一种重组染色质修饰蛋白1A及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种重组染色质修饰蛋白1A及其编码基因和应用，所述重组染色质修饰蛋白1A包括染色质修饰蛋白1A，所述染色质修饰蛋白1A的C端连接His-Tag，N端连接PTD序列，所述PTD序列的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，所述重组染色质修饰蛋白1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明在野生型Chmp1A中引入His-tag标签，不会改变Chmp1A的结构且可以很容易地通过Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统进行纯化。在野生型Chmp1A中引入PTD序列，在PTD的引导下Chmp1A可以有效的进入肿瘤细胞，发挥Chmp1A的抗肿瘤活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种重组染色质修饰蛋白1A及 其编码基因和应用。

背景技术

(一)Chmp1A生物学特性

染色质修饰蛋白1A(Chromatin modifying protein 1A，Chmp1A)属 于ESCRT-III复合物家族成员。ESCRT-III成分及其相关蛋白统称为 Chmps，所有的Chmps蛋白有相似的结构：均编码一个大约200个氨基酸 的ORF；具有一个coiled-coil区域和ujnnnnnn电荷基团，碱性位于N-末 端，酸性位于C-末端。Chmp1A在哺乳动物中是高度保守的，开放阅读框 (ORF)全长591个核苷酸，编码197个氨基酸。Chmp1A在囊泡和多泡 体(MVB)的形成过程中起着关键作用，且与早期和晚期内体膜结构具有 直接相关性。

Stauffer等将不同种类细胞的胞质和核基质进行分离，然后通过 western blot进行分析发现，在胞质和核基质中均有Chmp1A表达，且在 核基质中出现32kD和34kD两种蛋白表达形式，而在胞质中只有32kD一 种形式，在细胞有丝分裂的各个阶段Chmp1A在胞质和核基质中浓度的比 率基本不变。但通过免疫细胞化学和共聚焦显微镜实时检测发现，在细胞 分裂早期Chmp1A主要分布于胞质，而在分裂末期主要聚集在核基质，该 现象可能由于Chmp1A有一个抗原表位通常被屏蔽，以至于抗体不能有效 识别。

有研究表明，Chmp1A可能是一种PcG蛋白，影响染色体结构和细胞 周期。PcG蛋白是一组通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子，从生化 和功能上它可以分成两个主要的核心蛋白复合体PRC1(Polycomb  repressive complex 1)和PRC2(Polycomb repressive complex 2)，生化和 遗传研究显示PcG蛋白的沉默功能是通过对染色体结构的修饰实现的。 PRC1蛋白由M33/HPC1、Bmi-1、Mel-18、HPH1、HPH2、HPH3、HPC2、 HPC3、SCMH1、RING1A和RING1B组成一个约1MDa的异质性多亚基 蛋白复合体，PRC2蛋白由ESC(Extra Sex Combs)和Ez(Enhancer of Zeste) 组成一个约600kDa核心复合体。PcG蛋白不仅控制个体正确的发育模式， 而且与细胞的增殖、分化和肿瘤发生有关。在前列腺癌、非小细胞性肺癌、 乳腺癌等多种恶性肿瘤中PcG蛋白表达均失调，且Mel-18已经被证实是 乳腺癌肿瘤抑制基因。通过酵母双杂交筛选，Chmp1A是一个与pcl(PcG 样蛋白，可与多个PcG蛋白结合)结合的蛋白，激光扫描共聚焦显示， Chmp1A并不与染色体直接作用，而是与亚核结构的外部结合，通过募集 已知的PcG蛋白Bmi-1，使组蛋白磷酸化和乙酰化，进而浓缩染色质， Chmp1A与亚核结构形成的复合物可以在一定程度上抵抗DNA酶的降解。 爪蟾胚胎注射RNA显示，Chmp1A有着与PcG蛋白M33和Bmi-1相同的 生物学效应，均能抑制En-2and Rx2A的表达，并能破坏正常前神经的生 长发育。

Chmp1A与囊泡转运有密切关系。囊泡转运在生物合成、降解和细胞 信号传导过程中起着连接细胞器和运输的作用。内体在囊泡转运过程中起 着连接高尔基体、溶酶体和细胞膜的作用。囊泡以出芽的方式从内体中释 放蛋白到细胞表面或高尔基体，囊泡内的蛋白是被降解还是参与再循环取 决于内体膜向内或向外出芽的竞争，如果内体膜向内凹陷形成MVB，MVB 会将蛋白和水解酶运送到溶酶体中。囊泡分选蛋白(Vps)作用是使羧肽 酶Y(CPY)转运到溶酶体中，E类Vps作用是使羧肽酶S(CPS)转运 到溶酶体中。研究发现，敲除Chmp1A的细胞溶酶体中未检测到CPY和 CPS，而CPY和CPS均聚集在溶酶体膜表面，细胞中重新转染Chmp1A 质粒后CPY和CPS也被导入溶酶体内部，暗示Chmp1A在囊泡转运过程 中起重要作用。

Chmp1A可调节细胞周期。超表达Chmp1A的细胞系诱导表达24小 时后，细胞分裂系数减小了十倍，能进行DNA复制的细胞比例降低了四 倍，TUNEL实验结果显示该情况并不是细胞凋亡的结果；流式细胞仪检 测发现，超表达Chmp1A的细胞系处于S期的细胞有了明显的增加(约占 总细胞的80％左右)，且大多处于S期末期。Chmp1A使细胞生长停滞于 S期和减弱细胞DNA复制活性的能力暗示其可能是潜在的肿瘤抑制因子。

Chmp1A可改变染色质结构。通过对细胞进行Hoechst 33258和 propidiumiodide染色后发现，诱导细胞高表达Chmp1A后，细胞内核酸由 点状分布变为聚集分布，表明Chmp1A可以浓缩染色质。激光扫描共聚焦 显微镜显示，Chmp1A定位于亚细胞核结构的外部，而浓缩的染色质在亚 细胞核内部，说明Chmp1A浓缩染色质的过程中并不与染色质直接作用。 染色质结构的变化必然伴随着组蛋白的修饰，用特异性抗体检测组蛋白 H3磷酸化和乙酰化水平显示，诱导细胞高表达Chmp1A后，组蛋白H3 磷酸化和乙酰化水平明显增加，说明Chmp1A是通过修饰组蛋白起到浓缩 内部染色质的作用。

(二)Chmp1A与肿瘤

前期对Chmp1A的功能性研究暗示，Chmp1A可能与ESCRT复合物 的其它成员一样，在肿瘤形成的过程中起重要作用，其可能通过控制细胞 生长和调节MVB形成过程中信号活性来影响肿瘤的发生与发展。最近， Li等首次提出Chmp1A是一个新颖的肿瘤抑制基因。研究发现，在多种 癌症病人(特别是胰腺癌)肿瘤组织中Chmp1A的mRNA和蛋白水平表 达均明显降低；敲除Chmp1A的非肿瘤细胞HEK293T，体外培养表现为 非停泊性生长，体内接种后可以促使肿瘤的形成；同样，诱导Chmp1A超 表达的肿瘤细胞PanC-1，体外试验表现为生长抑制，体内接种后可以抑制 肿瘤的形成。正常细胞和肿瘤细胞的体内外试验暗示，Chmp1A在肿瘤细 胞的形成和发展中均起到重要作用。

Chmp1A抑制肿瘤细胞生长的机制目前还不清楚，有研究认为 Chmp1A和TIF1β蛋白均有coiled-coil区域，两种蛋白可能通过该区域结 合，避免了p53泛素化，上调p53和phospho-p53两种蛋白的表达，该两 种蛋白参与了DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡及抑制血管生成 等过程，从而抑制肿瘤细胞的生长。

Li等实验室的进一步研究发现，全反式维甲酸(all-trans retinoic acid， ATRA)抑制胰腺癌也是通过Chmp1A途径。ATRA是最具生理活性的维 甲酸类药物，通过与受体RAR结合，抑制细胞增殖、诱导细胞分化和凋 亡，该特性被用于抑制多种肿瘤的侵袭和转移。CRBP-1(Cellular  retinol-binding protein I)是维甲酸生物合成和代谢的必须品，CRBP-1通 过调节维甲酸的合成控制ATRA的活性。研究表明，在乳腺癌、前列腺癌、 卵巢癌和子宫内膜癌等肿瘤中CRBP-1的表达均明显降低。ATRA、 Chmp1A和CRBP-1存在一个循环作用过程，ATRA上调Chmp1A的表达， Chmp1A又可以上调CRBP-1的表达，同时CRBP-1反过来提高ATRA的 活性，ATRA最终通过Chmp1A提高p53和phospho-p53两种蛋白的活性， 抑制肿瘤的生长。

(三)TAT蛋白转导域(PTD)

1997年，Vives等发现，TAT蛋白的47-57位氨基酸(YGRKKRRQRRR) 是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，该片段与蛋白转导功能相关，是蛋白 转导功能的最小单位，称为蛋白转导域(PTD)。TAT PTD介导的蛋白转 导过程不依赖于受体和转运蛋白，也不需要能量。一般认为这一过程与蛋 白转导域中碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的存在有关，这些氨基酸带有强 的正电荷，可能通过直接与带负电荷的细胞膜脂类相互作用而介导穿膜过 程。应用这一技术，已将相对分子质量为15000～120000的数十种融合 蛋白导人细胞内，相当于原来可通过细胞膜化合物的200倍。操作中只需 将与PTD融合的分子直接加入到组织培养介质中，15min内胞内便可达到 最大浓度，且每个细胞内的蛋白质浓度几乎相同。Wadia等认为PTD首先 与细胞膜上的脂筏结合，并通过巨噬细胞胞饮作用迅速进入细胞内部形成 巨胞饮体，随后，pH值的改变导致巨胞饮体膜稳定性降低，最终释放出 PTD。

蛋白转导域在治疗肿瘤性疾病已经有深入研究。Chauhanc和 Muthumani等报道了PTD能跨膜转运抗原蛋白并增强抗原免疫性以抑制 病毒复制及肿瘤的生长。Woo等设计的肿瘤疫苗将癌胚抗原(CEA)与PTD 相连，可诱发有效的CTL反应和INF-γ的分泌，对肿瘤动物进行疫苗接种 可显著提高存活率。脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是在人类的一种抑癌基 因，Zhao等利用HIV-TAT将外源的FHIT基因高效地导入肿瘤细胞，从 而抑制肿瘤细胞的恶性增殖。Tasciotti等将TK与TAT融合并导入细胞， 结果导致邻近不表达该酶的细胞死亡。Guelen等构建了一种新的融合蛋白 TAT-Apoptin，与细胞共培养24h后，TAT-Apoptin融合蛋白能诱导大部 分的肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无杀伤性。

发明内容

本发明提供了一种重组染色质修饰蛋白1A，解决了Chmp1A蛋白不 易分离纯化且难于导入靶细胞，导致其对抗肿瘤效果较差的问题。

一种重组染色质修饰蛋白1A，包括染色质修饰蛋白1A，所述染色质 修饰蛋白1A的C端连接His-Tag，N端连接PTD序列，所述PTD序列的 氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，所述重组染色质修饰蛋白1A的氨基酸 序列如SEQ ID NO.2所示。

所述His-Tag为多聚组氨酸标签，本发明由6个His连接组成。

本发明还提供了一种编码所述重组染色质修饰蛋白1A的基因，碱基 序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种包括所述基因的重组载体。

优选的，所述重组载体的原始载体为pPIC9K载体

本发明提供了一种包括所述基因的转化子。

优选的，所述转化子的宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)KM17。

本发明提供了所述组染色质修饰蛋白1A的制备方法，包括：

(1)提取人胎盘组织的总RNA，逆转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用碱基序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID  NO.6所示的引物P3和引物P4，进行PCR扩增；

(3)将步骤(2)的扩增产物连接于载体pGEM-T Easy中，得到质 粒pGEM-T-Chmp1A；

(4)以质粒pGEM-T-Chmp1A为模板，利用碱基序列分别如SEQ ID  NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物P1和引物P2，进行PCR扩增；

(5)步骤(4)的PCR产物回收后，经EcoR I和Not I双酶切，连接 于载体pPIC9K中，得到质粒pPIC9K-PTD-Chmp1A；

(6)将质粒pPIC9K-PTD-Chmp1A转入毕赤酵母KM17；

(7)对内含质粒pPIC9K-PTD-Chmp1A的毕赤酵母KM17进行诱导 培养，从培养基中分离纯化得到所述的组染色质修饰蛋白1A。

本发明利用毕赤酵母表达系统和His-Tag纯化技术得到的重组蛋白 PTD-Chmp1A具有天然蛋白的折叠结构，且可以高效地导入肿瘤细胞中。

本发明又提供了所述的重组染色质修饰蛋白1A在制备抗肿瘤药物中 的应用。

与现有技术相比较，本发明有益效果在于：

(1)在野生型Chmp1A中引入His-tag标签，不会改变Chmp1A的结 构且可以很容易地通过Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统进行纯化。

(2)外源性野生型Chmp1A蛋白不能进入细胞，在野生型Chmp1A 中引入PTD序列，同样不会改变Chmp1A的结构和活性，在PTD的引导 下Chmp1A可以有效的进入肿瘤细胞，发挥Chmp1A的抗肿瘤活性。

(3)利用毕赤酵母真核表达系统表达的PTD-Chmp1A蛋白具有较高 的稳定性和活性。

(4)毕赤酵母真核表达系统经诱导后，PTD-Chmp1A主要以分泌物 形式存在于酵母工程菌培养基中，PTD-Chmp1A蛋白粗制品获得容易，且 比菌体中的蛋白活性高。

(5)所用的Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统操作简单，得到的蛋白 纯度高。

(6)PTD-Chmp1A蛋白作为肿瘤治疗药物效果显著。

附图说明

图1是本发明PTD-Chmp1A蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制曲线。

图2是野生型Chmp1A蛋白和本发明PTD-Chmp1A蛋白对肿瘤细胞 迁移的抑制情况。

图3是野生型Chmp1A蛋白和本发明PTD-Chmp1A蛋白对肿瘤细胞 克隆形成的抑制情况。

图4是PTD-Chmp1A对肿瘤细胞侵袭作用的抑制情况；

A.5μg/ml PTD-Chmp1A对A498和786-0肾肿瘤细胞侵袭作用的抑制 情况；B.不同剂量PTD-Chmp1A对A498细胞侵袭作用的抑制情况。

图5是野生型Chmp1A蛋白和本发明PTD-Chmp1A蛋白对肿瘤生长 的抑制情况。

图6是野生型Chmp1A蛋白和本发明PTD-Chmp1A蛋白对肿瘤体积 的抑制曲线。

图7是野生型Chmp1A蛋白和本发明PTD-Chmp1A蛋白对肿瘤重量 的抑制情况。

图8是Chmp1A基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。

图9是PTD-Chmp1A基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。

具体实施方式

实施例1  人胎盘组织mRNA的提取

取50ug液氮中保存的人胎盘组织，用Trizol试剂盒一步法提取人胎 盘组织总RNA，并用DNase(RNase-free)处理，除去肌肉中残留的质粒 DNA。

实施例2  RT-PCR扩增人Chmp1A

取5u1人胎盘组织总RNA，利用引物oligo(dT)进行反转录，合成第一 链cDNA；以cDNA为模板，利用引物P3和P4进行PCR扩增，最后PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。

P3：5’-CGGAATTCGCCATGGACGATACCCTGTT-3’

P4：5’-TTGTCGACCGGGGCACGGC TAGTTCCTCAA-3’

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μl、10mM dNTPs 2μl、P3和P4引物 各2μl、cDNA 1μl、Taq plus DNA polymerase 2μl、ddH2O 36μl，共计50μl。

PCR反应条件：94℃45s、54℃45s、72℃1min进行30个循环，最后 72℃延伸10min。

实施例3  测序载体的构建和序列测定

用PCR产物纯化试剂盒纯化上述RT-PCR产物，利用T-A克隆策略 直接连接于pGEM-T Easy载体，连接产物转化Top10感受态细胞，在含 氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平板上进行筛选。对PCR和酶切鉴定 阳性克隆进行测序鉴定，Chmp1A测序结果及推导的氨基酸序列见图8。

实施例4  PTD-Chmp1A突变体的构建

根据克隆的Chmp1A序列，设计上下游引物P1和P2。

P1：5’-AGAATTCATGGACGATACCCTGTTCCAGTTGAAG-3’

P2：5’-ACGCGGCCGCCTAGT TCCTCAAGGC GGCCAACC-3’，

其中上游引物P1引入了PTD序列(斜体加粗)和EcoR I酶切位点 (下划线)，下游引物P2引入了His-tag标签(斜体加粗)和Not I酶切位 点(下划线)。

以pGEM-T-Chmp1A为模板，利用引物P1和P2，在94℃1min、 58℃45s、72℃1min环境下30个循环进行PCR，最后72℃延伸10min。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer，5μl；10mM dNTPs，1μl；P1，1μl； P2，1μl；模板，1μl；Taq plus DNA polymerase，1μl；ddH₂O，40μl。 PCR产物回收后，经EcoR I和Not I双酶切，酶切产物在T4 DNA连接酶 的作用下连接到酵母诱导型表达载体pPIC9K中，从而构建重组表达质粒 pPIC9K-PTD-Chmp1A，重组质粒转化TOP10感受态细胞，在含氨苄青霉 素、X-gal和IPTG的LB平板上进行筛选，PCR和酶切鉴定阳性克隆进行 测序鉴定。PTD-Chmp1A突变体的测序结果及推导的氨基酸序列见图9。

实施例5  重组质粒转化毕赤酵母感受态细胞

重组质粒鉴定正确后，取20μg质粒用Sac I酶切线性化后溶解于10μl TE溶液中，与80μl酵母感受态细胞(Pichia pastoris KM17)混匀，转至 遇冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min，按照电转参数(电压1.5kV， 电容25μF，电阻200Ω，电击时间4.00ms)电击完毕后，加入1ml冰预冷 的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中，将菌体重悬液涂布 MD平板上，28℃培养24h后将菌体用300μl DDW重悬涂布于200μg/ml  G418的抗性平板上。置于28℃培养到肉眼可见，选取酵母单菌落用煮- 冻-煮方法制备模板，用PCR法进行鉴定，确认重组菌株。

实施例6  PTD-Chmp1A突变体蛋白的诱导表达

先将转化pPIC9K-PTD-Chmp1A的毕赤酵母(Pichia pastoris)KM17 接种于YPD平板上，28℃培养2d进行活化；然后接种在50ml BMGY 培养液中，28℃250rpm/min培养至OD_600nm为2～6，室温1500×g离心 5min，弃上清后，用BMMY培养液重悬细胞至OD_600nm为1，28℃、 250rpm/min继续震荡培养4d，每24h补加5％的甲醇使终浓度为0.5％， 离心分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳进行PTD-Chmp1A表达鉴定， 结果酵母表达载体表达的PTD-Chmp1A蛋白主要以分泌物形式存在于含 pMETB-PTD-Chmp1A的毕赤酵母(Pichia pastoris)KM17的BMMY培 养基中，Bradford法测定PTD-Chmp1A在毕赤酵母KM17中的表达量为 约10～12％。

实施例7  PTD-Chmp1A突变体蛋白的纯化

甲醇诱导后的含pMETB-PTD-Chmp1A的毕赤酵母KM17，4℃， 5000×g离心10min，取上清。向表达上清溶液缓缓加入硫酸铵固体至65％ 饱和度，搅拌20min，静置30min，4℃，12000×g离心20min，沉淀用PBS 溶解，与4℃对PBS溶液透析36h，每12h更换PBS透析缓冲液，将透析 袋中的蛋白质溶液用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统进行纯化。

将蛋白质溶液与1.5ml 50％的Ni-NTA树脂浆混合，4℃温和混匀 30min，2000×g离心30s把树脂沉淀下来，用3ml Wash buffer(50mmol  NaH2PO4，300mmol NaC1，20mmol咪唑，pH 8.0)清洗3次，2000×g 离心30s，小心地弃去上清，用Elution buffer(50mmol NaH2PO4，300mmol  NaC1，250mmol咪唑，pH 8.0)洗脱3次，2000×g离心1min，上清透析 去除咪唑后即为纯化的PTD-Chmp1A蛋白。

实施例8  纯化后PTD-Chmp1A蛋白的鉴定

PTD-Chmp1A纯蛋白进行SDS-PAGE电泳后，利用Chmp1A单克隆 抗体进行Western blot检测，并通过HPLC检定纯度＞98％。

实施例9  重组基因工程酵母菌的保存与稳定性

工程菌(转化pPIC9K-PTD-Chmp1A的酵母菌KM17)加30％的甘油， -70℃保存。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种和传代10次的菌种分别 提取质粒进行序列测定。结果序列完全相同，证明本发明中的工程菌是十 分稳定的。

实施例10  PTD-Chmp1A突变体蛋白的保存与稳定性

PTD-Chmp1A纯蛋白加入磷酸缓冲液中，完全溶解后用微空滤膜过滤 除菌，分装后-20℃保存；或将纯蛋白加入辅料制成冻干粉，分装后-20℃ 保存。

实施例11  PTD-Chmp1A蛋白体外抑制肿瘤细胞的增殖

取对数生长期的肾癌细胞A549，以5000个/孔的细胞浓度接种于96 孔培养板，37℃，5％的CO₂条件下培养，24h后分成5组，分别加入终浓 度为20μg/ml PTD-Chmp1A、5μg/ml PTD-Chmp1A、1μg/ml PTD-Chmp1A、 5μg/ml野生型Chmp1A和PBS，每组做5个重复。24、48、72小时后分 别加入10μl 5mg/ml的MTT，37℃继续培养4h后弃去培养液，加入150μl 二甲基亚砜(DMSO)，15min后酶标仪上测各孔的OD490nm值。如图1 所示，与野生型Chmp1A相比，3个剂量的PTD-Chmp1A均可以明显抑 制肿瘤细胞的增殖，且呈剂量相关性；而与PBS组比较，野生型Chmp1A 没有出现明显的肿瘤细胞抑制作用。

实施例12  PTD-Chmp1A蛋白抑制肿瘤细胞的迁移

取对数生长期的肾癌细胞A549，以2×10⁵个/孔的细胞浓度接种于6 孔培养板，37℃，5％的CO₂条件下培养。A498细胞生长到融合度达到95％ 时用200μl移液枪枪头在单层细胞上成“一”字划痕，洗涤3次后加入5ml/ 孔不含小牛血清的RPMI1640培养基，并分别加入终浓度为5μg/ml  PTD-Chmp1A和5μg/ml野生型Chmp1A，观察加药后0h、24h、72h的肿 瘤细胞迁移情况，如图2所示，与野生型Chmp1A比较，PTD-Chmp1A 蛋白可以明显抑制肿瘤细胞的迁移。

实施例13  PTD-Chmp1A蛋白抑制肿瘤细胞的克隆形成能力

60mm的培养皿中接种5000个A498细胞，37℃，5％的CO₂条件下 培养。细胞生长24h后分别加入终浓度为5μg/ml PTD-Chmp1A和5μg/ml 野生型Chmp1A，加药后72h观察肿瘤细胞克隆形成情况，如图3所示， 与野生型Chmp1A比较，PTD-Chmp1A蛋白可以明显抑制肿瘤细胞的克 隆形成能力。

实施例14  PTD-Chmp1A蛋白抑制肿瘤细胞的侵袭能力

60mm的培养皿中分别接种2×10⁵个A498和786-0细胞，24h后分别 加入PTD-Chmp1A和野生型Chmp1A，37℃，5％的CO₂条件下继续培养 48h，弃上清，消化细胞，重悬于无血清的RPMI1640培养基中，调整细 胞浓度为5×10⁵个/ml。取200μl细胞悬液加入到Transwell的上室，将含 5％胎牛血清的RPMI1640加入小室下室，37℃培养24h后移去Transwells， 倒置，风干。24孔板中加入500μl含0.1％结晶紫，将小室置于其中，使 膜浸没在结晶紫中，37℃30min后取出，PBS清洗多余结晶紫，24孔板 中加入500μl 33％醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10min，充分溶解。 取出小室，24孔板于酶标仪上595nm测OD值，反应发生侵袭的细胞数。 如图4所示，PTD-Chmp1A作用于肿瘤细胞A498和786-0后显著降低了 肿瘤细胞的侵袭能力(与野生型Chmp1A比较P＜0.05)，且PTD-Chmp1A 抑制肿瘤细胞的侵袭能力呈剂量相关性，而野生型Chmp1A对肿瘤细胞的 侵袭能力影响较小(与PBS比较P＞0.05)。

实施例15  PTD-Chmp1A蛋白体内抑制肿瘤的生长

对数生长期的A498细胞经胰蛋白酶消化后用无血清的RPMI1640培 养基洗涤2次，BALB/c裸鼠前肢腋下接种A498细胞，每只接种量为 200000个细胞。接种2周后，对肿瘤分别多点注射20μg PTD-Chmp1A蛋 白、20μg野生型Chmp1A蛋白和PBS，给药容量为200μl，每周给药1次， 并在接种后第2、3、4、5周分别测量肿瘤的体积，并在第5周取出肿瘤 进行称量。如图5、图6和图7所示，注射PTD-Chmp1A蛋白后，肿瘤的 体积增长速度明显下降(在第4、5周与野生型Chmp1A比较P＜0.01)， 且在接种后第5周，肿瘤的重量明显低于注射野生型Chmp1A后的肿瘤重 量(P＜0.01)，而与PBS组比较，野生型Chmp1A对肿瘤的体积和重量未 见显著影响(P＞0.05)。