纳米纤维增强水凝胶仿生人工半月板复合材料的制备方法

摘要

一种纳米细菌纤维素增强水凝胶仿生半月板复合材料的制备方法，属于生物医用材料或生物复合材料技术领域。其特征是通过对纤维素薄膜进行预处理，控制纤维素薄膜的含水量，再通过浸渍法，使聚乙烯醇溶胶在纤维膜中的能够渗透，然后通过层叠强化法或弥散强化法对聚乙烯醇水凝胶进行纤维复合增强，最后经过数次冷冻解冻方法得到具有良好力学性能的纤维膜增强的水凝胶仿生人工半月板材料。本发明通过用生物相容性优异的纳米纤维薄膜增强聚乙醇水凝胶，提高了水凝胶的力学性能和稳定性，使其能够完全满足仿生人工半月板的各项性能要求，制备成本较低，制备的样品形状和尺寸易调控，具有良好的生物相容性。该材料除可用于仿生人工半月板外，还可用于人工软骨、人工血管、人工皮肤等生物医用领域。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料或生物复合材料技术领域，特别是提供了一种纳米细菌纤维素膜增强水凝胶仿生半月板复合材料的制备方法。

背景技术

在膝关节连续运动中，半月板起着重要的承担传递载荷、缓冲负荷、稳定和润滑关节等作用。因此，半月板的结构的完整性对保持膝关节的功能性有着至关重要意义。然而，由于半月板的三分之二的区域为无血液供应区的白区，这就导致无血液供应的白区半月板一旦受到损伤就不能自行修复。传统的治疗只关注于对损伤半月板的切除、修整和成形等，虽然能短暂的解除患者的病痛，但是由于丧失了半月板的功能，关节退行性变加速，最终导致膝关节关节炎的产生，从而影响人们的正常生活。目前，针对人体膝关节半月板损伤的修复手段主要有，同种异体移植，人工假体植入修复以及组织工程三种方法，但是这三种方法都存在着各自的不足。目前，国内外关于人工半月板假体植入修复材料的研究报导较少，其中一个重要原因就是缺少能够满足半月板特殊力学性能要求，同时具有良好生物相容性的材料体系。

目前，研究较多的利用各种材料如聚四乙烯网、硅、碳纤维、涤纶等制备人工半月板假体以及脂肪垫和肌腱组织等自体组织植入修复物修复或植入修复半月板的方法在一定程度上能起到暂时的代替作用，但一些临床相关问题如：组织工程化半月板的耐用性、生物相容性、支架材料的力学强度、细胞因子的使用和应力刺激的选择等问题有待进一步优化。例如，蚕丝纤维-胶原复合构建的人工半月板具有良好的力学性能，短期能够植入修复半月板的功能，但是其动物实验的结果表明，由蚕丝蛋白纤维与胶原构建的人工半月板植入修复材料的长期使用效果不佳，长期使用会导致关节退变，引发关节炎症。日本研究人员 Kobayashi 等人用聚乙烯乙醇水凝胶(PVA-H)做了人体半月板植入修复物的研究，发现较高容量的 PVA-H显示的粘弹性与人类半月板的粘弹性相似，但其与骨基底的结合性能差，且缺乏足够的力学强度，这直接影响了软骨的固定，修复及其功能的恢复。如何赋予人工半月板较好的生物活性连接性和表面润滑性，同时又使其具有优异的生物力学性能和耐久性，这是国内外均没有解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米细菌纤维素增强水凝胶仿生半月板材料的制备方法 ，使制备出的复合水凝胶仿生半月板材料具有良好的弹性模量和抗拉强度，同时制备方法简单、制作成本低、纳米细菌纤维素膜层与水凝胶层相互粘结良好，在保持高含水率的条件下将其各项力学性能提高到接近于真实人体半月板。

本发明技术方案是：通过预处理去除细菌纤维素（BC）膜上的培养基和其它杂质，使用去离子水冲洗至PH值为7，采用加热搅拌的方法制备聚乙烯醇（PVA）溶液，用浸渍法或叠层法制备增强纳米细菌纤维膜，再经过数次的物理冷冻解冻方法，最后得到具有良好综合力学性能的BC膜增强聚乙烯醇水凝胶仿生人工半月板材料。

具体制备工艺如下：

方法一：叠层增强法：

步骤一、聚乙烯醇溶液的制备。

称取一定量的平均聚合度为1750±200的聚乙烯醇颗粒，按照质量分数为5%-50%的配比加入去离子水在80-120℃下加热搅拌1～2h;

在50-80℃的水浴锅中静置0.5-1h，除去溶液中的气泡并保温。

步骤二、增强纳米细菌纤维素（BC）膜的预处理。

1.取纳米细菌纤维素膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质再将膜浸泡于0.01~0.5mol/L的NaOH溶液，80-100℃下煮沸5～60min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时膜呈乳白色半透明。

2.用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.1-7.5，得到预处理的纳米BC膜。

3.再将预处理的纳米BC膜放置平台上，对其施加一定的压力，得到含水量为75-90%的BC膜；将处理后的纳米细菌纤维素膜浸渍在步骤一中制得的PVA溶液里0.5-1h，预处理完毕。

步骤三、纳米细菌纤维素膜增强水凝胶人工半月板复合材料制备。

1.将预处理好的纳米BC膜取出，在预先制作的模具底部铺展，保证其没有褶皱，并与模具底部完美接触没有空隙；

2.将处理好并保持50-80℃的PVA水溶液浇入模具，并使其均匀的铺展在底层纳米BC膜之上，厚度约为2-5mm；

3.再取出一块已裁剪为模具形状的纳米BC膜，按照“1”的方法，将其铺展在已均匀分布在底层纳米BC膜的PVA水溶液上；

4.静置片刻，待PVA溶液温度降至30-40℃左右，PVA水溶液黏性增大，并逐渐渗入上下两层纳米BC膜中后，重复“2”和“3”，共铺2~5层纳米细菌纤维素膜，每层膜间隔2-5mm，在间隔处均匀的注满PVA溶液，如附图说明中“图1”所示。

5.将制备好的复合材料框架连同模具放进-50~0℃冷冻10-20h，再取出放置在室温下解冻1-5h，重复5-10次就可以得到具有一定强度的仿生人工半月板材料。

方法二：弥散增强法：

步骤一、聚乙烯醇溶液的制备。

称取一定量的平均聚合度为1750±200的聚乙烯醇颗粒，按照质量分数为5%-50%的配比加入去离子水在80-120℃下加热搅拌1～2h;

在50-80℃的水浴锅中静置0.5-1h，除去溶液中的气泡并保温。

步骤二、纳米细菌纤维素的预处理。

取细菌纤维素（BC）膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.01~0.5mol/L的NaOH溶液，80-100℃下煮沸5～60min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时膜呈乳白色半透明；用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.1-7.5，得到BC膜；

再将预处理的BC膜放置平台上，对其施加一定的压力，得到含水量为75-90%的BC膜。

步骤三、弥散状增强纳米细菌纤维膜的制备

1.将预处理完毕的 BC 膜从去离子水中取出，放入装有质量分数为 5%-10%的NaOH的强碱性溶液的烧杯中，在 50-100℃的水浴锅中加热 1-2小时；

2.将烧杯取出冷却至室温，放置在-5~-10℃的冷藏箱中冷冻 10-15小时，然后取出放置在室温下解冻，再将其放置在-5~-10℃的冷藏箱中冷冻 10-15小时，如此反复冷冻解冻数次直到 BC 纤维膜完全成透明状；

3.将透明的BC纤维膜用去离子水小心反复清洗至中性，最后将pH值为中性的透明的BC纤维膜研碎；

4.将研碎的细小 BC 纤维块用超声分散仪器进行超声分散一定时间，得到絮状强化纤维颗粒。

步骤四、弥散纳米纤维增强水凝胶人工半月板复合材料制备

1.将PVA颗粒与超声分散后的BC纤维按照BC/PVA%=50-300%的质量比进行混合配料，根据 PVA凝胶溶液的质量百分数为10-30%的比例添加去离子水，在100-120℃的高压水浴锅中加热搅1-2小时；

2.待 PVA 颗粒完全溶解且 BC 纤维在 PVA 凝胶溶液中分散均匀后，在 70-95℃的恒温水浴锅中静置一段时间，去除搅拌过程中带来的气泡；

3.将混合溶液浇注在准备好的模具中，使其均匀分布在模具中，中间无气泡和孔隙残留，静置待溶液冷却至室温。

4.将制备好的复合材料框架连同模具放进-50~0℃冷冻10-20h，再取出放置在室温下解冻1-5h，重复5-10次就可以得到具有一定强度的仿生人工半月板材料。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明所获得的纳米纤维增强水凝胶仿生人工半月板，具有高含水率，综合力学性能和稳定性优良，生物相容性好，且制备方法简单，制备的样品形状和尺寸易调控廉等特点，可满足半月板植入假体的各项要求。同时，可以通过调节聚乙烯醇溶液的浓度和BC膜的含水量来控制PVA层与BC膜层之间的结合，并通过控制复合BC膜的层数、冷冻解冻的次数和BC膜在PVA溶液中浸渍的时间来调整综合力学性能，以满足不同需求。制备复合材料除可用于仿生人工半月板外， 还可用于人工软骨、人工血管、人工皮肤等生物医用领域。

附图说明

图1 纳米细菌纤维素膜叠层法增强仿生人工半月板材料结构示意图

图2 纳米细菌纤维素膜弥散法增强仿生人工半月板材料结构示意图。

图3 纳米BC纤维/PVA水凝胶互穿网络扫描电镜图。

图4 纳米细菌纤维素膜增强水凝胶复合材料制作出的仿生人工半月板。

具体实施方式

实例1

将市售有木醋杆菌制得的细菌纤维素膜剪取成6×10cm的细菌纤维素样品。

步骤一、称取一定质量的PVA，按照质量分数为15%的要求加入一定量的去离子水。在80℃的水浴锅中加热搅拌1.5h，让PVA颗粒充分溶解，再在60℃的水浴锅中静置0.5h，除去气泡并保温；

步骤二、取细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，I00℃下煮沸20min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2；

步骤三、将预处理后的BC膜，平放在光滑的平板上，再在BC膜上放上一平板，在平板上施加10KG的砝码，持续时间0.5h，压出BC膜中的部分水分，然后放置在冷藏冰箱中冷藏备用；

步骤四、将BC膜浸渍在制备好的PVA溶液中，持续时间5min;

步骤五、将BC膜从PVA溶液中取出，在长方形的模具按照铺层的方法铺上2~3层BC膜，然后在模具中注入一定量的PVA溶液；

步骤六、将制备好的复合材料放进-50~0℃冷冻10-20h，再取出放置在室温下解冻1-5h，重复5-10次就可以得到具有一定强度的仿生人工半月板材料。

实例2

将市售有木醋杆菌制得的纳米细菌纤维素膜剪取成6×10cm的纳米细菌纤维素样品。

步骤一、称取一定质量的PVA，按照质量分数为20%的要求加入一定量的去离子水。在80℃的水浴锅中加热搅拌1.5h，让PVA颗粒充分溶解，再在60℃的水浴锅中静置0.5h，除去气泡并保温；

步骤二、取纳米细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，I00℃下煮沸20min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2；

步骤三、将预处理后的纳米BC膜，平放在光滑的平板上，将平板放置在阴凉通风处0.5h，然后放置在冷藏冰箱中冷藏备用；

步骤四、将纳米BC膜从冷藏箱中取出，在长方形的模具按照铺层的方法铺上2~3层BC膜，然后在模具中注入一定量的PVA溶液；

步骤五、将制备好的复合材料放进-50~0℃冷冻10-20h，再取出放置在室温下解冻1-5h，重复5-10次就可以得到具有一定强度的仿生人工半月板材料。

实例3

将市售有木醋杆菌制得的纳米细菌纤维素膜剪取成6×10cm的纳米细菌纤维素样品。

步骤一、称取一定质量的PVA，按照质量分数为25%的要求加入一定量的去离子水。在80℃的水浴锅中加热搅拌1.5h，让PVA颗粒充分溶解，再在60℃的水浴锅中静置0.5h，除去气泡并保温；

步骤二、取纳米细菌纤维素膜用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，I00℃下煮沸20min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2；

步骤三、将预处理后的纳米BC膜，平放在光滑的平板上，用吸水纸吸出纳米BC膜中的部分水分，然后放置在冷藏冰箱中冷藏备用；

步骤四、将纳米BC膜从冷藏箱中取出，在长方形的模具按照铺层的方法铺上2~3层BC膜，然后在模具中注入一定量的PVA溶液；

步骤五、将制备好的复合材料放进-50~0℃冷冻10-20h，再取出放置在室温下解冻1-5h，重复5-10次就可以得到具有一定强度的仿生人工半月板材料。

实例4

将市售有木醋杆菌制得的纳米细菌纤维素膜剪取成6×10cm的细菌纤维素样品。

步骤一、取纳米细菌纤维素膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，80-100℃下煮沸20min，去除液膜中的菌体和残留培养基，此时膜呈乳白色半透明；用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2，得到纳米BC膜；再将预处理的纳米BC膜放置平台上，对其施加一定的压力，得到含水量为75-90%的纳米BC膜；

步骤二、将碱处理、纯化后的纳米 BC 纤维膜从去离子水中取出，放入装有质量分数为 5%-10%的NaOH的强碱性溶液的烧杯中，在 80℃的水浴锅中加热 1.5小时；将烧杯取出冷却至室温，放置在-8℃的冷藏箱中冷冻12小时，然后取出放置在室温下解冻，再将其放置在-8℃的冷藏箱中冷冻12小时，如此反复冷冻解冻数次直到 BC 纤维膜完全成透明状；将透明的 BC纤维膜用去离子水小心反复清洗至中性，最后将 pH 值为中性的透明的BC纤维膜研碎；将研碎的细小 BC 纤维块用超声分散仪器进行超声分散一定时间，得到絮状强化纤维颗粒。

步骤三、将PVA颗粒与超声分散后的纳米BC纤维按照质量比1:1进行混合配料，根据 PVA 凝胶溶液的质量百分数为10-30%的比例添加去离子水，在 120℃的高压水浴锅中加热搅2小时；待 PVA 颗粒完全溶解且纳米 BC 纤维在 PVA 凝胶溶液中分散均匀后，在 70-95℃的恒温水浴锅中静置一段时间，去除搅拌过程中带来的气泡；将混合溶液浇注在准备好的模具中，使用玻璃棒使其均匀分布在模具中，中间无气泡和孔隙残留，静置待溶液冷却至室温。将制备好的复合材料框架连同模具放进-20℃冷冻10-20h，再取出放置在室温下解冻3h，重复5-10次就可以得到仿生人工半月板材料。