG1细菌细胞的甘油贮液接种到5mL LB-A培养基(LB培养基，加入100μg/mL氨苄青霉素)。37℃(振摇)培养过夜。

对于各阳性克隆，使用质粒分离试剂盒(Plasmid Isolation Kit)(例如Qiagen Miniprep试剂盒)，从细菌细胞分离质粒。

用“V1-引物”和“VH-引物”作为引物，进行DNA测序。

7.生物信息学分析

用专业软件(Vector NTI10版)解释返回的序列。比对蛋白序列。对编码相同蛋白序列的克隆进行分组。

结果

CD59和D408Y间相互作用的证实

在证实ELISA中包被40μg/mL D408Y并加入2.5-40μg/mLCD59。如表1所示，对于40μg/mL CD59，观察到阳性结合信号。因此，在第一轮筛选中包被40μg/mL CD59。

表1

证实ELISA的结果

  CD59(μg/mL)  OD490  40  0.203  20  0.075  10  0.054  5  0.05  2.5  0.048  0  0.048  直接包被10μg/mLCD59  0.644

淘选：

如表2所示，在第一轮筛选中仅洗脱约4,000个噬菌体。4轮筛选之后，通过减少富集因子(enriching factor)而观察到富集效应。

表2

淘选过程的概述

注意：富集因子＝输入/输出

噬菌体ELISA

从第4次洗脱物中随机挑取40个克隆并进行噬菌体ELISA。如表3所示，鉴定了32个阳性克隆。当用CD59阳性和阴性红细胞的膜提取物作为抗原而进行噬菌体ELISA时，在CD59(-)孔中观察到读数低于CD59(+)孔，如表4所示。

表3

第1次噬菌体ELISA的结果

表4

第2次噬菌体ELISA的结果

DNA测序

对32个阳性克隆进行DNA测序，鉴定了3种独特的Fab序列(Fab-1、2和3)。对3个阴性克隆也进行测序(克隆6、9和10)并也鉴定了3种额外Fab序列(Fab-4、5，和6)。Fab 1和Fab 6含有内部“TAG”琥珀终止密码子，其导致在HB2151宿主细胞中无Fab表达。因此，仅对4种Fab(Fab 2、3、4和5)进行可溶性表达和可溶性ELISA。

表5

DNA测序的概述

其它实施方案

对所述的本发明方法和组合物的各种修改和变化对于本领域技术人员来说都是显而易见的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管结合具体所需的实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明并不仅限于这样的具体实施方案。事实上，本领域技术人员显而易见的是，对所述的进行本发明的方式的各种修改都旨在包括在本发明范围之内。

本说明书提及的所有出版物、专利申请和专利都通过引用结合到本文中，其程度如同各独立出版物被明确而具体地引用一样。