PGC-1的表达调控装置、以及缺血性疾病的治疗装置和治疗方法

摘要

本发明提供一种PGC-1的表达调控装置。PGC-1的表达调控装置(1)具备向作为受试者的生物体照射超声波的超声波发送部(14)。由此，可调控生物体内的PGC-1的表达，并促进VEGF参与的血管新生。其结果是，促进生物体内的血管新生，治疗缺血性疾病，而不会给患者带来过度的负担。

说明书

技术领域

本发明涉及一种PGC-1的表达调控装置、以及具有该PGC-1的表 达调控装置的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法。

背景技术

作为因血流的减少而产生的缺血性疾病，可举出：心绞痛、心肌梗塞、 脑梗塞、闭塞性动脉硬化症、慢性闭塞性动脉硬化症、柏格氏病等。慢性 闭塞性动脉硬化症(ASO：Arteriosclerosis obliterans)是主要是下肢的大 血管慢性地闭塞的疾病。ASO的症状是在轻症时有寒冷感，在重症时会发 展到下肢的坏死。柏格氏病(TAO：Thromboangiitis obliterans)有时也称 为血栓闭塞性脉管炎，是在四肢的主干动脉引起闭塞性的全层血管炎的疾 病。

ASO及TAO的治疗根据病状的发展来进行，在轻微病症的情况下， 通过抗血小板剂、鱼油、前列环素等的内服进行治疗，另外，通过前列腺 素E1制剂、抗凝血酶剂等的点滴进行治疗。病状进一步发展时，通过外 科手术开展的血管旁路、球囊扩张、支架植入等进行血管内治疗。

除这些治疗方法以外，还有通过向患部移植细胞、生理活性物质、支 架材料等，使陷入缺失或者功能不全的血管新生，实现血流的改善的血管 再生治疗。在促使血管新生的细胞治疗中，通过将骨髓细胞、末梢干细胞 (PBSCT：Peripheral blood stem cell transplantation)、末梢血单核球分为数 十处注入患部而进行治疗。另外，也通过肌肉注射使促进血管新生的激素 表达的基因(HGF、VEGF等)，进行实现血管新生的诱导的基因治疗。

另外，作为其他的血管新生治疗方法，在专利文献1中，记载有通过 向患部照射超声波，促进患部组织内的血管新生的技术。超声波治疗以利 用温热效果促进血流产生的治疗效果为目的，从很早开始就用于许多疾病 的治疗。例如在专利文献2中，记载有为了促进骨折治疗中的修复，而利 用超声波脉冲的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：天本国公表专利公报“特表2005-523132号公报(2005 年8月4天公开)”

专利文献2：美国专利第4530360号说明书(1985年7月23天)

非专利文献

非专利文献1：Zoltan Arany等人，nature，第451(21)卷，第1008 -1012页，2008年2月

非专利文献2：Jiandie Lin等人，nature，第418(15)卷，第797- 801页，2002年8月

发明概要

发明要解决的课题

缺血性疾病的病状发展时，通过上述的治疗方法来治疗，但在这些治 疗方法中，存在如下的问题。通过外科手术治疗时，由于是侵入性治疗， 有感染等风险，且患者的身体负担大。另外，通过对患处的细胞移植进行 治疗时，需要采集大量的骨髓及血液，患者的身体负担大。此外，关于生 理活性物质或者支架材料的移植，不仅移植材料的制作费用高昂，经济负 担大，而且在安全性或稳定性上还有疑问。另外，在基因治疗中，也存在 安全性或稳定性上的疑问或仅对重症患者适用等问题。

另外，如专利文献1所记载的利用超声波的治疗，由于并未阐明促进 血管新生的机理，因此，不能根据患者或病状将条件最优化，不仅难以进 行适当的治疗，而且治疗的有效性也不明了。本发明是为了解决上述问题 点而形成的，其目的在于提供一种可促进生物体内的血管新生、可以治疗 缺血性疾病，而不会给患者带来过度的负担的PGC-1的表达调控装置、 以及治疗装置和治疗方法。

解决本发明的手段

关于血管新生的机理，到目前为止进行了各种研究，公知的是上述基 因治疗所使用的血管内皮细胞生长因子(VEGF：Vascular endothelial growth  gactor)参与血管新生的机理。而且，VEGF的转录是利用转录因子即HIF (Hypoxia inducible factor)、或者转录辅激活因子即PGC-1(Peroxisome  proliferator activated receptorγcoactivator)来调节。

在非专利文献1中记载有PGC-1α不依存于HIF，而通过VEGF和 VEGF调节血管新生的技术、以及通过运动促使PGC-1α的转录的技术。 公知的是PGC-1存在于褐色脂肪或骨骼肌等各种各样的组织中，活化线 粒体生物合成以及氧化代谢(非专利文献2)。

本发明人等从独自的观点反复进行了锐意的研究，结果发现通过根据 超声波照射向生物体给予物理以及机械刺激，可促使PGC-1的表达，实 现经由PGC-1-VEGF级联的促使血管新生而展开的治疗，最终完成本 发明。

即，本发明的PGC-1的表达调控装置的特征在于：具备向受试者照 射超声波的超声波照射部件。另外，本发明的缺血性疾病的治疗装置的特 征在于：具备该PGC-1的表达调控装置。进而，本发明的缺血性疾病的 治疗方法的特征在于：包含向生物体照射超声波，促进PGC-1的表达的 表达促进步骤。

根据本发明的PGC-1的表达调控装置，由于具备向作为受试者的生 物体照射超声波的超声波照射部件，可以调控生物体内的PGC-1的表达。 由此，可以调控PGC-1参与的生物体反应，可以实现如VEGF的、PGC -1的更靠下游的因子的调控。因此，根据本发明的缺血性疾病的治疗装 置以及治疗方法，通过向生物体照射超声波，调控PGC-1的表达，可以 调控VEGF的表达，促进VEGF参与的血管新生。

这样，根据本发明的PGC-1的表达调控装置、具备该PGC-1的表 达调控装置的缺血性疾病的治疗装置以及治疗方法，不仅治疗经费低廉， 而且确立了安全性，且稳定性高，所以并不限定适用的患者。

另外，优选本发明的PGC-1的表达调控装置还具备调控上述超声波 照射部件的调控部件，以向上述生物体照射频率在0.5～3MHz±10％的范 围内的超声波。进而，优选在本发明的PGC-1的表达调控装置中，上述 调控部件以在平均1天20分～40分钟±10％的范围内向上述生物体照射超 声波的方式，调控上述超声波照射部件。根据上述的构成，能够更有效地 促进PGC-1的表达。

进而，优选在本发明的PGC-1的表达调控装置中，上述超声波照射 部件还具备与上述生物体经由介质非侵入性地接触，放出照射到上述生物 体的超声波的至少一个的超声波发射端子。由此，可以非侵入性地调控 PGC-1的表达，促进血管新生。

另外，优选本发明的PGC-1的表达调控装置具备调控部件，其以分 时依次驱动多个上述超声波发射端子的每个端子，使其发射超声波的方式 调控上述超声波照射部件。由此，超声波的能量不会集中照射在特定部位， 能够高效地向生物体照射超声波。

进而，优选本发明的缺血性疾病的治疗方法还包含向生物体照射频率 在0.5～3MHz±10％的范围内的超声波的超声波照射步骤。再者，优选本 发明的缺血性疾病的治疗方法，在上述超声波照射步骤中，在平均1天20～ 40分钟±10％的范围内向上述生物体照射超声波。由此，能够更有效地促 进生物体中PGC-1的表达，从而高效地治疗缺血性疾病。

另外，优选本发明的缺血性疾病的治疗方法，在上述超声波照射步骤 中，向上述生物体照射从多个超声波发射端子的各个端子以分时依次发射 的超声波。由此，照射的超声波的能量不会集中在生物体的特定部位，能 够高效地向生物体照射超声波。

进而，优选本发明的缺血性疾病的治疗方法，在上述超声波照射阶段 中，向上述生物体的患处照射超声波。这样，通过向作为治疗的受试者的 生物体的患处照射超声波，能够高效地治疗缺血性疾病。

发明效果

本发明的PGC-1的表达调控装置，由于具备向作为受试者的生物体 照射超声波的超声波照射部件，可以调控生物体内PGC-1的表达，由此， 起到促使VEGF参与的血管新生的效果。

附图说明

图1是表示本发明的PGC-1的表达调控装置的一实施方式的框图；

图2是表示本发明的PGC-1的表达调控装置的其他实施方式的框 图；

图3(a)及(b)是表示本发明的PGC-1的表达调控装置1的探头 的构成例的示意图；

图4是显示调查超声波照射产生的PGC-1α的表达量的变化的试验 结果的图；

图5是表示调查超声波照射产生的VEGFA的表达量的变化的试验结 果的图；

图6是表示调查超声波照射产生的VEGFB的表达量的变化的试验结 果的图；

图7是表示调查超声波照射产生的VEGFC的表达量的变化的试验结 果的图；

图8是表示调查超声波照射产生的HIF-1α的表达量的变化的试验 结果的图；

图9是调查血流恢复受到的超声波照射的影响的激光多普勒拍摄照 片；

图10是调查血流恢复受到的超声波照射的影响的激光多普勒拍摄照 片；

图11是调查血流恢复受到的超声波照射的影响的激光多普勒拍摄照 片；

图12是调查血流恢复受到的超声波照射的影响的激光多普勒拍摄照 片；

图13是调查血流恢复受到的超声波照射的影响的激光多普勒拍摄照 片；

图14是调查血流恢复受到的超声波照射的影响的激光多普勒拍摄照 片；

图15是表示调查血管新生受到的超声波照射的影响的苏木素-伊红 染色的结果的显微镜照片；

图16是表示调查血管新生受到的超声波照射的影响的苏木素-伊红 染色的结果的显微镜照片；

图17是表示调查血管新生受到的超声波照射的影响的苏木素-伊红 染色的结果的显微镜照片；

图18是表示调查血管新生受到的超声波照射的影响的碱性磷酸酶染 色的结果的显微镜照片；

图19是表示调查血管新生受到的超声波照射的影响的碱性磷酸酶染 色的结果的显微镜照片；

图20是表示调查血管新生受到的超声波照射的影响的碱性磷酸酶染 色的结果的显微镜照片；

图21是表示调查毛细血管密度比受到的超声波照射的影响的碱性磷 酸酶染色的结果的图表；

图22是表示调查PGC-1α的表达受到的超声波照射的影响的免疫组 织化学染色的试验结果的显微镜照片；

图23是表示调查VEGDA的表达受到的超声波照射的影响的免疫组 织化学染色的结果的显微镜照片；

图24是表示调查VEGFB的表达受到的超声波照射的影响的免疫组 织化学染色的结果的显微镜照片；

图25是表示调查VEGFC的表达受到的超声波照射的影响的免疫组 织化学染色的结果的显微镜照片；

图26是表示使用兔阴性对照抗体的免疫组织化学染色的结果的显微 镜照片；

图27是表示使用羊阴性对照抗体的免疫组织化学染色的结果的显微 镜照片；

图28是表示使用CD31抗体的免疫组织化学染色的结果的显微镜照 片；

图29是表示使用CD31抗体的免疫组织化学染色的结果的显微镜照 片；

图30是表示使用CD31抗体的免疫组织化学染色的结果的显微镜照 片；

图31是表示使用调查毛细血管密度比受到的超声波照射的影响的 CD31抗体的免疫组织染色的结果的图表。

符号说明

1、1a PGC-1的表达调控装置

10、10a  主体部

11用户界面

12调控器(调控部件)

13电源部

14超声波发送部(超声波照射部件)

15切换开关

20、20a探针

21探头(超声波发射端子)

具体实施方式

(PGC-1的表达调控装置)

(第一实施方式)

下面，参照图1，对本发明的PGC-1的表达调控装置的一实施方式 进行说明。图1是表示本发明的PGC-1的表达调控装置1的一实施方式 的框图。如图1所示，本发明的PGC-1的表达调控装置1由主体部10 以及探针20构成。主体部10具备用户界面(UI)11、调控器(调控部件) 12、电源部13以及一个以上的超声波发送部14(超声波照射部件)。探针 20具备一个以上的探头(超声波发射端子)21。探针20可以设于独立于 主体部10的外壳内，也可以与主体部10在同一外壳内，独立于主体部10 而设置。另外，也可以按照利用电缆等将探针20连接到主体部10上，且 可在探针20离开主体部10的位置进行工作的方式构成。

如图1所示，在主体部10上具备n个超声波发送部(超声波发送部 14～超声波发送部14n)。而且，与各超声波发送部相对应，在探针20上 具备n个探头(探头21～探头21n)。这里，n表示任意地设定的1以上的 整数。探头21～21n分别连接于超声波发送部14～14n。

由超声波发送部14～14n发送的超声波从各自连接的探头21～21n发 射，照射到作为照射受试者的生物体上。另外，分别同样地构成超声波发 送部14～14n，也分别同样地构成探头21～21n，因此，下面主要就超声 波发送部14以及探头21进行说明。

用户界面11也可以具备显示PGC-1的表达调控装置1的状态等的显 示部和接受来自用户的输入的输入部。用户界面11接受到来自用户的输入 后，将表示该输入的输入信号向调控器12发送，调控器12根据接收的输 入信号调控各构成要素。

另外，用户界面11接收由调控器12发送的表示PGC-1的表达调控 装置1的状态的信号，根据接收的信号，在显示部显示PGC-1的表达调 控装置1的状态。就用户界面11的输入部而言，例如也可以使用户能够输 入照射的超声波的频率或照射时间等。

调控器12调控PGC-1的表达调控装置1的各构成要素。调控器12 从超声波发送部14向探针20的探头21发送超声波，从探头21相对生物 体发射超声波。具体地说，调控器12从超声波发送部14的发送用振荡部 142输出超声波，从发送器141向探头21发送。另外，调控器12基于来 自用户界面11的用户的输入，调控自超声波发送部14的超声波的发送， 且以在用户界面11上显示PGC-1的表达调控装置1的状态等的方式进行 调控。进而，调控器12向发送用电源部140供给来自电源部13的电力。

另外，为了从探头21输出规定的值的超声波，调控器12调控自发送 用振荡部142的超声波的输出。为了得到期望的效果，将自探头21的超 声波的输出设定为恰当的值，调控器12以输出设定的值的超声波的方式 进行调控。另外，为了修正探头21的灵敏度偏差，调控器12也可以调控 超声波输出。超声波输出的调控是能够通过调控发送用振荡部142的振荡 频率或者调控从发送器143向探头21发送超声波时的发送电压等而进行。

电源部13向PGC-1的表达调控装置1的各构成单元供给电力。电源 部13向调控器12以及超声波发送部14的发送用电源部140供给来自商 用电源或者电池等的电力。

超声波发送部14具备发送用电源部140、发送器141以及发送用振荡 部142。发送用电源部140将自调控器12或者电源部13的电力供给到发 送器141。发送器141将从发送用振荡部142输出的超声波向探头21发送。 发送用振荡部142基于自调控器12的指示，振荡超声波，并向发送器141 输出。作为发送用电源部140、发送器141以及发送用振荡部142，可以 使用目前公知的电源部、发送器以及超声波振荡部等。

探头21向生物体发射自超声波发送部14的发送器141发送的超声波。 将PGC-1的表达调控装置1用于例如ASO的治疗装置时，由于ASO的 患处通常遍及大范围，因此优选大范围地照射超声波。由于在探针20上 具备多个探头21～21n，因此，图1所示的PGC-1的表达调控装置1能 够更大范围地照射超声波。

此时，构成为，将多个探头21～21n通过粘接等安装在例如硅材料那 样的具有柔性的材料上，且可覆盖患处。探头21对于生物体经由介质非 侵入性地接触，可以输出向生物体照射的超声波的方式设于探针20的外 壳内。关于探头21的构成的详细内容，将在后面进行描述。

为了输出规定的值的超声波，且为了修正超声波探头的灵敏度的偏 差，以及为了保持超声波输出的恒定，PGC-1的表达调控装置1也可以 具备监控自发送器141的超声波的发送的反馈机构。由此，向调控器12 反馈自发送器141发送超声波的发送状态，基于此，调控器12调控发送 用振荡部142以及发送器141的超声波的输出。

另外，为了检测探头21和患处的连接不良，也可具备监控自探头21 的超声波的输出的反馈机构。由此，将自探头21到患处的连接状态反馈 到调控器12或者发送器141，基于此，调控器12调控发送用振荡部142 以及发送器141的超声波的输出。

这样，PGC-1的表达调控装置1由于具备对生物体照射超声波的超 声波发送部14，因此能够调控在生物体上被照射超声波的患处的PGC-1 的表达。PGC-1是综合调控代谢的信号传递路径的转录辅激活因子。PGC -1起到了线粒体氧化代谢的调节或保持糖、脂肪以及能量平衡的作用， 作为其家庭成员，公知有相互有同源性的PGC-1α以及PGC-1β。

在利用本发明的PGC-1的表达调控装置1促进PGC-1的表达时， 通过PGC-1的表达促进而促进VEGF的转录。VEGF为参与血管新生的 因子，根据本发明，促进其家庭成员即VEGFA、VEGFB、VEGFC等的转 录。

公知的是PGC-1α的转录通过缺血或运动来促进，由此，促进VEGF 的转录而促使血管新生(非专利文献1)，但本发明人等最新发现通过超声 波照射会促进PGC-1的转录。根据本发明的PGC-1的表达调控装置1， 通过调控PGC-1的表达，能够调控VEGF的表达，因此可以调控VEGF 参与的血管新生。因而，能够恰当地用于缺血性疾病的治疗。

这里，在通过本发明的PGC-1的表达调控装置1进行的PGC-1的 表达调控以及由此产生的VEGF的表达调控，能够根据利用目前公知的方 法，测定超声波照射部位的PGC-1或者VEGF的表达量来进行确认。而 且，可以将测定的表达量反馈给调控器12，基于此，调控器12调控发送 用振荡部142以及发送器141进行的超声波的输出。

这里，在成为本发明的PGC-1的表达调控装置1的超声波照射的受 试者的生物体中，包含生物细胞、生物体组织、动物个体等。将本发明的 PGC-1的表达调控装置1的超声波照射的受试者当作生物细胞时，作为 该生物细胞的例子，可举出人类间充质干细胞(MSC)，进而，也能够将 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人主动脉平滑肌细胞(AoSMC)、鼠肌原 细胞株(C2C12)等作为受试者。

将本发明的PGC-1的表达调控装置1用于动物个体时，可以按照探 针20经由水、凝胶、偶联剂等介质，非侵入性地与覆盖患处的皮肤的表 面相接的方式，安装在生物体上而使用。将探针20安装在生物体上后， 从探头21向生物体输出由超声波发送部14向探头21发送的超声波。

这里，优选利用PGC-1的表达调控装置1照射到生物体的超声波的 频率在0.5～3MHz的±10％的范围内，进一步优选在1～2MHz的±10％的 范围内，最优选2MHz±10％。这里，“±10％”意思是误差范围，即，所谓“0.5～ 3MHz±10％的范围内”，意思包含0.5～3MHz的范围和其误差范围±10％。 即所谓“0.5～3MHz±10％也可以表示为“0.45～3.3MHz”。下面，在其他的 数值范围的记载中，也以同样的意思，使用“±10％”的表达。

另外，优选其照射时间在平均1天20分～40分钟的±10％的范围内， 最优选平均1天20分钟±10％。由此，能够更有效地促进PGC-1的表达。 再者，优选利用PGC-1的表达调控装置1照射到生物体的超声波的输出 为30mW/cm2±10％，占空比为10％±10％或20％±10％，PRF为1KHz±10％ 或100KHz±10％，但不限定于此。调控器12通过上述的频率、照射时间、 输出、占空比、以及PRF，向生物体照射超声波的方式，调控超声波发送 部14。

另外，调控器12也可调控超声波发送部14，以同一频率分时依次驱 动多个探头21～21n的每一个，使其发射超声波。例如，使用4个探头21 以PRF 1KHz和占空比20％照射超声波时，以如下方式进行调控，即：对 一个的探头21驱动200微秒，中止50微秒后，对另一个探头21驱动200 微秒，对4个探头21全部依次反复进行此驱动，控制总照射时间以及总 输出在上述范围内。对于探头21的驱动顺序，不做特别限定。通过这样 进行超声波照射，超声波的照射能量不会集中在特定部位，能够高效地将 超声波照射在生物体上。

(第二实施方式)

下面，参照图2对本发明的PGC-1的表达调控装置的其他实施方式 进行说明。图2是表示本发明的PGC-1的表达调控装置1a的其他实施方 式的框图。如图2所示，本实施方式的PGC-1的表达调控装置1a在超声 波发送部14为一个这一点和具备切换开关15这一点上，不同于第一实施 方式的PGC-1的表达调控装置1。在本实施方式中，仅就不同于第一实 施方式的方面详细地进行说明，省略其他的说明。

在PGC-1的表达调控装置1a中，利用主体部10a的一个超声波发送 部14，向探针20a的多个探头21～21n发送规定的超声波。从超声波发送 部14的发送用振荡部142振荡并向发送器141输出的超声波，在切换开 关15上以向多个探头21～21n发送规定的超声波的方式被切换，并发送 到各探头21。这样，由于具备多个探头21，一方面可实现大范围的超声 波照射，另一方面能够减少超声波发送部14的数量，能够实现主体部10a 的小型化及低成本的超声波照射。

(探头21)

接着，参照图3(a)及(b)，对PGC-1的表达调控装置1以及1a 的探针20或者20a具备的探头21的构成进行说明。图3(a)及(b)是 表示本发明的PGC-1的表达调控装置1以及1a的探头21的构成例的示 意图。图3中(a)表示探头21的上面图，图3中(b)表示探头21的剖 面图。

如图3(a)以及(b)所示，探头21在探头外壳210内具备多个振子 211和灵敏度数据存储元件212，它们用连接器213连接在一起。振子211 在外壳210内排列成两行三列而设置。另外，在本实施方式中，使用6个 元件排列成两行三列而设置振子211，但本发明不限定于此。外壳210是 由硅等而形成。如图3(a)以及(b)所示，为了增大与生物体的接触面 积，从而增大超声波的照射面积，优选探头21为矩形状。在探针20a中， 设有多个矩形状的探头21，使邻接的探头21相互地连接而形成。

多个振子211分别接收从超声波发送部14发送的超声波而振动，向生 物体照射超声波。灵敏度数据存储元件212收藏探头21的灵敏度数据并 存储。存储在每个各探头21的灵敏度数据被反馈到调控器12或者发送器 141，基于此，修正探头的灵敏度偏差。另外，探头21也可以具备收藏表 示探头的灵敏度分类的数据的元件，并将该数据反馈到调控器12等，以 修正灵敏度偏差。

(缺血性疾病的治疗装置和治疗方法)

本发明的缺血性疾病的治疗装置具备上述本发明的PGC-1的表达调 控装置1。本发明的缺血性疾病的治疗方法包含对生物体照射超声波而促 进PGC-1的表达的表达促进步骤。另外，本发明的缺血性疾病的治疗方 法可以还包含向生物体照射超声波的超声波照射步骤。在本发明的缺血性 疾病的治疗方法中，表达调控步骤和超声波照射步骤可以利用本发明的 PGC-1的表达调控装置1进行。

成为本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法的治疗的受试者的 疾病没有特别限定，只要是因血流的减少而产生的缺血性疾病，且能够通 过调控PGC-1的表达而发挥治疗效果的疾病即可。例如，可举出心绞痛、 心肌梗塞、脑梗塞、闭塞性动脉硬化症、慢性闭塞性动脉硬化症(ASO)、 柏格氏病(TAO)等，尤其是可以恰当地用于ASO、TAO等重症缺血性末 梢血管疾病的治疗。

在本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法中，向成为治疗受试者 的生物体的缺血性疾病部位(患处)照射超声波，调控PGC-1的表达， 从而促进VEGF参与的血管新生，治疗如上所述的缺血性疾病。本发明的 缺血性疾病的治疗装置和治疗方法进行的PGC-1的表达的调控，可以通 过从本发明的PGC-1的表达调控装置1的超声波发送部14向生物体的患 处照射超声波来进行。

在本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法中，优选向生物体照射 的超声波的频率在0.5～3MHz的±10％的范围内，进一步优选1～2MHz 的±10％的范围内，最优选2MHz±10％。另外，优选其照射时间在平均1 天20分～40分钟的±10％的范围内，最优选为平均1天20分钟±10％。另 外，在本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法中，优选向生物体照射 的超声波的输出为30mW/cm2±10％、占空比为10％±10％或20％±10％， PRF为1KHz±10％或100KHz±10％，但不限定于此。

另外，在本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法中，也可以向生 物体照射从多个探头各自分时依次发射的超声波。由此，超声波的照射能 量不会集中在特定部位，可以高效地向生物体照射超声波。

本发明的缺血性疾病的治疗装置能够以PGC-1的表达调控装置1的 探针20与覆盖患处的皮肤的表面接触的方式，安装在生物体上而使用。 在将探针20安装在生物体上后，从探头21向生物体输出从超声波发送部 14向探头21发送的超声波。

在本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法中，优选向生物体的患 处整体照射超声波。因而，成为治疗的受试者的患处涉及大范围时，用一 次照射不能向患处整体照射超声波，因此，在第一次超声波照射之后，卸 下探针20，安装在其他部位进行第二次超声波照射，反复此过程，直至患 处整体照射到超声波即可。在本说明书中，所谓“患处”意思是产生了疾病 的部分(观察到病状的部分)，所谓“患处整体”意思是在一定范围内产生了 疾病的部分的全部。

在本发明的缺血性疾病的治疗方法中，可以进一步包含确认治疗效果 的阶段。在该阶段中，可以通过测定超声波照射部位的PGC-1或者VEGF 的表达量，确认治疗效果。

根据本发明的缺血性疾病的治疗装置和治疗方法，通过向患处非侵入 性地照射超声波，且调控PGC-1的表达，促进VEGF参与的血管新生， 因此，可以不会给患者带来过度的负担而进行治疗。另外，不仅治疗经费 低廉，还确立了安全性，且稳定性高，所以不限定适用患者。

实施例

(实施例1)

使用人类间充质干细胞(MSC)，对超声波照射产生的PGC-1和 VEGF的表达量的变化进行调查。

在六孔板上培养人类间充质干细胞(R17，R22，R37，R44)(自患者 肠骨髓采集)48小时，使其变成分汇合(subconfluent)。之后，将细胞在 血清饥饿状态下放置15小时(0.1％BSA)。

其次，将细胞分别接种在两个10cm的皿中，用含有10％FBS(Biowest 制造)的低葡萄糖DMEM培养基(SIGMA制造；D6046)培养并继代后， 分到5个皿中。在达到95％汇合时，去除培养基，在PBS中将细胞洗净， 加入2mL的0.05％胰岛素/0.02％EDTA，放置3分钟。之后，加入含有 10％FBS(Biowest制造)的低葡萄糖DMEM培养基(SIGMA制造；D6046) 8mL，将50mL细胞悬浮液转移到管中。

将包含该细胞悬浮液的管进行离心分离(在1100rpm下5分钟)后， 去除上清液，使其再次悬浮在包含适量的10％FBS(Biowest制造)的低 葡萄糖DMEM培养基(SIGMA制造；D6046)中，成为50％汇合。将每 个2mL的该再悬浮液接种在六孔板中，用CO₂培养箱进行培养。培养两 天后，去除培养基，用PBS清洗两次后，添加含有0.1％BSA的低葡萄糖 DMEM培养基2mL，置于血清饥饿状态下。

置于血清饥饿状态下16小时后，对超声波照射群的细胞在频率 (1MHz、1.5MHz、2MHz及3MHz)、输出(30mW/cm2)、占空比(20％)、 PRF(1KHz)的条件下，用具备四个探头21的图1所示的装置进行超声 波照射。超声波的照射以如下方式进行，即：将第一个探头21驱动200 微秒，中止50微秒后，将其他的第二个探头21驱动200微秒，对四个探 头21全部依次反复进行此过程，以使总照射时间和总输出成为上述值。 具体地说，将图1所示的装置放置在搪瓷盆中，向搪瓷盆内装满水，使接 种了细胞悬浮液的六孔板漂浮在该搪瓷盆内的水上，用水进行偶合，从该 装置向细胞照射超声波。从超声波照射开始，分别在1、3、6、9、以及 12小时后去除培养基，用PBS清洗细胞两次。

清洗后，添加0.6mL溶液I(罗氏RNA分离试剂盒，Roche制造)， 用吸量管进行混合。之后，回收细胞，直至RNA提取，一直在-80℃下 冷冻保存样品。也同样地准备不照射超声波的对照细胞。

使用高纯RNA分离试剂盒，从冻结保存的样品中，按照罗氏分离试 剂盒说明书提取总RNA。

将提取的RNA500μg放入反应板，加入无核糖核酸酶/脱氧核糖核酸 酶的水，以使液量成为10μL。进一步加入1μL的引物20(2pmol/μL)， 在65度下，使RNA变性5分钟。RNA变性后，将板快速地回归常温后， 离心分离1分钟。进而，加入9μL表1中表示的RT-PCR反应液并搅拌， 进行离心分离。使其在42度下反应20分钟，在99度下反应5分钟，进 行RT-PCR。使用ReverTraAce(注册商标)(TOYOBO制造)作为逆转 录酶。

表1

将RT-PRC步骤后的反应液离心分离，加入80μL的无核糖核酸酶/ 脱氧核糖核酸酶的水，进行搅拌。将得到的2μL的cDNA放入添加了8μL 表2中所示的实时荧光定量PCR反应液的板的各孔中，搅拌后，在 4000rpm下离心分离10分钟。使离心分离后的反应液在95度下反应10分 钟后，直至最大至45个周期，使其在95度下10秒钟，在60度下反应25 秒钟，进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR是使用Light Cycler 480

II进行的。对于通过实时荧光定量PCR增幅后的cDNA，将HPRT1基因 作为内部标准，对PGC-1α、VEGF-A、VEGF-B以及VEGF-C的RNA 表达量进行定量。

表2

结果如图4～7所示。在图4～7中，将超声波照射后的细胞中的基因 的转录量，作为相对于未超声波照射的对照细胞中的基因的转录量的相对 比来表示。

如图4所示，将对照细胞的PGC-1α的RNA表达量(HRPT1比)设 为1时、超声波照射细胞的PGC-1α的RNA表达量的相对比，在超声波 的频率1MHz～3MHz的任一个之下，超声波照射6小时后均增加。另外， 如图5～7所示，VEGF-A、VEGF-B及VEGF-C各自的RNA表达量 也因超声波照射而增加。

(比较例1)

在与实施例1同样地制备的人类间充质干细胞中，与实施例1同样地 调查超声波照射引起的HIF-1α的表达量的变化。将结果示于图8。如图 8所示，HIF-1α的RNA表达量并未因超声波照射而变化。

(实施例2)

使用血管新生模型小鼠，调查超声波照射引起的PGC-1以及VEGF 的表达量的变化。

从Santa Cruz Biotechnology社购入抗兔PGC-1抗体(sc-13067)、 抗兔VEGF抗体(sc-152)、抗羊VEGF-B抗体(sc-1876)、以及抗羊 VEGF-C抗体(sc-1881)。从BD Pharmingen社购入抗CD31抗体。从 株式会社NICHIREI BIOSCIENCES社购入Histofine单染色小鼠MAX- PO(R)(Histofine Simple Stain mouse MAX-PO(R))、Histofine单染色 小鼠MAX-PO(山羊)(Histofine Simple Stain mouse MAX-PO(Goat))、 单染色DAB(Simple StainDAB)溶液。从Sigma-Aldrich社购入碱性磷 酸酶染色试剂盒。

由天本Charles River株式会社购入小鼠(C57B6/6J、、8周)。按 照常规方法进行血管新生模型小鼠的制作(参考文献1：Am J Pathol 1998. 152：1667-1679)。向实施了血管新生模型小鼠的缺血处理的腿(患病腿) 上涂敷偶联剂，经由该偶联剂从图1所示的装置向患病腿照射超声波。除 将照射的超声波的频率设定在1MHz及2MHz以外，在与实施例1同样的 条件下进行超声波照射。在超声波照射的前一天以及超声波照射开始天的 1天后、4天后、7天后、11天后、14天后、18天后、21天后、25天后以 及28天后，通过激光多普勒血流解析(Moor LDI；Moor Instruments， Axminster，UK)，对血流恢复进行评价。

结果如图9～14所示。图9表示在频率1MHz下照射超声波的个体ID10 的结果，图10表示在频率1MHz下照射超声波的个体ID15的结果。图11 表示在频率2MHz下照射超声波的个体ID20的结果，图12表示在频率 2MHz下照射超声波的个体ID21的结果。图13表示未照射超声波的对照 个体ID26的结果，图14表示未照射超声波的对照个体ID7的结果。

如图9～12的各激光多普勒拍摄照片所示，对于在频率1MHz下照射 超声波的个体ID10和ID15、以及在频率2MHz下照射超声波的个体ID20 和ID21，直到第28天，确认得到充分的血流恢复。另一方面，如图13及 14的各激光多普勒拍摄照片所示，对于未照射超声波的对照个体ID26和 ID7，直到第28天，不能确认得到充分的血流恢复。

在处理小鼠时，使用实验动物用气体麻醉系统(DS PHARMA制造)， 在异氟醚(ABBOTT JAPAN株式会制造)吸入麻醉下进行。在第28天的 激光多普勒血流解析后，通过在戊巴比妥(25mg/kg)麻醉下，进行颈动 脉切断以及除血，使小鼠死亡。之后，迅速地摘取两腿的大腿肌，放到盛 有6％黄蓍胶的5mm软木之上，在用液体氮冷却的异戊烷中急 速冷冻。将冻结组织保存在塑料瓶内，在-80℃下保管直到切薄片。

(苏木素-伊红染色)

将在-80℃下保存的冻结组织在低温恒温器(LEICA CM1950)内 回升到-25℃，以成为5μm的厚度的方式切成薄片。将薄片组织切片粘接 到APS涂层载玻片(S8441；松浪硝子工业株式会制造)上。在室温下风 干30分钟，在10％中性缓冲福尔马林溶液中(062-01661；和光纯药工 业株式会制造)下固定10分钟。将固定后的组织切片用迈尔氏苏木素 (Sakura Finetek Japan株式会制造)染色12分钟后，进行温水显色，再 在伊红(Sakura Finetek Japan株式会制造)中染色10分钟后，用流动水 进行水洗。对染色后的组织切片进行脱水和透明处理，并封固。对封固的 组织切片，通过倒置光学显微镜(OLYMPUS IX81)拍摄显微镜照片。

结果如图15～17所示。

如图15～17所示，在各标本上显示肌纤维的截面，也确认到血管组 织。因而，使用这些个体的标本，进行如下所示的碱性磷酸酶染色和免疫 组织染色，观察血管新生。另外，为了确认血管数的增加，通过免疫组织 染色观察作为血管内皮的标记的CD31的增加。

(碱性磷酸酶染色)

将在-80℃下保存的冻结组织在低温恒温器(LEICA CM1950)内 回升到-25℃，以成为5μm的厚度的方式切薄片。将切薄组织切片粘接到 APS涂层载玻片(S8441；松浪硝子工业株式会制造)上。在室温下风干 30分钟，用碱性磷酸酶染色试剂盒，按照常规的方法进行碱性磷酸酶染色。 对染色后的组织切片，用倒置光学显微镜(OLYMPUS IX81)拍摄显微 镜照片(图18～20)。

如图18～20所示，对于在频率1MHz下照射超声波的个体ID15、ID10、 和ID16、以及在频率2MHz下照射超声波的个体ID21、ID20、和ID19， 观察到血管新生，对于未照射超声波的对照个体ID7、ID26和ID4，未观 察到血管新生。

另外，用同照片图像所包含的肌纤维数除以从得到的照片图像对得到 ALP酶阳性反应进行计数的点数，对每一个腿各取五个视野进行计数，求 其平均值。用从另一未实施缺血处理的腿(健康腿)得到的平均值，除以 从患病腿得到的平均值，进行标准化处理。结果如图21所示。

图21是将患病腿相对于健康腿的毛细血管密度比图表化的图。如图 21所示，在超声波照射群中确认到大量的血管新生，而对于未照射超声波 的对照个体ID7、ID26和ID4，确认到的血管新生很少。

(免疫组织化学染色)

将一直在-80℃下保存的冻结组织(缺血侧下肢)在低温恒温器 (LEICACM1950)内回升到-25℃，以成为5μm的厚度的方式切薄片。 将切薄片组织切片粘接到APS涂层载玻片(S8441；松浪硝子工业株式会 制造)上。在室温下干燥30分钟，在10％中性缓冲福尔马林液中固定10 分钟。用TBST充分清洗，通过1.5％过氧化氢加甲醇处理，使内在性过氧 化物酶失活。用TBST充分清洗后，使用溶解于TBST中的0.5％封闭剂 (1096176；Roche Diagnostics株式会社)，在室温下封闭处理1小时。

将用0.5％封闭剂/TBST适当地稀释了的各种一次抗体，滴在组织切 片上，在4℃下进行一夜抗原-抗体反应。用TBST将组织切片充分地清 洗后，用各种Histofine单染色(Simple Stain)，按照常规的方法进行处理。 在用TBST充分地清洗过的组织切片上滴下简单染色DAB溶液，使其在 室温下反应5～20分钟后，用流动水进行清洗，使反应停止。用蒸馏水进 一步清洗组织切片后，在5倍稀释了的迈尔氏苏木素中反应30分钟，进 行温水显色。进行组织切片的脱水、透明处理，并进行封固。对封固的组 织切片，利用倒置光学显微镜(OLYMPUS IX81)拍摄显微镜照片。结 果如图22～27所示。

图22是表示使用抗兔PGC-1抗体并确认PGC-1α的表达的结果的 照片图，图23是表示使用抗兔VEGFA抗体并确认VEGFA的表达的结果 的照片图。作为它们的阴性对照，在图26中，表示使用兔阴性对照抗体 的结果。另外，图24是表示使用抗羊VEGF-B抗体并确认VEGFB的表 达的结果的照片图，图25是表示使用抗羊VEGF-C抗体并确认VEGFC 的表达的结果的照片图。作为它们的阴性对照，在图27中，表示使用羊 阴性对照抗体的结果。

如图22～25所示，对于在频率1MHz下照射超声波的个体ID15、ID10、 和ID16、以及在频率2MHz下照射超声波的个体ID21、ID20、和ID19， 分别确认到PGC-1α、VEGFA、VEGFB、和VEGFC的表达。另一方面， 对于未照射超声波的对照个体ID7、ID26和ID4，PGC-1α和VEGFA的 表达比超声波照射个体少，另外，VEGFB和VEGFC的表达与超声波照射 个体相同。

另外，图28～30是表示通过立式光学显微镜(OLYMPUS IX81)对 于使用CD31抗体并同样地进行了免疫组织化学染色的组织切片所拍摄的 显微镜照片。另外，同样与用上述碱性磷酸酶染色得到的切片，对得到 CD31阳性反应的点数进行计数，将相对于健康腿的患病腿的毛细血管密 度比图表化(图31)。

如图28～30所示，对于在频率1MHz下照射超声波的个体ID15、ID10、 和ID16、以及在频率2MHz下照射超声波的个体ID21、ID20、和ID19， 在患病腿上确认到大量CD31阳性反应。另一方面，未照射超声波的对照 个体ID7、ID26和ID4的患病腿上的CD31阳性反应的数很少。如图31 所示，基于得到了CD31阳性反应的点数的毛细血管密度比，相对于未照 射超声波的对照群来说，超声波照射群一方的毛细血管密度比较高。

产业上的可利用性

本发明的PGC-1α的表达调控装置，能够通过调控生物体内的PGC -1α的表达，而调控VEGF的表达量，促进血管新生，所以能够应用于如 慢性闭塞性动脉硬化症(ASO)或柏格氏病这样的缺血性疾病的治疗装置。