利用OsPDCD5作为选择标记与目的基因共转化法构建无标记转基因水稻

摘要

水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，保障水稻生产对确保我国粮食安全和农业可持续发展有十分重要的战略意义。发现和克隆水稻中具有重要功能性状的基因，并通过转基因等分子育种途径应用这些基因，可加速水稻育种进程，取得水稻育种和生产的新突破。OsPDCD5和LRK1基因是复旦大学遗传与育种实验室在水稻中定位克隆的两个基因。OsPDCD5是一程序性死亡基因，在表达载体pCAMIBIA1304（简称pC1304）中插入OsPDCD5，并用Oshsp16.9启动子代替CaMV35S启动子，获得热激程序死亡基因的表达载体pC1304-Oshsp16.9-OsPDCD5，利用该载体与目的基因共转化后重组，在42℃热激处理下含有选择标记OsPDCD5的植株发生萎蔫、死亡，可获得无标记的转目的基因水稻。将OsPDCD5的反义序列anti-OsPDCD5转入水稻，可提高水稻耐盐性。LRK1是富亮氨酸重复类受体蛋白激酶基因，转LRK1基因水稻的露白要比非转化的早，最终获得的植株分蘖数、每穗粒数和千粒重均有所增加。本试验利用基因枪法，将构建的表达载体pC1304-Oshsp16.9-OsPDCD5分别与目的基因anti-OsPDCD5、LRK1共转化籼稻品种9311，经抗性筛选和转基因鉴定，获得转anti-OsPDCD5阳性植株5株，转LRK1阳性植株8株。阳性植株自交分离的T1代在42℃下热激处理，最终获得无选择标记的转anti-OsPDCD5水稻植株2株，转LRK1水稻植株3株。实验结果证实了利用表达载体pC1304-Oshsp16.9-OsPDCD5可快速删除选择标记，获得的转基因植株可用于进一步研究anti-OsPDCD5和LRK1基因的功能，为促进这2个基因的应用奠定基础。

目录

声明

摘要

1 引言

2 文献综述

2．1 转基因植物中的选择性标记基因

2．1．1 传统选择性标记

2．1．2 安全标记基因

2．1．3 标记基因的去除

2．2 pCAMIBIA1304-Ohsp16．9-OsPDCD5与水稻程序死亡

2．2．1 程序性死亡

2．2．2 pCAMIBIA1304-Ohsp16．9-OsPDCD5

2．3 水稻耐盐的研究

2．3．1 水稻耐盐QTLs

2．3．2 anti-OsPDCD5基因提高水稻耐盐性

2．4 富亮氨酸重复类受体蛋白激酶基因LRK的研究

2．4．1 LRK的组成结构与特征

2．4．2 LRK基因的生物学功能

2．4．3 LRK1基因潜在的增产价值

3 材料和方法

3．1 材料用品

3．1．1 水稻转化受体

3．1．2 载体与菌株

3．1．3 主要试剂

3．1．4 组织培养基

3．1．5 仪器与设备

3．1．6 分析软件

3．2 试验方法

3．2．1 pC1304-anti-OsPDCD5表达载体构建

3．2．2 水稻愈伤组织的诱导与处理

3．2．3 基因枪转化目的基因

3．2．4 热激转化植株

4 结果与分析

4．1 共转化的目的DNA获得

4．1．1 获得表达载体pCAMIBIA1304-anti-OsPDCD5

4．1．2 获得转化植株的外源DNA片段

4．2 水稻的转化结果

4．2．1 愈伤组织的培养及转化后再生

4．2．2 T0代转化植株的PCR检测结果

4．3 热激阳性植株的反应

5 小结与讨论

5．1 水稻愈伤组织的培养效率

5．2 高浓度潮霉素抑制分化

5．3 共转化效率的选取

5．4 热激程序死亡表达载体pC1304-Oshsp16．9-OsPDCD5的利用优势

参考文献

致谢