DNA甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用

摘要

本发明公开了一种DNA甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用。所述DNA甲基化修饰剂为DNA甲基化抑制剂或DNA甲基化促进剂。实验证明，使用DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理棉花胚珠，当浓度为6μmol/L时，体外培养6天后的棉花纤维长度与对照相比，增长受到的促进作用最高，是对照的2.39倍；DNA甲基化促进剂S-腺苷甲硫氨酸处理棉花胚珠，在浓度未达到产生毒性致死胚珠的前提下，当浓度为15μmol/L时，体外培养6天后的棉花纤维长度与对照相比，增长受到的抑制作用最高，是对照的23.3%。本发明在生产中可用于调控棉花纤维的长度以获得符合实际需要的棉花，具有重大的经济价值和广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用。

背景技术

棉花纤维是从胚珠外表皮细胞分化而来的单细胞结构。棉花纤维是纺织工业的主 要原料，具有重要的经济价值。纤维质量取决于其最终的长度与强度。同时，棉纤维 细胞也是研究细胞伸长、分化和细胞壁合成等重要生物学现象的理想系统。所以，研 究纤维伸长有重要的经济价值和理论意义。

棉花纤维细胞的发育过程是细胞超常伸长和细胞壁超常加厚的过程。陆地棉终长 度约为3.0cm左右，细胞壁直径为11-22μm，即长宽比为1000-3000。棉花纤维细胞 的发育过程一般可以分为四个相互重叠的时期：纤维起始，细胞伸长（初生壁形成）、 次生壁合成和成熟期。

DNA甲基化（DNA methylation）是指生物体在DNA甲基转移酶（DNA  methyltransferase,DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体将甲基 转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，甲基 化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤，在真核生物中甲基化 仅发生于胞嘧啶。大量研究表明，在高等植物中DNA甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而参与调控许多重要的生 物学现象和发育过程。本发明的研究小组发现，DNA甲基化参与调控棉花纤维细胞的 伸长发育过程。

发明内容

本发明的目的是提供DNA甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用，所述DNA 甲基化修饰剂为DNA甲基化抑制剂或DNA甲基化促进剂；

所述DNA甲基化修饰剂是指调节DNA甲基化水平的试剂，分为抑制DNA甲基化修 饰或降低DNA甲基化水平的DNA甲基化抑制剂和促进DNA甲基化修饰或提高DNA甲基 化水平的DNA甲基化促进剂。

在上述应用中，所述DNA甲基化抑制剂可为5-杂氮-2'-脱氧胞苷，也可为其它DNA 甲基化抑制剂；所述DNA甲基化促进剂可为S-腺苷甲硫氨酸（SAM），也可为其它DNA 甲基化促进剂。

本发明的另一个目的是提供一种调控棉花纤维长度的方法，该方法包括用DNA甲 基化抑制剂处理棉花胚珠或植株以促进棉花纤维伸长的步骤。

所述DNA甲基化抑制剂可为5-杂氮-2'-脱氧胞苷，也可为其它DNA甲基化抑制剂。

本发明的还提供另一种调控棉花纤维长度的方法，该方法包括用DNA甲基化促进 剂处理棉花胚珠或植株以抑制棉花纤维伸长的步骤。

所述DNA甲基化促进剂可为S-腺苷甲硫氨酸，也可为其它DNA甲基化促进剂。

在上述两种方法中，所述处理的时期可为所述棉花开花后的24-144小时，如24-48 小时；棉花开花后的24-144小时为棉花纤维细胞的伸长期；本发明的实施例选取开花 24-48小时的棉花胚珠进行处理是为了保证实验结果的一致性。

在上述两种方法中，使用所述DNA甲基化抑制剂处理棉花胚珠中，所述DNA甲基 化抑制剂为5-杂氮-2'-脱氧胞苷时，其使用浓度可为0.5-12μmol/L，或2-12μmol/L， 具体可为2μmol/L、6μmol/L或12μmol/L；使用所述DNA甲基化促进剂处理棉花胚 珠中，所述DNA甲基化促进剂为S-腺苷甲硫氨酸时，其使用浓度可为0.5-15μmol/L， 或5-15μmol/L，具体可为5μmol/L、10μmol/L或15μmol/L。

在上述两种方法中，所述处理棉花胚珠可按照包括如下步骤的方法进行：将所述 棉花胚珠置于含有所述DNA甲基化抑制剂或所述DNA甲基化促进剂的棉花胚珠培养基 中进行培养，所述培养的温度和光照条件如下：30℃、黑暗。

本发明所述棉花可应用于不同的栽培棉种，尤其适合于陆地棉品种。

实验证明，使用DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理棉花胚珠，当浓度为 6μmol/L时，体外培养6天后的棉花纤维长度与对照相比，增长受到的促进作用最 高，是未经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理（对照）的2.39倍；DNA甲基化促进剂S-腺苷 甲硫氨酸处理棉花胚珠，在浓度未达到产生毒性致死胚珠的前提下，当浓度为15μ mol/L时，体外培养6天后的棉花纤维长度与对照相比，增长受到的抑制作用最高， 是未经S-腺苷甲硫氨酸处理（对照）的23.3%。本发明在生产中可用于调控棉花纤维 的长度以获得符合实际需要的棉花，具有重大的经济价值和广阔的应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明均为质量百分含量。

下述实施例中所用到的材料和试剂具体如下：

陆地棉品种徐州142（Gossypium hirsutum Xuzhou-142）：中国农业科学院棉花 研究所科技贸易公司；

5-杂氮-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine）：DNA甲基化抑制剂， SIGMA-ALDRICH；

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）：DNA甲基化促进剂，SIGMA-ALDRICH。

实施例1、DNA甲基化抑制剂调控棉花纤维长度

一、实验材料：5-杂氮-2’-脱氧胞苷；陆地棉品种徐州142。

二、实验方法

对棉花胚珠进行体外培养，在培养液中分别添加不同浓度的5-杂氮-2'-脱氧胞 苷，以未添加5-杂氮-2’-脱氧胞苷为对照（CK1）。每个浓度的处理设3个重复，每个 重复20个胚珠。体外培养6天后，测量棉花胚珠纤维长度。

上述棉花胚珠体外培养及纤维长度测量的步骤具体如下：

1、按照下表1配制棉花胚珠体外培养的培养液。使用前，用KOH调PH值至6.0， 121℃、15分钟高压灭菌，备用。

表1.棉花胚珠体外培养的培养液配方

2、胚珠的体外培养（参照文献“Beasley and Irwin,1973”的方法）：

1）摘取在温室中开花24-48小时的棉花花朵，剥去苞片、萼片、花瓣后浸泡于 10%次氯酸钠溶液中消毒15分钟。

2）用无菌ddH₂O洗5-6次，洗去次氯酸钠，防止次氯酸钠接触到胚珠。

3）在无菌条件下，用手术刀和镊子小心地剥开棉铃子房（不能碰伤胚珠），取出 胚珠，轻轻放置于装有培养液的三角瓶中，使胚珠漂浮于液体的表面。

4）30℃恒温、黑暗、静置培养。

3、棉花纤维长度的测量

1）将上述体外培养6天的棉花胚珠从培养液中取出，放入70%酒精中浸泡5-10 分钟，除去酚类、糖类等粘性较大的物质。

2）小心用尖头镊子取出胚珠，在ddH₂O中轻轻晃动洗去酒精。

3）将胚珠置于涂有甘氨酸涂层的载玻片上，在体视镜下用解剖针轻轻的将纤维梳 开呈扇形。

4）在体视镜中观察并测量梳平纤维的长度。

三、实验结果

不同浓度的5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理棉花胚珠后，棉花纤维的长度变化见表2。

表2、添加不同浓度的5-杂氮-2'-脱氧胞苷对棉花纤维长度的影响（mm）

表2的结果表明：DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷可促进棉花纤维的伸长； 当在棉花胚珠的体外培养液中添加6μmol/L的5-杂氮-2’-脱氧胞苷时，棉花纤维最 长，是对照的2.39倍。

实施例2、DNA甲基化促进剂调控棉花纤维长度

一、实验材料：S-腺苷甲硫氨酸（SAM）；陆地棉品种徐州142。

二、实验方法

对棉花胚珠进行体外培养，在培养液中分别添加不同浓度的SAM，以未添加SAM 为对照（CK2）。每个浓度的处理设3个重复，每个重复20个胚珠。体外培养6天后， 测量棉花胚珠纤维长度。

棉花胚珠体外培养及纤维长度测量的方法与实施例1相同。

三、实验结果

不同浓度的SAM处理棉花胚珠后，棉花纤维的长度变化如表3所示。

表3、添加不同浓度的SAM对棉花纤维长度的影响（mm）

表3的结果表明：DNA甲基化促进剂SAM可抑制棉花纤维的伸长，在浓度未达到 产生毒性致死胚珠的前提下，SAM的浓度越高，抑制效果越明显。当在棉花胚珠的体 外培养液中添加15μmol/L的SAM时，棉花纤维最短，是对照的23.3%。