一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法

摘要

一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，属于海水动物增殖放流领域，包括以下步骤：选择中国对虾多个亲本，将雌雄亲本一对一定向交尾，交尾成功的雌虾在眼柄套上标记环后越冬培育，雄虾眼柄标记后放置在-70℃备用，交尾雌虾翌年进行苗种培育，放流季节对所培育的中国对虾幼苗进行放流；秋季，在洄游点捕捞取样，样品回捕后通过中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定中国对虾的放流效果；本发明用于回捕个体的检测方法是中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，利用分子指纹图谱分析，从回捕样品中识别放流个体，该标记为个体遗传物质，不会对标记个体造成任何内在或物理损伤，可以准确评估中国对虾的放流效果。

说明书

技术领域

本发明属于海水动物增殖放流领域，具体地涉及一种可实现对放流中国对 虾个体精确追溯的放流方法。

背景技术

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国特有的一年生大型经济虾 类，主要分布在黄渤海沿岸海区，经济效益显著。二十世纪八十年代以来，由 于捕捞强度的不断加大、生态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野 生中国对虾的盲目需求等综合因素的影响，中国对虾野生资源量急剧萎缩。为 保护、恢复中国对虾种群和渔业资源，我国于1984年开始在特定海区进行中国 对虾移殖/增殖放流，每年放流约30亿尾仔虾。经过连续多年的大规模种苗放 流，中国对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法准确区分回捕群体中放 流个体和野生个体及数量，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平， 分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是中国对虾放流迫切需要 解决的重大问题。衡量和评估放流效果的重要指标之一是放流回捕率估算，这 是制定科学的放流规划、有效促进野生中国对虾种群资源恢复的重要指标。但 是现有的检测方法由于存在各种缺陷而无法提供精确的回捕率，主要存在以下 几个原因：1)回捕样品中无法准确区分放流和野生对虾个体；2)放流个体的 物理标记过程操作繁琐、无法大规模进行，一般只对部分放流个体进行标记；3) 物理标记对个体规格要求苛刻、标记后个体死亡率大，影响回捕率准确估算。 因此，目前迫切需要一种技术对放流群体进行大批量标志，以此为中国对虾放 流提供精确的回捕率数据。并且该技术应该具备以下特征：1)放流个体携带特 有的标识系统，该系统可精确区分野生和人工放流个体；2)携带该标识系统的 个体可以大批量培育并维系个体一生，不会对标识个体具有任何内在或物理伤 害；3)该标识个体可被迅速鉴别并与其它个体区分开来；4)标识个体放流不 会破坏或影响野生中国对虾群体资源结构。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放 流方法，精确评估中国对虾放流效果和放流回捕率，推算野生群体资源量，制 定科学的放流规划、有效促进野生中国对虾种群资源恢复。

本发明所采用的放流效果评估方法符合背景技术中所列出的放流检测所要 具备的5个条件：1)具有确定遗传背景、不携带特定病原的中国对虾大规模多 家系苗种培育；2)中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体/家系高效精确识别； 3)携带特定DNA分子指纹图谱放流个体的标志放流；4)携带特定DNA分子指 纹图谱放流个体的大规模检出；5)放流和野生资源及回捕率的精确计算。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，包括以下步骤：

选择确定遗传背景、不携带特定病原的中国对虾多个亲本，将雌雄亲本一 对一定向交尾，交尾成功的雌虾在眼柄套上标记环后越冬培育，雄虾眼柄标记 后放置在-70℃备用，交尾雌虾翌年进行苗种培育，放流季节对所培育的中国对 虾幼苗进行放流；秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕 后通过中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量， 最终确定中国对虾的放流效果；

其中所述的中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，微卫星引物 组合及序列如下：

EN0033正向序列为：5′-CCTTGACACGGCATTGATTGG-3′，反向序列为：5′ -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3′；

RS0622正向序列为：5′-TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3′，反向序列为：5′ -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3′；

FCKR002正向序列为：5′-CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3′，反向序列为： 5′-AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3′；

FCKR013正向序列为：5′-GCACATATAAGCACAAACGCTC-3′，反向序列为： 5′-CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3′；

PCR反应体系为：25μl反应体系，其中包括2.5μl 10×PCR缓冲液、四种 荧光标记引物的浓度均为10μM，EN0033正反引物每条各为0.25μl，RS0622正 反引物每条各为0.5μl，FCKR002正反引物每条各为0.5μl，FCKR013正反引物 每条各为0.5μl；100ng基因组DNA、250μmol/L dNTPs、2.0mmol/L Mg²⁺、1单 位Taq DNA聚合酶；

扩增程序为：94℃变性4min后进行循环1：94℃变性40s，70℃退火1min， 之后每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min，共循环5次；随后进行循环2： 94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共循环8次；再进行循环3： 94℃变性40s，64℃退火1min，之后每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min， 共循环4次；进行循环4：94℃变性40s，61℃退火1min，72℃延伸1min，共 循环12次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

进一步，放流效果的确定是按如下公式计算的：放流回捕率＝放流个体数 量/样品总数。

本发明进行个体准确追溯的原理是：利用中国对虾同一家系内个体具备相 同分子指纹图谱，在父母本已知的情况下，同一家系个体可被精确识别的特点， 结合中国对虾大规模多家系育苗，生产放流群体。秋汛回捕时，利用精确高效 分子指纹图谱分析识别，从回捕样品中识别放流个体，计算放流个体数量和野 生个体数量，从而达到精确评估放流回捕率。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明对放流群体亲本精心选择，一对一定向交尾，标记并保存好放流群 体亲本，为放流后回捕个体的精确追溯奠定了基础。

本发明用于回捕个体的检测方法是中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体 识别技术，利用分子指纹图谱分析，从回捕样品中识别放流个体，该标记为个 体遗传物质，对于放流的任意规格中国对虾个体都能起到标识作用，且可以维 系一生，不会对标记个体造成任何内在或物理损伤。并且在整个放流过程中， 放流个体具备与其它个体相同的生活生态习性行、相同的洄游路线，不会比其 它个体具备更明显的生存/死亡优势；放流标识个体通过微卫星四重PCR技术可 被迅速鉴别并与其它个体区分开来，可以用来对回捕样品中放流、野生群体数 量及回捕率进行精确计算；且标识个体放流不会破坏或影响野生中国对虾群体 资源结构。因此本发明的方法可以准确评估中国对虾的放流效果。

具体实施方式

实施例1：标记放流种群及方法的确立

一、具有特定分子指纹图谱中国对虾家系个体的追溯

每对父母繁育的后代都有一致的DNA分子指纹，该分子指纹为个体/家象特 有而区别于其它家系和个体且维系一生。利用这种特异性的分子指纹图谱，参 照亲本基因型，即可从混合群体中准确识别出特定的个体/家系。中国对虾微卫 星在基因组中分布广泛，遗传变异水平丰富，具遗传选择中性特点。微卫星分 子标记不同基因型组合而形成的分子指纹图谱是进行个体/家系识别的理想工 具。以实验室自主开发的中国对虾微卫星位点为例，大多数位点的等位基因数 量在7-13个不等。在双亲已知的情况下，利用四个互不连锁的微卫星分子标记， 每个位点的等位基因数目为10个，则理论上此四个微卫星组成的分子指纹图谱 识别体系可以达到家系/个体排除率99.9999％的水平。也就是说，同一家系内的 个体间其分子指纹图谱是一致的，而区别于其它个体的分子指纹图谱。

二、多家系放流种群的获得

头年秋季从海捕对虾中挑选未交尾的雄虾和雌虾个体若干，一对一放置在 3m³玻璃钢桶中定向交尾。交尾成功的雌虾眼柄标记后(即在对虾眼柄上套上带 有标记信息的塑料环)越冬培育，雄虾眼标后放置在-70℃备用。交尾雌虾翌年 进行苗种培育，放流季节对所培育的中国对虾幼苗进行放流。

三、回捕、以及放流效果评估

秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞，每个放流地点采样数量为5000 尾。每个样品取游泳附肢采用常规酚/氯仿抽提方法进行DNA提取。然后进行荧 光标记微卫星四重PCR检测分析。PCR反应体系为：25μl反应体系，其中包括 2.5μl 10×PCR缓冲液、四种荧光标记引物(引物组合及序列见表1)的浓度均 为10μM，EN0033正反引物每条各为0.25μl，RS0622正反引物每条各为0.5μl， FCKR002正反引物每条各为0.5μl，FCKR013正反引物每条各为0.5μl；100ng 基因组DNA、250μmol/L dNTPs、2.0mmol/L Mg²⁺、1单位Taq DNA聚合酶；扩增 程序为：94℃变性4min后进行循环1：94℃变性40s，70℃退火1min，之后每 个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min，共循环5次；随后进行循环2：94℃ 变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共循环8次；再进行循环3：94℃ 变性40s，64℃退火1min，之后每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min， 共循环4次；进行循环4：94℃变性40s，61℃退火1min，72℃延伸1min，共 循环12次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。PCR产物检测在ABI3130 测序仪(美国Applied Biosystems公司)上进行，利用GeneMapper软件进行 峰值转化及微卫星位点等位基因判读。采用同样方法对多家系父母本进行四个 微卫星位点的基因型检测。家系亲本及样品数据分别输入Cervus 3.0软件中进 行亲本及子代个体识别，检测样品中放流个体数量。放流回捕率＝放流个体数量 /样品总量(％)。

表1.中国对虾个体/家系识别所用微卫星引物组合及序列

实施例2：小规模的检测

2010年，在黄海水产研究所鳌山卫实验基地开展了利用本发明方法进行放 流的模拟实验。具体实施方式为：头年秋季随机采集100尾海捕对虾并通过眼 柄标记对个体进行物理标记，从中挑选未交尾的雌虾和雄虾各6尾，按照1∶1 比例控制交尾，完成交尾的雄虾-76℃保存。同时设置备份组。剩余雌虾和雄虾 随机交尾，交尾完成雌虾与控制交尾雌虾混合越冬。2010年春季，3尾控制交 尾雌虾单独培育家系，当年5月，仔虾个体达到3cm左右时，分别从3个家系 中各随机挑选100尾进行物理荧光标记。其余雌虾同步混合培育仔虾30000尾， 从中随机挑选1988尾同规格对虾个体与以上3个家系的300尾个体进行混养。 当年8月中旬，所有个体采集后，采用表1所述4对中国对虾SSR引物组成中 国对虾荧光标记微卫星四重PCR反应体系，PCR反应体系组成及扩增程序同实施 例1。应用该微卫星四重PCR技术，结合家系亲本基因型数据，对3个混养家系 个体进行了分子标记溯源分析。结果表明，经个体荧光标记验证，所有家系个 体均可利用该微卫星四重PCR反应体系得到溯源确认。

技术指标

中国对虾荧光标记微卫星四重PCR技术的个体/家系识别率在99.9995％(父 母本已知)以上；该技术可对每年6000个中国对虾全同胞家系亲本及其子代进 行溯源追踪，也就是可以满足对我国每年30亿尾中国对虾放流群体进行跟踪之 需及用于进行回捕率的精确估算；该技术不仅可以在单个放流地点进行放流跟 踪，还可以在多地点同时进行放流个体跟踪和回捕率计算。

应用范围

该技术主要应用于中国对虾放流实践中放流个体与野生个体的精确区分， 进而实现对放流效果的精确评估。