一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法

摘要

本发明涉及一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，首先，将绿色荧光蛋白(GFP)与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因置于另一T-DNA载体，携带标记基因载体的农杆菌菌株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织，利用特异引物对目的基因载体的抗病基因进行PCR检测，筛选获得共转化植株(T0)。然后，在共转化植株的分离世代(T1或T2)，借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。本发明可以应用于水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的无选择标记转基因育种，提高水稻抗病能力或改良其它农艺性状。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻的转基因技术，尤其是一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转 基因后代的方法。

背景技术

培育抗病品种是农作物育种的主要目标之一。转基因技术作为传统育种方法的重要补充， 可以避开杂交及多代选择等繁琐过程，将已经从植物基因组克隆的抗病基因转化感病品种， 利用较短的时间改良受体品种的抗病性。在水稻抗病基因的育种应用方面，随着水稻基因组 学和图位克隆技术的完善，一系列水稻抗病基因被陆续分离和研究，为转基因水稻研究提供 了丰富的基因资源。

通过转基因技术培育抗病品种还依赖于高效的无选择标记转化体系。双菌株(双载体)共 转化作为一种常用的无选择标记转化方法，具有载体简单和易于构建等优点。与“双T-DNA 载体”共转化方法相比较，后者虽然只用单个转化载体，但是单个载体同时含有2个T-DNA 区，使得载体构建相对困难一些。如果转化的目的基因为序列较长的水稻NBS-LRR类抗病基 因(例如水稻抗稻瘟病基因Pi9)，构建双T-DNA载体的难度会更大。

另一方面，现有关于双菌株共转化的研究表明，标记基因载体和目的基因载体发生共转 化的频率变化较大，主要受植物材料生理状态和农杆菌转化条件等影响。在转基因分离世代 (T1或T2)，需要分别从大量水稻植株提取DNA和进行标记基因及目的基因的PCR检测。此外， 在大约50%共转化植株的基因组中，标记基因和目的基因的T-DNA发生连锁，难于从其后代 群体筛选获得分离的无选择标记转基因个体。所以，双菌株共转化后代群体的分析工作非常 繁重，亟需提高其无选择标记转基因个体的筛选效率，以便在高效、安全的转基因技术基础 上，培育合乎育种目标的农作物新种质。

2004年，Kolesnik等在水稻中进行转座因子标签研究，把绿色荧光蛋白(GFP)用作负选 择标记，筛除带T-DNA(同时含GFP、HPT标记基因和Ac/Ds转座元件)的水稻分离个体。2005 年，Chen等利用一个双T-DNA载体转化烟草，其中标记基因的T-DNA带有GFP和卡那霉素抗 性选择标记(NPTII)，目的基因的T-DNA仅含GUS报告基因。通过GFP荧光检测筛除GFP阳性 的T1植株，再从GFP阴性植株筛选GUS阳性个体，获得了不含NPTII标记的转GUS基因烟草。

本发明向双菌株共转化载体系统引入了GFP荧光标记。将GFP与潮霉素磷酸转移酶(HPT) 克隆于标记基因载体，目的基因(即水稻抗稻瘟病基因Pi9)置于另一T-DNA载体，通过双菌 株方法获得共转化植株。在分离世代(T1或T2)筛除GFP阳性的标记基因植株，然后对GFP阴 性植株进行Pi9基因的PCR检测，从而获得转Pi9的无选择标记个体。并借助于台灯式荧光 检测器，大量、快速地筛除GFP阳性个体，减少后续鉴定Pi9基因的工作量，以提高无选择 标记植株的筛选效率。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种筛选效率高的转化水稻抗病基因并获得无 选择标记转基因后代的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：首先，将绿色荧光蛋白(GFP)与潮霉素磷酸转移 酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因置于另一T-DNA载体，携带标记基因载体的农杆菌菌 株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织，利用特异引物对目的基因载 体的抗病基因进行PCR检测，筛选获得共转化植株(T0)。然后，在共转化植株的分离世代(T1 或T2)，借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP 阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。由于受体水稻 的基因组存在与被转化抗病基因同源的序列，所以根据目的基因载体的抗病基因序列及其两 侧T-DNA序列，设计了多套PCR引物，分别在T-DNA边界序列与抗病基因上游或下游序列之 间进行扩增，对目的基因进行有效检测。

发明有益的效果是：本发明向双菌株共转化载体系统引入了GFP荧光标记将GFP与潮 霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，并借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除 GFP阳性个体，减少后续鉴定Pi9基因的工作量，以提高无选择标记植株的筛选效率，可以 应用于水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的无选择标记转基因育种，提高水稻抗病能力或改 良其它农艺性状。

附图说明

图1：双菌株共转化的载体系统及共转化水稻植株的筛选策略

Pi9，水稻Pi9抗稻瘟病基因；GFP，绿色荧光蛋白；HPT，潮霉素磷酸转移酶；LB和 RB，T-DNA左边界和右边界序列；

图2：从共培养的水稻愈伤组织产生的绿色荧光转化细胞团

A：经过3d农杆菌共培养和10~15d潮霉素培养基上的选择培养，在灯式荧光检测器下 多个愈伤组织产生GPT+转化细胞团；B：从单个愈伤组织产生的GFP+转化细胞团；

图3：共转化水稻植株中Pi9抗稻瘟病基因的PCR检测

A：pLJ42载体T-DNA区的DNA序列以及Pi9基因的PCR引物。RB和LB序列用黑体 字母表示，RB和LB附近序列的特异引物(RB-1、RB-2、LB-1和LB-2)的同源序列用下划线 表示，Pi9两侧的SalI酶切位点用斜体字母表示。Pi9-1、Pi9-2和Pi9-3，Pi9基因的特异引物。 引物的扩增方向用箭头表示。B和C：分别为RB-1和Pi9-1引物的PCR(Pi9/RB-PCR)、以及 LB-1和Pi9-2引物的PCR(Pi9/LB-PCR)。M，DNA分子量标准；1，负对照(水)；2，正对照 (pLJ42质粒)；3，负对照(未转化水稻)；4-11，日本晴的8个独立转化植株(T0)。D：空育131、 浙11B、粤泰B和浙恢414的T0植株的Pi9/RB-PCR和Pi9/LB-PCR分析。M，DNA分子量 标准；1-2(空育131)；3-6(浙11B)；7(粤泰B)；8-12(浙恢414)；

图4浙粳22T1代植株Pi9、HPT和GFP基因的PCR分析

浙粳22：水稻转化受体；WX207和WX208：独立转化的共转化水稻株系；Pi9+HPT-GFP-： 转Pi9的无选择标记T1代植株；

图5浙恢414和浙粳22的共转化T1代植株稻瘟菌接种鉴定

A：菲律宾稻瘟病菌系PO6-6的接种结果，无选择标记的Pi9基因植株表现抗病，而转 化受体浙恢414和不含Pi9的T1植株均表现感病；B：浙江省12个稻瘟病菌系(B1、B15、 C13、D1-1、D1-2、D3-1、D3-2、D3-3、D7-1、D7-2、E1和E3)混合孢子的接种结果，转Pi9 基因的无选择标记植株表现抗病，而浙粳22和不含Pi9的T1植株表现感病。原丰早、Co39 和丽江黑谷：感病品种；浙恢414和浙粳22：水稻转化受体；75-1-127：含Pi9抗稻瘟病基 因的水稻品系；WX409：浙恢414的1个共转化株系；WX207：浙粳22的1个共转化株系。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

实施例：以转化水稻广谱抗稻瘟病基因Pi9为例，通过改进的双菌株(双载体)共转化系统， 创制转抗病基因的无选择标记水稻种质材料。

载体构建：共转化载体系统包括标记基因载体(pRB01)和目的基因载体(pLJ42)，如图1。 将玉米泛素启动子Ubi控制的绿色荧光蛋白(GFP)基因克隆到农杆菌转化载体 pCAMBIA1300(Genbank AF234296)的HindIII和EcoRI酶切位点，产生标记基因载体pRB01， pRB01还携带由花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子控制的潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)。HPT 作为潮霉素抗性选择标记，用于筛选水稻转化细胞，GFP基因作为可视遗传标记，用于跟踪 携带pRB01T-DNA的水稻转化细胞、组织和植株，以提高筛选效率。与此同时，将 pCAMBIA0380载体(Genbank AF234290)T-DNA区的Nos-polyA序列去除，获得T-DNA区不 含任何基因的衍生载体pZJ06，然后将水稻广谱抗稻瘟病基因Pi9的基因组片段(13.5kb)克隆 到pZJ06载体(其T-DNA区不含任何基因)的SalI位点，产生目的基因载体pLJ42。通过电激 法将pBR01和pLJ42分别转化农杆菌EHA105菌系。每个载体随机取1个农杆菌转化子，提 取质粒DNA并转化大肠杆菌DH5α菌株，在转化平板上随机选取8-10个转化菌落，扩大培 养，提取质粒并进行酶切鉴定，酶切结果与原pBR01或pLJ42载体的酶切带型一致的农杆菌 转化子用于水稻转化。

水稻愈伤组织的诱导培养：水稻受体品种(系)6个，其中浙恢414、浙粳22、浙11B、日 本晴和空育131为粳稻(Oryza sativa L.subsp.japonica)，粤泰B为籼稻(Oryza sativa L.subsp. indica)。取水稻成熟种子去壳，70%酒精浸泡2min，次氯酸钠溶液(有效氯5%以上)浸泡2次， 每次20min，无菌水冲洗5次。然后在NB培养基(N6大量元素，B5微量元素和维生素，2mg/L 2,4-D)上培养4-5周。培养室光温条件为26℃，光照12h，黑暗12h。将诱导的胚性愈伤组 织转移到新鲜NB培养基，继代培养10d。

农杆菌培养：取转化载体pRB01和pLJ42的农杆菌单菌落，在含50mg/L卡那霉素的 YEP液体培养基中单独培养(28℃，200r/min，1-2d)。在菌液OD600值达到1.4~1.8时，向 OD值较高的菌液加YEP，直到被稀释菌液与另一菌液的的OD值相等。然后将上述相同细 胞浓度的pRB01菌液和pLJ42菌液按1：4体积混合。离心收集菌体，并悬浮于含有200mM 乙酰丁香酮(acetosyringone，Sigma)的AAM培养液。用AAM将混合菌液的OD600值调到0.7 左右，用于侵染水稻愈伤组织。

水稻转化：如上所述，从各个水稻品种(系)的种子成熟胚诱导愈伤组织。携带目的基因 载体pLJ42的农杆菌与携带标记基因载体pRB01的农杆菌按4:1比例混合，每个水稻品种(系) 取100~300块愈伤组织，在10ml农杆菌混合液中浸泡10min。吸去菌液，将愈伤组织转移 到灭菌滤纸上，超净工作台上干燥15min。再将愈伤组织转移到表面覆盖有无菌滤纸的共培 养培养基，20℃黑暗条件下培养3d。经过共培养的愈伤组织，先用无菌水洗4-5次，再用含 300mg/L羧苄青霉素的无菌水溶液洗1-2次，30min。用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水份，将 愈伤组织转移到选择培养基(NB，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素)。经过15~20d的第 一次选择培养，在灯式荧光检测器下，愈伤组织的表面长出绿色荧光转化细胞团(图2)。然后 筛选表达GFP绿色荧光的转化愈伤组织，并转移到新鲜的选择培养基，进行第二次选择培养 (持续15-20d)。GFP阳性愈伤组织在分化培养基(NB，3mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA)上培养25~30 d，待分化苗长到4cm左右时转移到生根培养基(1/2NB，无激素)诱导生根。

转化水稻愈伤组织及植株(T0)的GFP荧光检测：对于体积较大的转化愈伤组织，在台灯 式荧光检测器(modular fluorescence desk lamp detector，匈牙利BLS公司)下直接观察培养皿中 转化愈伤组织表达的绿色荧光。GFP激发光源为FHS/LS-1B(460-495nm)，滤光片为 FHS/EF-2G2(505-515nm)。对于体积较小的转化细胞团，在徕卡荧光体视显微镜(Leica M165FC)下观察GFP荧光。转化植株GFP荧光通过台灯式检测器进行检测。

目的基因的PCR检测及共转化水稻植株的筛选：转化植株(T0)表达HPT酶和GFP荧光 蛋白，表现潮霉素抗性，并且通过绿色荧光检测获得确认。再从GFP阳性的T0植株取叶组 织，提取水稻基因组DNA，利用目的基因(水稻抗稻瘟病基因Pi9)的特异引物进行PCR分析， 筛选含Pi9的共转化水稻植株(Pi9+HPT+GFP+)，如图1。由于受体水稻的基因组存在与Pi9 抗稻瘟病基因同源的序列，所以根据目的基因载体抗病基因序列及其两侧的T-DNA序列，设 计了多套PCR引物(图3A；表1)，分别在T-DNA边界序列与抗病基因上游或下游序列之间 进行扩增(图3B、3C和3D)，从而对目的基因进行有效检测：Pi9上游序列的扩增，采用T-DNA 右边界(RB)附近载体序列的同源引物RB-1(5'-CGCTCTTTTCTTAGGTTTACC-3')和Pi9基因 5'序列的同源引物Pi9-1(5'-AACCGTAAGTAGTATAGCATAGCT-3')，或采用 RB-2(5'-ATATCCTGTCAAACACTGATAGT-3')和Pi9-1。Pi9下游序列的扩增，采用Pi9基因 3'序列的同源引物Pi9-2(5'-TCTTTGGACATATGCATGGACC-3')和T-DNA左边界(LB)附近载 体序列的同源引物LB-1(5'-GTAAACAAATTGACGCTTAGACAAC-3')，或采用 Pi9-3(5'-TGTATATTCTGGCCTTGTTTAGTT-3′)和 LB-2(5'-ATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGA-3′)。检测Pi9的PCR反应条件：94℃，3min； 94℃，30s；62℃，30s；72℃，1min；32个循环；72℃，5min。对于高GC含量的Pi9下 游序列，使用2×GC PCR缓冲液(TAKARA公司)。PCR反应使用rTaq DNA聚合酶(TAKARA 公司)。

转Pi9抗病基因无选择标记后代植株的筛选：从共转化植株(T0)收获T1代种子，发芽后 在台灯式荧光检测器下检测绿色荧光，区分GFP阳性(GFP+)和阴性(GFP-)植株，然后弃除 GFP阳性的标记基因植株。再按照以上关于目的基因(Pi9)的PCR检测方法，从GFP-植株群 体筛选带目的基因的无选择标记植株(表2)。同时利用HPT和GFP的特异引物，对无选择标 记后代以及其它T1植株进行检测，进一步确认无选择标记植株(Pi9+HPT-GFP-)(图4)；T2代 无选择标记转基因植株的筛选方法与T1代相似：从T1代Pi9+GFP+植株收获T2种子，对 T2植株进行绿色荧光检测，进而对GFP-植株进行Pi9基因的PCR检测，筛选无选择标记的 Pi9基因植株(表3)。

T1代水稻植株的稻瘟病抗性鉴定：采用孢子悬浮液喷雾法向转Pi9基因无选择标记水稻 植株接种稻瘟病菌系PO6-6(图5A)。对于转化受体为浙粳22的WX207株系(T1)，利用12个 稻瘟病菌系(B1、B15、C13、D1-1、D1-2、D3-1、D3-2、D3-3、D7-1、D7-2、E1和E3)的混 合孢子接种(图5B)。稻瘟病接种方法：水稻种子去壳，表面灭菌，在1/2MS无激素培养基上 发芽和生长3-5d，移栽到灭菌的水稻土。水稻幼苗在人工气候箱内生长12-14d。生长条件 为：光照培养12h(温度28℃,相对湿度80％)，黑暗培养12h(温度20℃,相对湿度60％)。同 时在种子发芽的当天开始培养稻瘟菌，将-20℃保存的带稻瘟菌孢子的滤纸片接种到燕麦培养 基(24g/L燕麦片，12g/L琼脂，100mg/L羧苄青霉素)，27℃暗培养5d，然后相同温度下连 续光照培养5-7d。稻瘟菌培养物用含0.02%Tween 20的灭菌水冲洗，收集孢子悬浮液，并经 过Miracloth微孔滤膜过滤。接种前将孢子浓度调节到5×105spores/ml。采用喷雾法向水稻 幼苗接种稻瘟菌孢子，接种水稻苗在25-26℃暗培养24h，然后转移至人工气候箱中培养6-7 d，考察稻瘟病发病情况。

表1利用Pi9和T-DNA特异引物检测共转化T₀水稻植株

^*Pi9/RB-PCR：利用Pi9-1、RB-1和RB-2引物

Pi9/RB-PCR：primers Pi9-1,RB-1and RB-2were used

^**Pi9/LB-PCR：利用Pi9-2、Pi9-3、LB-1和LB-2引物

Pi9/LB-PCR：primers Pi9-2,Pi9-3,LB-1and LB-2were used

表2转Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记T₁代植株的筛选

表3转Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记T₂代植株的筛选

^＊来源于WX409转基因系的1个Pi9⁺GFP⁺HPT⁺ T₁植株

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技 术方案，均落在本发明要求的保护范围。