HGT免疫抗炎活性部位的筛选及其免疫药理学初步研究

摘要

目的：从HGT中分离筛选免疫抗炎活性部位，探讨其对实验性类风湿性关节炎(RA)的治疗作用及其机理，为研制和开发治疗RA的新药提供实验依据。 方法：应用巴豆油诱发的小鼠急性耳肿胀及二硝基氯苯(DNCB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)作为免疫抗炎活性的评价指标，观察对急性炎症及细胞免疫反应的影响。应用佐剂性关节炎(AA)大鼠模型和Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型，通过观察足爪肿胀和踝关节组织病理变化评价对RA的治疗作用；应用ELISA法测定血清中白三烯(LTB<,4>)水平、紫外分光光度法测定足爪浸泡液中前列腺素E2(PGE<,2>)含量的变化，观察对炎症介质水平的影响；通过<'3>H-TdR掺入法测定脾细胞增殖反应、ELISA法测定脾细胞分泌抗体IgG水平、Luminex技术测定脾细胞培养上清细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-4水平以及应用流式细胞技术测定小鼠T细胞亚群和T调节细胞数量，观察对免疫反应的影响。 结果： (1)HGT四个提取部位HGT-1、HGT-2、HGT-3和HGT-5均有一定的抗炎和免疫抑制作用，综合溶解度和可能的毒性等各方面因素，选定了HGT-5进行了进一步分离纯化，经活性评价确定了其中分子量较大的多糖部位为主要免疫抗炎活性部位，随后将HGT-5用80％乙醇沉淀得到了目标部位HGT-5A。 (2)HGT-5A在100～500mg/kg灌胃给药对巴豆油诱发的小鼠急性耳肿胀具有明显的抑制作用，在50～100mg/kg灌胃给药对DNCB诱导的DTH反应具有明显的抑制作用，并且对DTH模型小鼠脾细胞增殖反应具有明显的抑制作用；体外实验发现，HGT-5A在1～500μg/mL浓度范围内对小鼠脾细胞增殖反应和脾细胞培养上清IgG含量具有浓度依赖性的抑制作用，且无明显的细胞毒性；仅在1000μg/mL时具有一定的细胞毒性。 (3)HGT-5A在30和60mg/kg灌胃给药2w可明显抑制AA大鼠原发侧和继发侧足爪肿胀，改善关节组织病理变化，并增强AA大鼠降低的脾细胞增殖反应，减少AA大鼠升高的脾细胞培养上清IgG含量，同时减少关节组织中PGE2的含量，而对血清中LTB<,4>作用不明显，提示HGT-5A对佐剂性关节炎具有治疗作用，该作用可能与调节免疫反应、抑制PGE<,2>炎症介质的产生有关。 (4)HGT-5A在100和250mg/kg灌胃给药40d可明显减轻CIA小鼠的踝关节肿胀，改善踝关节的组织病理变化，并降低血清Ⅱ型胶原抗体水平，降低T细胞亚群CD4<'+>/CD8<'+>比值，增加T调节细胞(Treg)百分率，降低脾细胞培养上清TNF-α等炎性因子水平，降低Th1细胞分泌的IFN-γ和Th2细胞分泌的IL-4，其中以降低Th1细胞分泌的IFN-γ为主，从而恢复Th1/Th2平衡。提示HGT-5A对CIA小鼠关节炎具有治疗作用，该作用可能与其调节细胞免疫和体液免疫的平衡，从而抑制Ⅱ型胶原抗体和炎性因子的产生有关。 (5)化学分析结果表明，HGT-5A的主要成分为多糖；应用DEAE-纤维素柱层析和凝胶柱层析从HGT-5A中得到八个多糖组分，其中六个为均一多糖，并应用气相色谱法分析了它们的糖组成及其比例；通过比较体外对脾细胞增殖反应的影响，六个均一多糖均具有明显的免疫抑制作用，其抑制活性与HGT-5A相当。 结论： HGT-5A具有抗炎和免疫调节活性，对AA大鼠及CIA小鼠实验性关节炎具有明显的治疗作用，其作用的物质基础可能为大分子多糖。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一章材料与方法

一、实验动物

二、药物和试剂

三、主要实验仪器

四、实验方法

五、统计学处理

第二章实验结果

一、HGT免疫抗炎活性部位的筛选

1、HGT的分离提取流程

2、HGT-1，-2，-3和-5对小鼠急性炎症的影响

3、HGT-1，-2，-3和-5对小鼠DTH反应的影响

4、HGT-5免疫抑制活性的确认

5、HGT-5-1与HGT-5-2抗急性炎症作用的比较

6、HGT-5-1与HGT-5-2免疫抑制作用的比较

二、HGT-5A的免疫抗炎活性

1、HGT-5A对小鼠急性炎症的抑制作用

2、HGT-5A对小鼠细胞免疫反应的抑制作用

3、HGT-5A体外对小鼠脾细胞存活率的影响

4、HGT-5A体外对小鼠脾细胞增殖反应的影响

5、HGT-5A体外对小鼠脾细胞培养上清IgG含量的影响

三、HGT-5A对佐剂性关节炎的治疗作用

1、HGT-5A对AA大鼠关节炎发病率的影响

2、HGT-5A对AA大鼠原发侧足爪肿胀的影响

3、HGT-5A对AA大鼠继发侧足爪肿胀的影响

4、HGT-5A对AA大鼠踝关节组织病理变化的影响

5、HGT-5A对AA大鼠脾细胞增殖反应的影响

6、HGT-5A对AA大鼠脾细胞培养上清IgG含量的影响

7、HGT-5A对AA大鼠足爪浸出液中PGE2含量的影响

8、HGT-5A对AA大鼠血清中LTB4含量的影响

四、HGT-5A对Ⅱ型胶原诱导关节炎的治疗作用

1、CIA小鼠的关节炎症状

2、HGT-5A对CIA小鼠踝关节肿胀程度的影响

3、HGT-5A对CIA小鼠踝关节组织病理变化的影响

4、HGT-5A对CIA小鼠血清Ⅱ型胶原抗体的影响

5、HGT-5A对CIA小鼠脾细胞增殖反应的影响

6、HGT-5A对CIA小鼠脾细胞培养上清IgG含量的影响

7、HGT-5A对CIA小鼠T细胞亚群的影响

8、HGT-5A对CIA小鼠脾Treg细胞百分率的影响

9、HGT-5A对CIA小鼠脾细胞培养上清TNF-α、INF-γ和IL-4含量的影响

五、HGT-5A化学成分分析

1、HGT-5A的分离纯化

2、HGT-5A各组分的纯度及分子量

3、HGT-5A各组分的糖组成

4、HGT-5A各组分体外对小鼠脾细胞增殖反应的影响

第三章讨论

一、抗炎免疫活性评价指标的选择

二、类风湿性关节炎动物模型的选择

三、HGT抗炎免疫活性部位的筛选

四、HGT-5A免疫抗炎活性评价

五、HGT-5A对佐剂性关节炎的治疗作用

六、HGT-5A对Ⅱ型胶原诱导关节炎的治疗作用

七、HGT-5A的化学成分

结 论

参考文献

发表论文一

发表论文二

致谢

个人简历