红藤活性部位、在制备抗炎免疫和抗衰老药物中的应用

摘要

本发明红藤活性部位、在制备抗炎免疫和抗衰老药物中的应用，属于医药技术领域。本发明中红藤用水回流提取，经乙醇沉淀得红藤多糖和水溶性部位。红藤50%-80%乙醇回流提取液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分级萃取，制得石油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，剩余水相经大孔吸附树脂HP-20处理，得水溶性部位。经药效学实验研究表明，四个部位对二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足肿胀具有显著的抑制作用，并且能够降低足跖炎症组织中MDA和PGE2含量。上述四种部位具有较好的体外抗氧化活性，能够有效降低血清和肝脏组织中MDA含量，增强SOD活性。因此可以用于制备抗炎免疫药物和抗衰老药物。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及从中药材红藤中制备具有抗炎免疫活性和抗衰老活性的部位，及在制备抗炎免疫药物和抗衰老药物方面的应用。 

背景技术

红藤为大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.et Wils.的藤茎。具有解毒消痈、活血止痛、祛风除湿等功效，临床上单独或组方用以治疗跌打损伤、风湿性关节炎等病症。近年来研究发现，红藤主要含有酚类、有机酸、木脂素、三萜皂苷、黄酮、蒽醌等化学成分。现代药理学研究表明红藤提取物或化合物具有保护心血管系统、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等生物活性。 

红藤水煎剂在小鼠模型中表现出免疫抑制作用，能够降低小鼠的吞噬指数、IgM生成量、外周血T淋巴细胞数目和T、B淋巴细胞转化率，对小鼠的T淋巴细胞介导的细胞免疫和B淋巴细胞介导的体液免疫均具有抑制作用(李莉，等.中国免疫学杂志.2009,25(3),223-224)。红藤水煎液明显降低大鼠滑膜基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达(付钰，等.贵州医药.2009,33(12),1097-1099)。红藤中的两种酚性糖苷有明显抑制绵羊生殖腺前列腺素合成酶的活性，并且具有明显的抗炎活性(Sakakibara I,et al.,JP 06199885.)。 

红藤作为一种常用中药，无明显毒副作用，临床使用安全，适于做进一步的研究开发。目前该药材在抗炎免疫方面的研究以药材水煎剂和个别化合物为主，尚无红藤提取物进一步精制至活性部位并用于制备抗炎免疫药物的报道。红藤提取物和活性部位在抗衰老方面的研究和应用也未见报道。 

为了测试和评估本发明红藤活性部位的抗炎免疫活性和抗衰老方面的应用潜力，已使用本领域技术人员所熟知的方法测试药材各部位的生物活性。这些已知的测试方法包括二甲苯致小鼠耳肿胀测试法、角叉菜胶致大鼠足肿胀测试法，以及体内外抗氧化模型等，结果表明选定的红藤活性部位具有较好的抗炎免疫活性，在体内外抗氧化模型中都有较好活性，表现出良好的抗衰老应用潜力。 

发明内容

本发明的目的是提供红藤具有抗炎免疫活性和抗衰老应用潜力的有效部位。 

红藤提取物的各部位经过广泛的抗炎活性筛选，确认红藤多糖、水溶性部位W₁和红藤50%-80%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位和水溶性部位W₂具有显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足肿胀作用，显示出良好的抗炎免疫活性，并且在清除DPPH·自由基和 还原力实验中表现出较好的体外抗氧化活性，能够显著降低血清和肝脏组织中丙二醛(MDA)含量，并且增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，表明红藤的提取物具有良好的体内外抗氧化作用，具有抗衰老的潜力。 

因此，本发明的第一个方面涉及提供红藤四种活性部位及其制备方法： 

红藤多糖(HT_PS)及水溶性部位W₁(HT_W1)的制备方法，按照下述步骤进行：干燥红藤药材，粉碎至20目粗粉，粉末在100℃下用水回流提取两次，每次3小时，提取液减压浓缩后，加无水乙醇，4℃-20℃下过夜沉淀，优选5-15℃；3000r/min离心10-30min，优选15-20min；干燥沉淀部分得红藤多糖(HT_PS)；浓缩上清液至原体积的1/30-1/5，优选浓缩至原体积的1/20-1/10；过HP-20大孔吸附树脂，先用水洗至近无色，再用2BV-10BV 80%(v/v)乙醇洗脱，优选4BV-6BV；流速为10-60mL/min，优选20-30mL/min；收集80%乙醇(v/v)洗脱液，浓缩，冷冻干燥得水溶性部位W₁(HT_W1)。 

红藤乙酸乙酯部位(HT_AE)和水溶性部位W₂(HT_W2)的制备方法，按照下述步骤进行：红藤药材粉末中加入8-12倍的50%-80%乙醇回流提取，并过滤回收乙醇。红藤乙醇提取物用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分级萃取，减压浓缩回收溶剂，分别得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位(HT_AE)、水部位。水部位浓缩至原体积的1/30-1/10，优选浓缩至原体积的1/20-1/15；过HP-20大孔吸附树脂，先用水洗至近无色，再用2BV-10BV 95%(v/v)乙醇洗脱，优选4BV-6BV；流速为10-60mL/min，优选20-30mL/min；收集95%乙醇洗脱液，浓缩得水溶性部位W₂(HT_W2)。 

本发明第二个方面涉及对所述四个部位用于制备抗炎免疫和抗衰老药物的用途。分别观察样品在不同剂量下对二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀度、角叉菜胶致大鼠足跖炎性组织中前列腺素(PGE₂)和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明红藤的四个活性部位均具有显著的抗炎免疫活性，可用于制备治疗炎性病症如风湿或类风湿性关节炎等疾病的药物。同时在体外模型中具有显著的抗氧化活性，并能够显著降低血清和肝脏组织中MDA含量，并且增加SOD活性，表明红藤活性部位在制备抗衰老药物方面具有良好的潜力。 

本发明第三个方面涉及提供红藤活性部位与药学上可接受的辅料组成的药物组合物。 

红藤活性部位可单独或几种部位组合，再进一步与辅料组合，剂型包括：片剂、胶囊、膏剂、贴剂、注射剂等。 

本发明所述的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如填充剂、粘合剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、着色剂等。 

下面的实施例和生物活性实验是对本发明的进一步详细说明，以下所列举的实施例不以 任何方式构成限制。 

具体实施方式

实施例1 

红藤多糖(HT_PS)及水溶性部位W₁(HT_W1)的制备： 

取70g粉碎成20目左右的干燥红藤茎，100℃下用8倍量纯净水回流提取两次，每次3小时，合并提取液减压浓缩至200mL，加无水乙醇至1000mL，置4℃冰箱中过夜沉淀，离心，干燥沉淀得HT_PS2.8g；浓缩上清液，过HP-20大孔吸附树脂，先用水洗至无糖类物质，再用80%乙醇洗至澄清，收集80%乙醇洗脱液浓缩，冷冻干燥得HT_W13.4g。 

实施例2 

乙酸乙酯部位(HT_AE)和水溶性部位W₂(HT_W2)的制备： 

取80g粉碎成20目左右的干燥红藤茎，10倍量80%乙醇在85℃下水浴回流提取两次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇。红藤乙醇提取物用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压浓缩回收溶剂，分别得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、水部位。水部位浓缩后经HP-20大孔吸附树脂，先用水洗脱至无色，再用95%乙醇洗脱至无色，收集95%乙醇洗脱液浓缩得水溶性部位W₂，冷冻干燥得HT_AE 2.62g，HT_W25.96g。 

实施例3 

HT_PS、HT_W1、HT_AE和HT_W2对二甲苯致小鼠耳肿胀反应的影响 

选取20±2g昆明种小鼠80只，随机分为10组，雌雄各半，每组8只。第1组：1%吐温-80，空白对照组；第2组：25mg/kg吲哚美辛，阳性对照组；第3、4组：HT_PS高低剂量组(200mg/kg，100mg/kg)；第5、6组：HT_W1高低剂量组(200mg/kg，100mg/kg)；第7、8组：HT_AE高低剂量组(200mg/kg，100mg/kg)；第9、10组：HT_W2高低剂量组(200mg/kg，100mg/kg)。各组小鼠以20mL/kg灌胃给药1h后，将小鼠右耳涂50μL二甲苯致炎，半小时后将小鼠颈椎脱臼处死，用直径为7mm的打孔器在左右耳同一部位打下圆耳片，分析天平称重，右耳与左耳重量之差即为肿胀度，计算肿胀抑制率，肿胀度(mg)=致炎后右耳重量-左耳重量。肿胀抑制率=(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100%，实验结果见表1。数据表明，HT_W2部位抑制小鼠耳肿胀活性最强。 

表1  二甲苯致小鼠耳肿胀的影响( n＝8) 

  No.   动物组别   剂量(mg/kg)   平均肿胀度(mg)     抑制率(％)   1   空白组     -     10.9±4.9     -   2   吲哚美辛组     25     2.2±1.4     30.92   3   HT_PS    200     4.1±2.9^**    62.59   4   HT_PS    100     7.5±3.6     30.92   5   HT_W1    200     6.0±3.0^*    50.33   6   HT_W1    100     6.6±2.5^*    44.95   7   HT_AE    200     4.1±2.8^*    61.79   8   HT_AE    100     8.3±3.2     25.24   9   HT_W2    200     3.2±3.1^**    70.53   10   HT_W2    100     8.7±4.0     19.47

^**p＜0.01，^*p＜0.05 

实施例4 

HT_PS、HT_W1、HT_AE和HT_W2对角叉菜胶致正常大鼠足肿胀度反应的影响  选取180-200g雄性SD大鼠60只，随机分为10组，每组6只。第1组：1％吐温-80，空白对照组；第2组：10mg/kg吲哚美辛，阳性对照组；第3、4组：HT_PS高低剂量组(100mg/kg，50mg/kg)；第5、6组：HT_W1高低剂量组(100mg/kg，50mg/kg)；第7、8组：HT_AE高低剂量组(100mg/kg，50mg/kg)；第9、10组：HT_W2高低剂量组(100mg/kg，50mg/kg)。以20mL/(kg·d)等容积灌胃给药1次，连续4d。末次给药后1h测定每只大鼠右后足爪踝关节上端腿毛下标记处的足爪容积(mL)，连测2次，取平均值作为致炎前的原始体积，同步给予每只大鼠右后肢足掌心向踝关节方向进针皮下注射1％角叉菜胶0.1mL致炎，分别测量致炎后1.0、2.0、3.0和4.0h足爪踝关节上端腿毛下标记处的足爪容积(mL)，结果见表2。数据表明，除HT_AE部位，低剂量组的肿胀抑制率更显著，其中HT_W1部位抑制肿胀性能最强。 

肿胀度(ml)＝至炎后足容积-至炎前足容积 

肿胀抑制率(％)＝(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％ 

表2  角叉菜胶致大鼠足肿胀度反应的影响( n＝6) 

^**p＜0.0l，^*p＜0.05 

实施例5 

HT_PS、HT_Wl、HT_AE和HT_W2对角叉菜胶致大鼠肿胀足跖炎症组织中MDA和PGE₂含量影响 

1)炎足组织中MDA的测定方法： 

根据实施例3，致炎4h后，处死大鼠，在踩关节上0.5cm处剪下炎性肿胀足，称重，剥皮后剪碎，置于5mL的生理盐水(NS)中浸1h后，将浸过NS的炎足浸入0.45mL0.5％三氯乙酸(TCA)中，4h后弃炎足，加0.1mol/L的盐酸1.0mL，再加入0.55mL0.67％硫代巴比妥酸后，沸水浴20min，加2mLNS稀释，以1000r/min离心10min，取上清液于波长为532nm处测定其吸光值，以此来表示MDA的含量，实验结果见表3。数据说明各部位高剂量组中炎症组织受自由基损伤程度较低，其中HT_W1部位的保护炎症组织免受自由基损伤能力最强。 

2)炎足组织中前列腺素(PGE₂)的测定方法： 

将上述炎足生理盐水浸泡液离心，吸取上清液0.3mL，加0.5mol/KOH-甲醇溶液2mL，在50℃下异构化20min，用甲醇稀释至5mL，于波长为278nm处测定其吸光度值。以每克炎性组织相当的吸光度值表示PGE₂的含量，实验结果见表3。由数据可知，低剂量组的抑制PGE₂产生的作用更强，其中HT_Wl部位抑制率最显著。 

结果见表3。 

表3  角叉菜胶致大鼠肿胀足炎症组织中MDA和PGE₂含量( n=6) 

  No.   组别   剂量(mg/kg)   MDA   PGE₂  1   空白组    0.574±0.011   0.356±0.019   2   阳性组   10   0.123±0.029^**  0.186±0.016^**  3   HT_PS  100   0.199±0.014^**  0.280±0.015^**  4   HT_PS  50   0.263±0.044^**  0.232±0.015^**  5   HT_W1  100   0.194±0.006^**  0.244±0.028^**  6   HT_W1  50   0.214±0.021^**  0.197±0.013^**  7   HT_AE  100   0.206±0.025^**  0.318±0.012^*  8   HT_AE  50   0.264±0.041^**  0.233±0.016^**  9   HT_W2  100   0.197±0.046^**  0.251±0.014^**  10   HT_W2  50   0.25±0.028^**  0.209±0.017^**

^**p<0.01，^*p<0.05 

实施例6 

HT_PS、HT_W1、HT_AE和HT_W2体外抗氧化活性测定 

1)DPPH·自由基清除能力的测定： 

1mL不同浓度的红藤提取物溶液中加入1.0mL 200μmol/DPPH·的乙醇溶液，再加入2.0mL 80%乙醇后混合均匀，黑暗处放置30min后用紫外分光光度计在517nm处测定吸光值A_i，同时测定1.0mL DPPH·的乙醇溶液与3.0mL乙醇溶液混合液的吸光值A_o和3mL乙醇与1.0mL样品混合液的吸光值A_j，清除率公式：清除率(%)=[1-(A_i－A_j)/A₀]×100%。数据表明，HT_W2和HT_AE部位清除DPPH·能力最强。 

2)还原力的测定： 

1.0mL不同浓度的红藤提取物溶液，加入2.5mLpH为6.6的磷酸盐缓冲液和2.5mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃水浴中保温20min，再加10%三氯乙酸2.5mL混匀，以3000r/min离心分离10min，移取上清液2.5mL于试管中，加蒸馏水2.5mL和0.1%FeCl₃水溶液0.5mL，常温反应10min后于700nm处测定吸光值，吸光值越高，说明这种反应混合物的还原性越强。用Vc做对照，临用前以双蒸水配制。数据表明，HT_W2和HT_AE部位还原力较强，但明显弱于Vc。 

表4  四种活性部位清除DPPH·自由基能力实验 

no未进行测试；^*:Vc的浓度分别是10,25,50和100μg/mL 

表5  四种活性部位还原力实验 

实施例7 

HT_PS、HT_W1、HT_AE和HT_W2体内抗氧化及抗衰老活性测定 

根据实施例3，致炎4h后，麻醉大鼠后股动脉取血，断颈椎处死大鼠后取肝脏，将血清和肝脏匀浆组织保存于-20℃待测，血清及肝脏组织中MDA含量和SOD活性数据见表6结果表明，HT_W1部位清除自由基、保护机体炎症过程中免受自由基损伤能力最强。 

实施例8 

红藤乙酸乙酯部位(HT_AE)胶囊制剂的制备 

6g红藤乙酸乙酯部位(HT_AE)冻干粉末，加入3g可溶性淀粉和9mL70%乙醇，混匀，60℃烘干，粉碎。按每粒0.45g制成胶囊。 

实施例9 

红藤水溶性部位W₂(HT_W2)注射液的制备 

1.6g红藤水溶性部位W₂(HT_W2)冻干粉末，加入40mL蒸馏水，加热至80℃，加入2%(v/v)苯甲醇，混合均匀后过0.22μm滤膜，得到的澄明液灌封于2mL安瓿中，蒸汽灭菌30min，备用。 

表6  角叉菜胶致足肿胀大鼠血清及肝脏组织中MDA、SOD、GSH-Px和CAT活性影响 

^**p<0.01，^*p<0.05。