一株高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的菌株及其应用

摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及高产薯蓣皂苷元菌株的筛选及其在黄姜皂苷转化中的应用。本发明筛选到了一株高产薯蓣皂苷元的层出镰孢（

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12及利用该菌高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法。

背景技术

薯蓣皂苷元是生产甾体激素类药物的重要基础原料。甾体激素具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，是治疗风湿、心血管、淋巴白血病、细胞性脑炎、皮肤病、抗肿瘤和抢救危重病人的重要用药，是仅次于抗生素的第二大类药物。目前大概有超过一千种甾体激素类药物是由薯蓣皂苷元合成或者半合成的，中国是薯蓣皂苷元最重要的生产国之一。薯蓣皂苷元通常是用酸解的方法从黄姜（盾叶薯蓣）中提取出来，但是这种方法带来了非常严重的环境污染，用微生物转化法结合酶解法生产薯蓣皂苷元被普遍认为是未来薯蓣皂苷元生产的趋势，成为当前清洁生产领域中的热点之一。

很多研究者已经发现木霉属和曲霉属的一些微生物能将黄姜中的皂苷转化为薯蓣皂苷元，虽然生物转化法条件温和，环境友好，但是这些微生物的转化效率低，副产物多，并不能真正的进入工业生产。由于黄姜中的皂苷成分复杂，而且多数是脂溶性化合物，水溶性很低，因此转化过程中底物投料浓度和转化效率都非常低，这些问题都是薯蓣皂苷元用生物转化法生产中的难题。因此筛选一株高效转化生产薯蓣皂苷元的微生物具有非常重要的意义，而目前关于层出镰孢用于转化生产薯蓣皂苷元的研究未见报道，其生产薯蓣皂苷元的高收率更是工业生产的一大优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高效转化生产薯蓣皂苷元的层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12，以及利用该菌株转化生产薯蓣皂苷元的方法，可达到高产物得率的要求。

本发明的发明人从实验室保存的真菌中筛选到一株转化生产薯蓣皂苷元的微生物，该菌于2012年3月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5901。

应用上述微生物转化黄姜中的皂苷生产薯蓣皂苷元的方法，其步骤如下：

（1）采用保藏号为CGMCC No.5901的层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到查氏培养基上。

（2）制备层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株的细胞液体培养物：挑取步骤（1）的查氏固体培养基上的层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株一环，接种于已灭菌的装有20-60 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以120-220 r/min的转速培养22-26 h至对数生长中期，即得到层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株的细胞液体培养物。

（3）发酵培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量为500 mL锥形瓶中装50-100 mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。

（4）生物转化：精确称取适量黄姜皂苷，投入步骤（3）中的菌体发酵液，使其终浓度为3-5 g/L，在转化温度30℃，200-220 r/min的转速下转化144-168 h，即得转化液。

（5）产物检测：将步骤（4）的转化液在8000-12000 r/min下离心5-10 min，沉淀用与转化液同体积的60 ℃-90℃石油醚抽提2次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析薯蓣皂苷元的含量。

其中步骤（1）中所述的PDA培养基的成分及配比为：蔗糖30 g/L，硝酸钠 3 g/L，磷酸氢二钾 1 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，水1000 mL，自然pH。在121℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤（2）所述种子培养基的成分及配比为：蔗糖20 g/L，硫酸铵2 g/L，硝酸钠 2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾 1 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，水1000 mL，自然pH，在121℃高压蒸汽下灭菌20 min；步骤（3）所述发酵培养基的成分及配比为：蔗糖20 g/L，硫酸铵2 g/L，硝酸钠 2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾 1 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，黄姜皂苷3 g/L，，水1000 mL，自然pH，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。

    本发明所述的层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株首次发现可转化生成薯蓣皂苷元，并且能达到高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。 

具体实施方式

实施例1 酶解法得到黄姜皂苷。

称取100 g干黄姜粉，加入2000 mL水中，煮沸1 h，冷却，调整pH为6.5，加入中温淀粉酶0.4 mL，65 ℃温育1 h。冷却后调整pH为6.0，加入耐高温淀粉酶0.4 mL，80 ℃温育1 h。冷却，调整pH为5.5，加入液体糖化酶1 mL，60 ℃温育8 h。冷却，4000 rpm离心20 min，取沉淀，60℃烘干至恒重，称重。

实施例2 利用层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12转化产生薯蓣皂苷元。

（1）制备层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株的细胞液体培养物。

挑取固体查氏培养基上的层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株一环，接种在装有30 mL 种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数期，即制得层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株的细胞液体培养物。

（2）发酵培养基的成分及配比为：蔗糖20 g/L，硫酸铵2 g/L，硝酸钠 2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾 1 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，水1000 mL ，pH 自然，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。

（3）摇瓶发酵：将上述层出镰孢（Fusarium proliferatum）WX12菌株的细胞液体培养物以4-8%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在30-40℃条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，发酵20-24 h，菌体进入对数中后期。

（4）生物转化：精确称取适量黄姜皂苷，投入步骤（3）中的菌体发酵液，使黄姜皂苷终浓度为5 g/L，在转化温度30℃，200-220 r/min的转速下转化144-168 h。

实施例3 石油醚提取转化产生的薯蓣皂苷元。

8000-12000 r/min离心转化液10 min，取沉淀，加入石油醚（沸点60 ℃～90 ℃）20 mL超声提取两次，每次4 h，合并提取液，80 ℃浓缩至15 mL左右。所得即是薯蓣皂苷元的石油醚溶液，其薯蓣皂苷元的浓度约为0.25 mg/mL，纯度>40%。