公开/公告号CN102716466A
专利类型发明专利
公开/公告日2012-10-10
原文格式PDF
申请/专利权人 江苏三仪生物工程有限公司;
申请/专利号CN201210232583.1
申请日2012-07-06
分类号A61K38/17(20060101);C07K14/74(20060101);C07K1/14(20060101);A61P37/06(20060101);
代理机构21220 大连非凡专利事务所;
代理人闪红霞
地址 116011 辽宁省大连市西岗区黄河路219号
入库时间 2023-12-18 06:42:37
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-07-27
专利权的转移 IPC(主分类):A61K38/17 登记生效日:20160706 变更前: 变更后: 申请日:20120706
专利申请权、专利权的转移
2015-07-22
授权
授权
2015-06-24
著录事项变更 IPC(主分类):A61K38/17 变更前: 变更后: 申请日:20120706
著录事项变更
2013-10-02
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K38/17 申请日:20120706
实质审查的生效
2012-10-10
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种MHCⅡ类分子的新用途,尤其是一种体外培养诱导淋巴细胞生产的MHCⅡ类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。
背景技术
免疫抑制是由于免疫系统受到损害,导致机体对抗原的应答能力下降,对疾病的敏感性增强的一种免疫异常状态,有许多疾病病原的感染可以损害动物的免疫系统,具有免疫抑制性。在动物众多的免疫抑制性疾病中,有些具有明显的临床症状,其危害性容易为人们所认识和重视;而有些却并不表现出明显的症状,但免疫抑制却使机体免疫力降低,使动物对多种外来病原微生物的免疫应答能力降低,甚至消失,显著增加了动物的发病率和治疗难度,给养殖者造成了巨大的经济损失。
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一个与机体免疫反应相关的基因群,该基因群有100多个基因位点,其编码产物包括MHCI类分子和MHCⅡ类分子,是一些能够提呈抗原的分子,在调节免疫应答和免疫细胞发育中发挥作用。MHCⅡ类分子是呈现在免疫系统特定细胞(APC)表面的由α链和β链非共价链相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白,可提呈经过加工的外来抗原给辅助性T细胞的抗原受体,导致辅助性T细胞激活和分化,从而在诱发免疫应答中起重要的作用。如在一些病毒感染的疾病中,病毒的某些蛋白就是通过干扰MHCⅡ的功能,影响了正常的免疫识别。MHCⅡ类分子在抗原提呈过程中可介导APC的多条信号转导通路、凋亡等多种生物学行为,一些在正常情况下不表达MHCⅡ类分子的细胞,在生长过程中亦可受细胞因子等诱导表达MHCⅡ类分子,因此MHCⅡ类分子的表达被看成是抗原递呈能力的标志。
细胞因子(cytokine,CK)则是一类能在细胞间传递信息的蛋白质或小分子多肽,通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部以发挥广泛多样的生物学功能。免疫活性细胞产生的具有免疫调节和效应功能的细胞因子,以其多种多样的生物学活性,在体内构成功能性细胞因子网络,彼此协作或相互制约,对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用,有助于提高MHCⅡ类分子的免疫增效作用。
由于现有MHCII类分子的提取方法存在着操作复杂、原料来源较少、得率低、成本高以及潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险,很难实现产业化,迄今为止,未发现国内外关于MHCII类分子相关产品的报道,更没有关于MHCII类分子在制备防治动物免疫抑制药物中应用的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,发现了体外培养诱导淋巴细胞而制备的MHCⅡ类分子有防治动物免疫抑制的作用,从而发明了MHCⅡ类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。
本发明的技术解决方案是:一种MHCⅡ类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。
所述MHCⅡ类分子是通过体外培养诱导淋巴细胞而制备,制备方法包括如下步骤:
a. 用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层;
b. 对淋巴细胞单层进行传代培养;
c. 当传代淋巴细胞长成单层后,用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人参皂苷、美洲商陆及肿瘤刺激剂中的至少两种丝裂原诱导培养48小时,丝裂原加入量为5~10ug/mL;
d. 将细胞培养物经超声破碎后取样检测MHCⅡ类分子的浓度。
本发明是发现了体外培养诱导淋巴细胞而制备的MHCⅡ类分子有防治动物免疫抑制的作用,从而发明了MHCⅡ类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用,按一定剂量给动物使用,可以预防和治疗动物免疫抑制疾病,具有安全、高效、反应时间短、作用时间长、用量小、无污染、无残留等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1细胞显微镜下图。
图2是本发明实施例1体外抑制病毒的实验散点图。
图3是本发明实施例2 REV病毒检测结果示意图。
图4是本发明实施例2剖检结果示意图。
图5是本发明实施例3新城疫抗体监测结果示意图。
具体实施方式
实施例1:
具体操作方法可以按以下步骤进行:
a.处理新鲜猪脾脏;
取新鲜猪脾脏,立即放入无菌烧杯中,加入平衡盐液浸泡半小时或浸于1%新洁尔灭溶液中,取出以碘酒酒精消毒脾脏表面,用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜,用平衡盐液洗涤一次,再将脾脏剪成小段移入平皿中,最后用眼科剪将脾脏剪成1mm3小块,再用平衡盐液洗涤2-3次,以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞;
b.消化及分散组织块;
将上步清洗过的平衡盐液吸掉,将剪碎的组织块移入三角烧瓶中,按组织块体积的5倍量加入0.25%胰蛋白酶液(PH7.6-7.8),置37℃水浴中消化30分钟,每隔10分钟摇动一次锥形瓶,以便组织块散开,以利继续消化,直到组织变成松散、表面发毛时为止,这时从水浴中取出锥形瓶,吸去胰蛋白酶液,再用平衡盐液洗涤3次,用0.5%水解乳蛋白-Hanks液洗,用口径稍大的吸管吹打数次,用四层纱布过滤;
c.细胞计数;
采用标有0.1mm字样的血球计数板进行计数,计数方法与白细胞计数方法相同;
d.细胞悬液的分装和培养;
按细胞计数结果,将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液,将细胞悬液分装入细胞培养瓶和细胞转瓶,分装量为该瓶容量的1/5,盖上盖,做好标识,然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养;
e.观察;
置于37℃培养的细胞,需逐日进行观察,若细胞已生长,则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段(游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰退期),直至形成淋巴细胞单层;
f.对淋巴细胞单层进行传代培养;
g.当传代淋巴细胞长成单层后,进行诱导培养;
当显微镜下观察传代淋巴细胞长成单层后,加入溶解过滤后的刀豆蛋白A(Con A)、美洲商陆(PWM)和人参皂苷(GS)诱导培养,加入量分别是刀豆蛋白A(Con A)5ug/mL、美洲商陆(PWM)2ug/mL和人参皂苷(GS)1ug/mL;
h.诱导培养48小时后对产品进行检验;
将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例1所得培养物中MHCII类分子的含量为1000~2500ng/L;
MHCII类分子的含量测定:对MHCII类分子的定量多以多肽含量定量,利用紫外分光光度计或ELISA检测试剂盒进行测定多肽含量(以多肽含量1mg为一个单位);
i.半成品和成品的检验。
半成品检验:半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测,检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。
成品检验:成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测,检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。
实验例1:体外抑制病毒实验
具体体操作方法可以按以下步骤进行:
a.鸡胚成纤维细胞的制备。
取9-11日龄的鸡胚,无菌状态下制备鸡胚成纤维细胞,铺满96孔板,待其长成单后,准备试验。
b.网状内皮组织增生症病毒(REV)复苏。
取存与-86℃冰箱中的网状内皮组织增生症病毒(REV),按常规方法复苏,病毒的TCID50为10-5。
c.不同梯度的本发明实施例1制备的MHCII类分子对网状内皮组织增生症病毒的抑制作用。
向96孔板中除了第一列空白孔各加入网状内皮组织增生症病毒50微升,再将96孔板的第一列为空白孔,加入200微升正常的培养基,第二列为对照孔,加入200微升正常的的培养基,第三列为实验一组,加入200微升含10微升本发明实施例1(含MHCII类分子的细胞培养物)的培养基,第四列为实验二组,加入200微升含20微升本发明实施例1MHCII类分子的培养基,依次类推至第十二列孔。
d.ELISA试剂盒检测。
按照网状内皮组织增生症病毒病毒(REV)的检测试剂盒说明书操作。
e.检测结果如下表及图1、图2所示。图1中A是正常鸡胚成纤维细胞,B是REV病毒作用后的细胞。
结果表明:
实施例2:
a.以动物外周血为原料,按常规方法制备淋巴细胞单层。
具体方法是:无菌静脉采取动物全血30毫升,加入抗凝剂0.3毫升,分液漏斗中静置2-3小时左右,收集红细胞层以上的血浆,分装于消毒离心管内,用平衡盐液反复洗涤2-3次,离心速度800-1400转/分,然后用含30%小牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养,均匀混合后分装于容量100毫升培养瓶或转瓶中,塞紧瓶塞,置37℃恒温箱中或转瓶机中培养,经2-3天,白细胞均匀贴壁,即制成淋巴细胞单层。
b. 对淋巴细胞单层进行传代培养
在传代培养细胞前,首先将培养瓶置于显微镜下观察,以确定已生长成单层,即可进行细胞的传代培养。
c. 当传代淋巴细胞长成单层后,进行诱导培养。
当传代淋巴细胞长成单层后,加入溶解过滤后的刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、人参皂苷(GS)进行诱导培养,加入量分别是刀豆蛋白A(Con A)3ug/mL、脂多糖(LPS)1.0ug/mL、植物血凝素(PHA)0.5ug/mL和人参皂苷(GS)0.5ug/mL。
d.诱导培养48小时后对产品进行检验;
将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例2所得培养物中MHCII类分子的含量为1000~2500ng/L。
MHCII类分子的含量、半成品和成品的检验项目均同实施例1,检验结果如下:
半成品检验:半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测,检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。
成品检验:成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测,检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。
实验例2:
具体操作方法如下:
a.网状内皮组织增生症病毒(REV)复苏。
取存与-86℃冰箱中的网状内皮组织增生症病毒(REV),按常规方法复苏,病毒的TCID50为10-5,稀释待用。
b.取1日龄雏鸡50只,平均分成五组,即攻毒组、预防组、预防+治疗组、治疗组及空白组,除空白组在隔离其外正常饲养外每组均给药,并在给药后每周采血进行ELISA检测,并在21天后剖检观察病理变化。
各组具体给药方法如下:
攻毒组:三日龄内进行攻毒,攻毒量为102TCID50/只;
预防组:三日龄内进行攻毒,攻毒量为102TCID50/只;攻毒前一天口服本发明实施例2(含MHCII类分子的细胞培养物)200uL;
预防+治疗组:三日龄内进行攻毒,攻毒量为102TCID50/只;攻毒前一天口服本发明实施例2(含MHCII类分子的细胞培养物)200 uL;攻毒后前三天每天口服本发明实施例2(含MHCII类分子的细胞培养物)200 uL;随后每个一天口服本发明实施例2(含MHCII类分子的细胞培养物)200 uL;
治疗组:三日龄内进行攻毒,攻毒量为102TCID50/只;攻毒后前三天每天口服本发明实施例2(含MHCII类分子的细胞培养物)200 uL;随后每个一天口服本发明实施例2(含MHCII类分子的细胞培养物)200 uL;
c.ELISA试剂盒检测结果如图3所示;
d.各实验组21日龄雏鸡外观状态如下表:
e.剖检结果如图4所示。
图中:从左至右依次是攻毒组(1-3、1-6)、预防组(2-5、2-10)、预防+治疗组(3-1、3-2)及治疗组(4-1、4-7)的心脏、肝脏、脾脏、法氏囊、胸腺的剖检示意图。
结果表明:剖检结果对比发现攻毒组的鸡肝脏呈土黄色变性,质脆、非常易碎,法氏囊肿,胸腺萎缩较严重。预防组脾肿大较明显,法氏囊有针尖样坏死点,肝部有条状出血。而使用MHCII分子预防及治疗后,我们发现肝脏较正常,胸腺没有明显的萎缩现象。
实施例3:
a.以动物外周血为原料,按常规方法制备淋巴细胞单层。
具体方法是:无菌静脉采取动物全血30毫升,加入抗凝剂0.3毫升,分液漏斗中静置2-3小时左右,收集红细胞层以上的血浆,分装于消毒离心管内,用平衡盐液反复洗涤2-3次,离心速度800-1400转/分,然后用含30%小牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养,均匀混合后分装于容量100毫升培养瓶或转瓶中,塞紧瓶塞,置37℃恒温箱中或转瓶机中培养,经2-3天,白细胞均匀贴壁,即制成淋巴细胞单层。
b. 对淋巴细胞单层进行传代培养
在传代培养细胞前,首先将培养瓶置于显微镜下观察,以确定已生长成单层,即可进行细胞的传代培养。
c. 当传代淋巴细胞长成单层后,进行诱导培养。
当传代淋巴细胞长成单层后,加入溶解过滤后的植物血凝素(PHA)、人参皂苷(GS)、美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂(PMA)进行诱导培养,加入量分别是植物血凝素(PHA)5ug/mL、人参皂苷(GS)2ug/mL、美洲商陆(PWM)1.5ug/mL和肿瘤刺激剂(PMA)1.5ug/mL。
d.诱导培养48小时后对产品进行检验;
将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例2所得培养物中MHCII类分子的含量为1000~2500ng/L。
MHCII类分子的含量、半成品和成品的检验项目均同实施例1,检验结果如下:
半成品检验:半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测,检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。
成品检验:成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测,检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。
实验例3:
实验操作步骤如下:
a.网状内皮组织增生症病毒(REV)复苏。
取存与-86℃冰箱中的网状内皮组织增生症病毒(REV),按常规方法复苏,病毒的TCID50为10-5,稀释待用。
b.实验组分组如下:
空白对照:正常免疫新城疫疫苗
攻毒对照:REV攻毒同时正常免疫新城疫疫苗
攻毒实验:REV攻毒同时正常免疫新城疫疫苗,前三天每天口服本发明实施例3(含MHCII类分子的细胞培养物) 100uL/只,随后每隔一天口服一次,剂量相同。
检测指标:每周检测抗体效价。
c.检测结果如图5所示:仔鸡在9日龄左右免疫的新城疫(lasota株)疫苗,首免后三周,新城疫疫苗对感染免疫抑制病病毒的鸡群作用效果远远不如空白对照组。二免后的第三周,攻毒实验组比攻毒对照组抗体明显提高,但两组均低于正常饲养的空白对照组,三免后,经过MHCII类分子治疗后,攻毒实验组比攻毒对照组和空白对照组的抗体实验组的抗体明显提高。
结果证明:通过体外培养诱导淋巴细胞生产的MHCⅡ类分子能够预防和治疗免疫抑制病毒所引起的动物免疫抑制,整体提高动物的免疫力,使疫苗发挥其应有的作用。
机译: 补体抑制分子,抗体,融合蛋白,核酸分子,载体,宿主细胞,制备补体抑制分子或其功能等同物或融合蛋白的方法,以鉴定补体抑制分子的配体或其功能等同物治疗患有补体介导的疾病或疾患的动物,或防止动物发展补体介导的疾病或疾患,为动物接种疫苗以抵抗传播的疾病或疾患。通过节血节肢动物并抑制非人类细胞,组织或生物体中的经典和替代补体途径,组成,补体抑制分子,融合蛋白或核酸分子的用途
机译: 农药化合物'-3-1-芳基亚氨基吡唑,其制备方法,在不应用于人类或动物的地方防治病虫害的方法,该化合物在制备药物以及农药和杀虫剂组合物中的用途包括
机译: 分离的分子结构,包膜和合并病毒,疫苗制剂,抗体单克隆抗体,多克隆抗血清,果冻,泡沫,避孕霜或软膏,哺乳动物和人类血液样本,试剂盒,细胞系,治疗过程或预防对象被病毒感染,治疗或预防人类感染的感染,抑制血液样本中的病毒感染,抑制人类血液样本中的HIV感染,对外科工具或牙科工具进行去污,监控抗体产物的分子结构,用于疫苗中的用于治疗或预防病毒感染的免疫原,以及用于疫苗中的用于治疗或预防HIV感染的免疫原的生产,交联结构,针对该结构的单克隆抗体,外科手术的净化或牙科工具,用于疫苗效力的分子结构的专业选择过程,哺乳动物,分离的蛋白复合物,解体素制剂,p