具有提高的生产丁醇能力的重组微生物和使用其生产丁醇的方法

摘要

本发明涉及具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，和使用其生产丁醇的方法。更具体来说，本发明涉及生产丁醇的能力通过操纵它们的代谢网络而提高的重组微生物和使用其生产丁醇的方法。该具有提高的生产丁醇能力的重组微生物包括在具有参与乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路径的酶的编码基因的宿主微生物中，编码将乙酰CoA转化成乙酸的酶的基因被删除。通过操纵微生物的代谢流获得的重组微生物能够以高选择性地生产丁醇，因此可用作用于生产工业溶剂和运输燃料的微生物。

说明书

技术领域

本发明涉及具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，和使用其生产丁 醇的方法。更具体来说，本发明涉及生产丁醇的能力通过操纵它们的代谢 网络而提高的重组微生物和使用其生产丁醇的方法。

背景技术

近来油价上升引发了对替代燃料如生物燃料的越来越多的兴趣。而 且，对具有比乙醇更优异的物理性质的汽油替代品-丁醇有越来越多的兴 趣，因此对生产溶剂如丁醇作为代谢产物的梭菌种(Clostridium sp.)菌株也 有越来越多的兴趣。

已知梭菌种的微生物是革兰氏阳性、严格厌氧的形成芽孢的细菌，并 且主要产生乙酸和丁酸作为发酵产物。其中，一些菌株引发丙酮-丁醇-乙 醇发酵(下文称作ABE发酵)，该发酵除上述有机酸外还产生丙酮、丁醇和 乙醇。

实际上，在20世纪早期，作为这样的菌株之一的丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)被用于大量地生产丙酮和丁醇。这种大规模生 产持续到1960年代和1970年代，但除了在一些国家外，这种生产都中断 了，因为由原油产生的丙酮和丁醇由于化学工艺的发展而变得廉价，以及 难以供应底物。

至今仍利用梭菌种菌株进行的生物丁醇生产产生以下问题。首先，与 基于酵母的生物乙醇生产相比，其表现出显著低的收率和生产效率。其 次，梭菌种菌株除产生作为生物燃料的非常有价值的丁醇外，还产生副产 物，包括丙酮、乙酸和丁酸，这提高了它们的分离成本。

在产生溶剂的梭菌种菌株中，如同一般的微生物发酵，有机酸的产生 在指数生长期发生。这个阶段被称为产酸阶段。随着静止期到来，细胞代 谢转变为产溶剂阶段，在此阶段有机酸被再吸收并且产生溶剂如丙酮(或异 丙醇)、丁醇和乙醇。这可以解释如下。随着静止期到来，pH值降低，因 此未解离有机酸的浓度增加。在这些酸中，未解离的丁酸表现出高细胞毒 性。通过有机酸的这一再吸收以及转化为溶剂，细胞获得时间而形成可以 在严酷环境下长期存活的芽孢。

在野生型菌株中，发酵后以约为3:6:1的质量比产生丙酮、丁醇和乙 醇，并且还产生痕量的乙酸、丁酸和乙偶姻。已知葡萄糖用作底物时，在 最终浓度约10g/L时以约为20-25%的质量收率生产丁醇(Lee等人， Biotechnol.Bioeng.，101(2):209-228，2008)。当采用这种野生型菌株生产 丁醇时，存在产量及产率低以及难于从其它代谢产物中分离出丁醇的问 题，因此增加了生产成本。

为此，近年来，致力于基于基因工程知识和工具，利用按需操纵代谢 路径的代谢工程途径来制作改进的菌株。对于丙醇丁醇梭菌，其产生代谢 产物的路径已长期为人所知，并且其基因组已被测序，且其相应的基因被 全部鉴定(Nolling等人，J.Bacteriol.2001)。

丁醇生产中问题最大的代谢物是丙酮。如果使用气提进行溶剂分离， 那么丙酮和丁醇作为混合物被分离，因为不像有机酸，它们都容易蒸发， 因此需要额外的分离过程。乙酰乙酰-CoA通过CoA移转酶和乙酰乙酸脱 羧酶转化成丙酮。这些酶分别由基因ctfAB和adc表达。所以，通过删除一 种或多种这些基因，丙酮在溶剂中的浓度可以被降低。根据最近的报道， 发现删除adc可以降低丙酮浓度，确实可以降低丙酮比例(Jiang等人， Metab.Eng.，11(4-5):284-291，2009)。

而且，在梭菌种的情况下，有这样的例子，其中通过单交换插入质粒 删除表达磷酸转乙酰酶的基因pta(磷酸转乙酰酶为乙酸生产路径的酶)和表 达丁酸激酶的基因buk(Green等人，Microbiology.142:2079-2086，1996)。 但是，有报道，当删除编码丁酸激酶的基因buk时，丁醇浓度增加至约16 g/l，但是当删除编码磷酸转乙酰酶的pta基因时，丁醇的浓度为9.9g/l， 表明丁醇的浓度和丁醇的选择性没有实质的增长。

WO2008/052973公开了其中丁酸生产路径和乙酸生产路径被阻断的菌 株，以及其中丁酸生产路径、丙酮生产路径和乙酸生产路径被阻断的菌 株。但是，必须阻断丁酸生产路径，因此，当仅删除乙酸生产路径时，无 法确定产生丁醇的能力是否增加。另外，WO2008/052973公开了基于buk 或ptb的删除的各种基因组合的删除，但其实例示出的仅为通过删除buk 基因获得的已知的结果，并且该专利文件公开了涉及删除各种基因组合的 实例。换言之，该专利文件总体上仅提出了基于buk或ptb删除的可能的 各种基因组合的删除，并没有提供科学实验基础，但这不可能确定这些删 除能否有助于实际丁醇生产中浓度、收率、选择性等的提高。

所以，根据迄今为止的报道，没有证据显示pta删除有助于提高丁醇 的浓度和产量。此外，因为没有关于pta删除的信息，所以不清楚在删除 了pta的突变菌株中删除buk会有预期的结果。而且，如果参与丁酸生产 的buk基因和参与乙酸生产pta基因都被删除，可以预期将不会产生丁酸 或乙酸，因此丁醇的收率将提高(WO2008/052973)，但这不是令人期待的 结果(参见以下详细说明)。

由此，本发明人发现，当在梭菌种的微生物中删除编码将乙酰CoA转 化成乙酸的酶的基因时，丁醇的选择性和收率提高，表明该微生物生产丁 醇的能力提高，从而完成了本发明。

另外，本发明人构建出这样的微生物，其通过在删除了pta的突变菌 株中删除buk基因，高浓度、高收率和高选择性地生产丁醇，该突变菌株 中具有改进的丁醇选择性和收率并扩增了醛/醇脱氢酶，并发现，该构建的 微生物能够高浓度、高收率和高选择性地生产丁醇，从而完成了本发明。

而且，本发明人构建了这样的菌株，其通过在删除了pta和buk且扩 增了醛/醇脱氢酶的突变菌株中删除编码丁酸激酶的bukII基因，高浓度、 高收率和高选择性地生产丁醇，且不会显著产生有机酸，并已证实该菌株 生产丁醇的能力，从而完成了本发明。

此外，本发明人构建了这样的菌株，其通过在删除了pta、buk和bukII 且扩增了醛/醇脱氢酶的突变菌株中删除编码CoA移转酶(CoAT)的ctfB基 因，高浓度、高收率和选择性地生产丁醇，且不会显著产生有机酸，并且 证实了该菌株生产丁醇的能力，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供以高效率选择性地生产丁醇，同时减少副产物的 产生的重组微生物，以及该重组微生物的制备方法。

本发明的另一目的是提供使用所述重组微生物生产丁醇的方法。

为了实现以上目的，本发明提供了用于制备具有提高的生产丁醇能力 的重组微生物的方法，该方法包括，在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合 成路径的宿主微生物中，删除将乙酰CoA转化成乙酸的酶的编码基因。

本发明还提供具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，其中在具有乙 酰CoA和丁酰CoA生物合成路径的宿主微生物中，编码将乙酰CoA转化 成乙酸的酶的基因被删除。

本发明还提供具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，其中在梭菌种 的微生物中，编码磷酸转乙酰化酶的基因(eutD或pta)或编码乙酸激酶的基 因(askA或ackA)被删除。

本发明还提供重组微生物丙醇丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824 ΔeutD、丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh、丙醇丁 醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*、丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh*和丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*，它们都具有提高的生产丁醇的能力。

本发明还提供生产丁醇的方法，包括以下步骤：培养所述重组微生物 以生产丁醇；和从培养基回收生产出的丁醇。

本发明的其它特征和实施方式将从随后的详细的说明书以及所附权利 要求而更明显。

附图说明

图1是丙醇丁醇梭菌菌株的代谢网络。

图2是根据本发明的一种实施方式制备的基因缺失的载体(pCACKO) 的基因图谱。

图3是根据本发明的一种实施方式制备的质粒pIMP1PbAdhE1的基因 图谱。

具体实施方式

在本发明中，在图1中所示的丙醇丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 的代谢网络中删除乙酸合成路径，并检验重组菌株生产丁醇的能力是否提 高。

在本发明的一个实例中，通过从丙醇丁醇梭菌ATCC 824删除编码磷 酸转乙酰化酶的基因来构建重组微生物，所述编码磷酸转乙酰化酶的基因 参与乙酰CoA到乙酸的转化，并且确认了该重组微生物生产丁醇的能力提 高。

在一方面，本发明涉及用于制备具有提高的生产丁醇能力的重组微生 物的方法，该方法包括：在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路径的宿 主微生物中，删除将乙酰CoA转化成乙酸的酶的编码基因，以及本发明涉 及通过所述方法制备的具有提高的生产丁醇能力的重组微生物。

如本文所使用的，术语“生物合成路径”是指包括由细胞中的特定代谢 物合成目的化合物的路径，而不只限于通过相关过程(糖酵解)提供的碳来 合成目的化合物的路径。

如本文所使用的，术语“删除”是指包括突变、替换或删除目的基因的 一部分，或将一个或多个碱基引入该基因，或引入抑制目的酶的表达或活 性从而抑制该酶活性的基因、酶或化学物质。因此，删除特定基因的方法 不限于任何特定方法，只要该特定目的基因的活性以及由该基因编码的酶 的活性被常规方法抑制，所述常规方法包括通过反义RNA的表达抑制、同 源重组、通过各种重组酶(λ重组酶等)表达的同源重组、以及利用逆转录酶 和RNA的特定序列插入。

在本发明中，“具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路径”不仅指菌株原 本具有该生物合成路径，而且还指外源基因通过包括重组和基因组重排在 内的技术被引入。

在本发明中，具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路径的宿主微生物 可生产选自丙酮、乙醇、丁醇和异丙醇中的一种或多种。

在本发明中，宿主微生物可源自梭菌种，但不限于此，只要其具有编 码参与乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路径的酶的基因。

梭菌种微生物的实例包括丙醇丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium  beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、Clostridium  saccharoperbutylacetonicum、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤 风梭菌(Clostridium tetani)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、丁酸梭菌 (Clostridium butyricum)、丁基梭菌(Clostridium butylicum)、科氏梭菌 (Clostridium kluyveri)、酪丁基梭菌(Clostridium tyrobutylicum)、酪丁酸梭菌 (Clostridium tyrobutyricum)等。

在本发明中，仅示例了丙醇丁醇梭菌ATCC 824作为来自梭菌种的宿 主微生物，但丙醇丁醇梭菌M5、1NYG、4NYG、5NYG和DG1(Stim- Herndon,K.P.等人，Biotechnol./Food Microbiol.,2:11,1996)，丙醇丁醇梭菌 ATCC 824IV型、M3、M5、2-BB R、2-BB D、Rif B12、Rif D10、Rif F7 和丙醇丁醇梭菌ATCC 860(Clark,S.W.等人，Appl.Environ.Microbiol., 55:970,1989)也可用于本发明。

在本发明中，将乙酰CoA转化成乙酸的酶可为磷酸转乙酰化酶或乙酸 激酶，编码磷酸转乙酰化酶的基因可为eutD或pta，并且编码乙酸激酶的 基因可为askA或ackA。

在本发明中，删除基因的方法没有特别限定，只要抑制由目的基因编 码的酶的活性。

在一种实施方式中，在通过双交换进行同源重组的方法中，将抗生素 抗性基因插入具有目的基因的碱基序列的基因片段中以使该基因片段失 活，之后将失活的基因片段引入微生物菌株中使得在染色体中的目的基因 和失活的基因片段之间发生双交换重组，由此在微生物的染色体中的目的 基因失活。

在另一种实施方式中，在利用逆转录酶和RNA插入特定序列的方法 中，在目的基因中发现逆转录酶结合位点，之后，通过逆转录酶和在RNA 转录位点表达的RNA的复合物，将部分RNA插入目的基因中，由此可以 抑制目的酶的活性，从而使目的基因失活，该RNA转录位点被与结合位点 相邻的序列所替代。

在本发明的一个实例中，构建了磷酸转乙酰化酶的编码基因(eutD)被 删除的重组微生物，并证实，所构建的重组微生物具有提高的生产丁醇的 能力。

在本发明的另一实例中，通过以下方式构建重组微生物：(A)在磷酸 转乙酰化酶的编码基因(eutD)被删除的重组微生物中，删除分别编码将丁 酰CoA转化成丁酸的磷酸转乙酰化酶和丁酸激酶的基因(ptb)或基因 (buk/bukII)，和(B)扩增该重组微生物中的醛/醇脱氢酶，证实了所构建的重 组微生物具有提高的生产丁醇的能力和降低的生产丙酮、丁酸和乙酸的能 力。此外，构建了其中(C)编码CoA移转酶(CoAT)的ctfA或ctfB被删除的 重组微生物，并证实了所构建的重组微生物具有高浓度、高收率和高选择 性地生产丁醇而基本不产生有机酸的能力。

因此，在本发明中，制备具有提高的生产丁醇能力的重组微生物的方 法包括：在分别编码将乙酰CoA转化成乙酸的磷酸转乙酰化酶和乙酸激酶 的eutD(pta)和ack基因中的一种或多种被删除的微生物菌株中，删除选自 以下的一种或多种基因：(a)编码分别将乙酸和丁酸转化成乙酰CoA和丁酰 CoA、并将乙酰乙酰CoA转化成乙酰乙酸的酶的基因，(b)编码将丁酰CoA 转化成丁酸的磷酸转乙酰化酶的基因，和(c)编码丁酸激酶的基因；以及扩 增该菌株中的醛/醇脱氢酶。

分别将乙酸和丁酸转化成乙酰CoA和丁酰CoA、并将乙酰乙酰CoA 转化成乙酰乙酸的酶是CoA移转酶，并且编码CoA移转酶的基因是ctfAB 或atoDA。

编码将丁酰CoA转化成丁酸的磷酸转乙酰化酶的基因是ptb。

编码丁酸激酶的基因是选自buk和bukⅡ的一种或多种。

编码醛/醇脱氢酶的基因是adhE1或adhE2，该基因的实例还包括其突 变体。具体来说，该突变体优选含有在由adhE1编码的蛋白质(SEQ ID NO: 51)的氨基酸残基450-650中的一个或多个突变。

在本发明的再一实例中，通过在其中编码磷酸转乙酰化酶的基因(eutD) 被删除的重组微生物中删除编码将丁酰CoA转化成丁酸的酶的基因(buk和 /或bukII)来构建重组微生物，以及，通过在该重组微生物进一步删除编码 CoA移转酶的ctfA或ctfB来构建重组微生物。此外，通过将编码乙醛/乙醛 脱氢酶的基因(adhE1)引入所构建的重组微生物中来构建重组微生物。证实 了所构建的重组微生物具有提高的生产丁醇的能力和降低的生产丙酮的能 力。

因此，本发明涉及制备重组微生物的方法，该方法包括：在具有乙酰 CoA和丁酰CoA生物合成路径的宿主微生物中，删除编码转化乙酰CoA 的酶的基因和编码将乙酰CoA转化成乙酸的酶的基因，然后在该宿主微生 物中引入或扩增选自编码1)乙醇脱氢酶、2)乙醛脱氢酶、和3)乙醛/乙醛脱 氢酶的基因的一种或多种基因，并且本发明涉及由上述方法制备的具有提 高的生产丁醇能力的重组微生物。

编码将丁酰CoA转化成丁酸的酶的基因可为编码磷酸转乙酰化酶的基 因(ptb)或编码丁酸激酶的基因(buk、bukII)。

本发明还涉及制备重组微生物的方法，该方法包括：在具有乙酰CoA 和丁酰CoA生物合成路径的宿主微生物中，删除编码将乙酰CoA转化成 乙酸的酶的基因，然后在该微生物中进一步删除编码将丁酰CoA转化成丁 酸的酶的基因，在该微生物中进一步删除编码CoA移转酶的基因，和在该 微生物中扩增编码乙醛/乙醛脱氢酶的基因，并且本发明涉及由上述方法制 备的具有提高的生产丁醇能力的重组微生物。

编码乙醇脱氢酶的基因可为adh，编码乙醛脱氢酶的基因可为ald，以 及编码乙醛/乙醛脱氢酶的基因可为adhE1。adhE1基因可以各种形式扩 增，从而提高微生物生产丁醇的能力。这里，所述各种形式包括利用ptb 启动子、buk启动子、thl启动子或类似物控制表达的时间点和表达水平， 包括利用原型启动子，并且还包括突变adhE1。

在另一方面，本发明涉及具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，其 中在梭菌种微生物中，编码磷酸转乙酰化酶的基因(eutD或pta)或编码乙酸 激酶的基因(askA或ackA)被删除。

具有提高的生产丁醇能力的重组微生物的实例包括丙醇丁醇梭菌 ATCC 824ΔeutD。

在再一方面，本发明涉及具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，其 中在梭菌种微生物中，编码磷酸转乙酰化酶的基因(eutD或pta)或编码乙酸 激酶的基因(askA或ackA)被删除，以及在该梭菌种微生物中，选自1)编码 丁酸转乙酰酶的基因(ptb)或编码丁酸激酶的基因(buk和/或bukII)和2)编码 CoA移转酶的基因(ctfAB或atoDA)的基因进一步被删除。

具有提高的生产丁醇能力的重组微生物的实例包括丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII(丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk)、丙醇丁 醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB。

在又一方面，本发明涉及具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，其 中在梭菌种微生物中，编码磷酸转乙酰化酶的基因(eutD或pta)或编码乙酸 激酶的基因(askA或ackA)被删除，以及在该梭菌种微生物中，选自1)编码 丁酸转乙酰酶的基因(ptb)或编码丁酸激酶的基因(buk和/或bukII)和2)CoA 移转酶编码的基因(ctfAB或atoDA)的基因被进一步删除，以及其中在该重 组微生物中醛/醇脱氢酶被扩增。

具有提高的生产丁醇能力的重组微生物的实例包括丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh、丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*和丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*。

在进一步的方面，本发明涉及生产丁醇的方法，包括以下步骤：培养 所述重组微生物以生产丁醇；和从培养基回收生产出的丁醇。

在本发明中，培养重组微生物以及回收乙醇和丁醇的工艺可以利用发 酵工业中已知的常规培养方法和乙醇/丁醇分离/纯化方法进行。此外，丁醇 和乙醇的回收通常在培养工艺完成后进行，但乙醇和丁醇还可在培养工艺 期间利用气提法(Thaddeus等人，Bioprocess Biosyst.Eng.,27:207,2005)或类 似方法回收以提高乙醇和丁醇的生产。换句话说，进行培养工艺，同时回 收该培养工艺期间产生的乙醇和丁醇也落入本发明内。

实施例

下文，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说 明显的是，这些实施例仅为示例的目的，并不解释为限制本发明的范围。

具体来说，在以下实施例中，丙醇丁醇梭菌ATCC 824示例作为根据 本发明将基因从其中删除的宿主菌株。但是，对本领域技术人员来说明显 的是，即使当使用了梭菌种的其它微生物或其它种的微生物时，相同的基 因在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路径的宿主菌株中被删除，并且 所得菌株用于生产乙醇和丁醇。

实施例1:包含突变loxP位点和抗生素抗性标记的载体的构建

在丙醇丁醇梭菌的情况下，红霉素抗性基因(下文称作Em^r)主要用作载 体的抗生素抗性标记物。对于通过双交换重组进行的基因删除，需要额外 的抗生素抗性标记物以选择其中发生了双交换的菌株。因此，将利用丙醇 丁醇梭菌的硫解酶启动子表达氯霉素/甲砜霉素抗性标记物(下文称作Th^r)的 pSOS95-Cm用作PCR的模板。pSOS95-Cm可以通过将ATCC 824菌株的 硫解酶启动子克隆到pSOS95(Nair和Papoutsakis，J.Bacteriol.，176:5843- 5846，1994)并将氯霉素/甲砜霉素抗性基因克隆到该启动子的下游来构 建。

而且，通过双交换删除基因后，应除去插入的抗生素抗性标记物以删 除其它基因。为此目的，将突变的loxP序列加入PCR扩增Th^r时使用的引 物中。而且，为了连接到载体中，将限制酶位点SphI和XbaI的序列 GCATGC和TCTAGA分别加入到引物中。最终的引物序列如SEQ ID NO: 1和2所示。

[SEQ ID NOS:1]:

5-'AATTGCATGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCACACG

GTTTAACGACTTAATTACG-3'

[SEQ ID NOS:2]:

5'-ATATTCTAGAACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCATGAT

TACGAATTCTATGAGTCGAC-3'

使用上述模板和引物进行PCR扩增，由此获得同时包含突变loxP位 点和Th^r的PCR产物。将由此获得的PCR产物和pUC18质粒用SphI/XbaI 消化，然后彼此连接，由此制备载体pMBKOT2。载体pMBKOT2用于构 建包含loxP-Thr-loxP部分和pMBKOT2的同源臂的KO盒。

实施例2:pCACKO载体的构建

通过同源重组进行的基因删除通常使用不在细胞中复制的质粒进行。 但是，在丙醇丁醇梭菌的情况下，已知的是，转化比例比在大肠杆菌(E. coli)中的转化比例低得多，并且不易于发生同源重组。为此，优选使用可 复制的质粒。因此，使用实施例1中构建的pMBKOT2和可在丙醇丁醇梭 菌中复制的穿梭载体pIMP1(Nair和Papoutsakis，J.Bacteriol.，176:5843- 5846，1994)构建可以删除特定基因的载体。

除XmaI外，pIMP1中的限制酶序列是不合适的，因为它们消化 pMBKOT2的loxP-Th^r-loxP序列的内部。为此，将pMBKOT2和pIMP1中 都不存在的限制酶序列NcoI加入pIMP1中。PCR扩增利用位于 pUC18(GenBank ID:L08752.1)的约300个碱基对(L08752.1的1155-1468)作 为模板以及如下引物(SEQ ID NO:3和4)来进行。NcoI的碱基序列包含于 SEQ ID NO:3的引物中。

[SEQ IDNOS:3]:

5'-AAAACTGCAGCCATGGTCGCCAGTTAATAGTTTGCG-3'

[SEQ ID NOS:4]:5'-AAAACCCGGGCGCCGCATACACTATTCTCA-3'

由此获得的PCR产物和pIMP1用NcoI/XmaI消化，然后彼此连接，由 此构建pCACKO载体。基于该载体，构建了删除基因的载体。

测试例1:利用pCACKO删除目的基因的方法

将目的基因(eutD、ctfB、buk或bukII)与甲砜霉素标记物扩增并连接到 实施例2中构建的pCACKO载体中，载体被甲基化并通过电穿孔转化到丙 醇丁醇梭菌ATCC 824菌株中(Mermelstein和Papoutsakis，Appl.Environ. Microbiol.，59(4):1077-1081，1993)。将转化的菌株在2x YTGS培养基(16 g/L bacto胰蛋白胨、10g/L bacto酵母提取物、4g/L NaCl、2g/L葡萄糖、 15g/L可溶淀粉，pH 6.8)中传代培养，同时将其铺板在含甲砜霉素的2x YTG琼脂(16g/L bacto胰蛋白胨、10g/L bacto酵母提取物、4g/L NaCl、5 g/L葡萄糖、15g/L琼脂，pH 5.8)上。

通过菌落PCR检查从该板获得的各个菌落以确认Th^r标记物是否成功 地插入目的基因的ORF中。当基因两侧的重组都确实发生了时，在进行变 性测试以确认参与溶剂生产的pSOL1没有丢失(Scotcher和Bennett，J. Bacteriol.，187(6):1930-1936，2005)后，将该菌落培养并铺板。将所得菌 株在2x YTGS培养基中传代培养30代以上以除去所使用的pCACKO载 体，之后将其铺板在含有Th的2x YTG琼脂上并在含有红霉素(Em)的2x YTG琼脂上复制。然后，选择没有显示出Em^r的若干菌落，然后以上述相 同方式进行变性测试，最终选择其中没有丢失pSOL1的菌落。

测试例2:表达Cre重组酶的载体的构建

在测试例1中目的基因被删除后，制备表达Cre重组酶的载体以除去 作为抗生素抗性标记物插入该基因中的甲砜霉素抗性基因。为了制作表达 Cre重组酶的载体，使用pSOS95(GenBank ID:AY187686.1)作为母体载体进 行操作，pSOS95包括丙醇丁醇梭菌的硫解酶基因的启动子。cre基因不适 于使用，因为BamHI位点存在于该基因的ORF序列中。为此，利用丙醇 丁醇梭菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:5和6的引物来扩增包 含核糖体结合位点和XbaI位点的链。然后，将扩增的产物和pSOS95用 BamHI/NarI消化，然后利用T4连接酶彼此连接，从而构建pSOS95-X载 体。

[SEQ ID NO:5]:

5'-GCATGGATCCAGAATTTAAAAGGAGGGATTAAATCTAGAATGATAAGAA

GCATGACGGGATTTG-3'

[SEQ ID NO:6]:

5'-GCATGGCGCCTCACTCTATATTTTGAATTTGTTCTC-3'

为了扩增cre基因，利用pJW168(Palmeros等人，Gene， 247:255~264，2000))作为模板以及SEQ ID NO:7和8的引物进行PCR扩 增。然后，将扩增的产物和pSOS95-X用XbaI/NarI消化，然后利用T4连 接酶彼此连接，从而构建pSOS95del-cre载体。

[SEQ ID NO:7]:5'-GCAATCTAGAATGTCCAATTTACTGACCGTACA-3'

[SEQ ID NO:8]:5'-GCATGGCGCCCTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3'

测试例3:利用pSOS95del-cre将插入基因中的抗生素抗性标记物去除

通过电穿孔法将实施例2中构建的2pSOS95del-cre转化到丙醇丁醇梭 菌ATCC 824重组菌株中，其中目的基因以与测试例1中相同的方式被删 除。将转化的菌株在2x YTGS培养基中传代培养3-5代，然后铺板在2x YTG琼脂上。随着菌落生长，将它们复制到含有Th的2x YTG琼脂上，并 且选择失去Th^r的菌落。然后，通过菌落PCR利用所删除的基因的内部/外 部引物检查所选择的菌落以基于扩增的基因的长度差异来确认Th^r的去 除。

对由此选择的菌落进行如测试例1的变性测试，并选择没有失去 pSOL1的菌落。经验证的菌落以与测试例1相同的方式传代培养，并选择 失去了pSOS95del-Cre但没有失去pSOL1的菌落。根据以上方法获得的菌 株不具有抗生素抗性标记物，因此可以用于进行其它基因的删除，而不会 改变现存载体的标记物。

实施例3:乙酸生产路径受到阻断的菌株的构建

为了删除参与乙酸生产路径的eutD基因，分别利用SEQ ID NO:9和 10的引物对以及SEQ ID NOS:11和12的引物对来扩增包含eutD的ORF 的链(NCBI RefSeq ID:NC_003030.1的1890304-1890770和1890831- 1891380)。这里，作为将扩增的序列，选择没有NcoI和XmaI的模板。发 现，每个扩增的产物中所含的ORF的两部分没有彼此重叠且具有相同的取 向。而且，为了在两个链之间插入标记物，利用SEQ ID NO:13和14的引 物来扩增包含loxP-Th^r-loxP的pMBKOT2的部分。

[SEQ ID NOS:9]:5'-CTAGCCATGGAGCATATGGGAGTGTGCTAAG-3'

[SEQ ID NOS:10]:5'-CGGCCAACGCTCGCAGTCAGGTATTATCAT-3'

[SEQ ID NOS:11]:5'-GCGAATGGCGAGATGAACTAGCTGATATTGCTATAA-3'

[SEQ ID NOS:12]:5'-ACGTCCCGGGCGAGTACAGTTTCATCCTTCATATC-3'

[SEQ ID NOS:13]:5'-CTGACTGCGAGCGTTGGCCGATTCAT-3'

[SEQ ID NOS:14]:5'-TAGTTCATCTCGCCATTCGCCATTCA-3'

利用该三个扩增的链作为模板以及SEQ ID NO:9和12的引物进行重 叠PCR，从而获得一条链。将由此获得的最终PCR产物和实施例2中制备 的pCACKO(KO载体)用NcoI/XmaI消化，然后彼此连接，从而构建 pCACKO-eutD载体。将该构建的载体甲基化，然后通过电穿孔转化到丙醇 丁醇梭菌ATCC 824菌株中。将转化的菌株在2x YTGS介质中传代培养， 同时将其铺板在含有甲砜霉素的2x YTG琼脂上。通过菌落PCR以及SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17和18的各引物对来检查从该板获得的菌落以 确认Th^r标记物是否成功地插入eutD ORF中。

[SEQ ID NOS:15]:5'-GAGGATAAAGAATATACGCAGG-3'

[SEQ ID NOS:16]:5'-TTGCCGTCCTAAACTCTGAA-3'

[SEQ ID NOS:17]:5'-CTTCCTTTGGCAATTCAAGTTC-3'

[SEQ ID NOS:18]:5'-GTGGATTATGAAGCGGTGCA-3'

当在基因两侧上的重组确实发生时，将菌落进行培养并铺板，之后对 其进行变性测试以验证没有失去参与溶剂生产的pSOL1。经验证的菌株在 2x YTGS培养基中传代培养超过30次，之后将其铺板在含有Th的2x YTG琼脂上并在含有红霉素(Em)的2x YTG琼脂上重复，并选择若干没有 显示Em^r的菌落。对所选择的菌落进行与上述相同方式的变性测试，并最 终选择没有失去pSOL1的菌落。

然后，将pSOS95del-cre以与测试例3中相同的方式转化到最终选择的 菌株中以除去插入该基因的甲砜霉素抗性基因。将该菌株传代培养以除去 pSOS95del-cre，从而制备最终的菌株(丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD)，该 最终的菌株对抗生素如甲砜霉素和红霉素敏感，像野生型菌株，且其中 eutD基因被删除。

实施例4:通过额外的基因删除和基因扩增来产生的重组菌株

为了在丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD菌株中删除选自buk、bukII和 ctfB的一种或多种基因，在实施例2中制备的作为宿主微生物的菌株(丙醇 丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD)中，将该基因以与实施例中相同的方式删除， 从而制备重组微生物。此外，将表达乙醛/乙醛脱氢酶的丙醇丁醇梭菌 ATCC 824的adhE1基因引入相应的菌株中。

为了删除额外的基因，使用以下序列SEQ ID NO:19至36。具体来 说，为了删除buk基因，使用序列SEQ ID NO:19至24，并且为了删除 bukII基因，使用序列SEQ ID NO:25至30。此外，为了删除ctfB基因， 使用序列SEQ ID NO:31至36。

[SEQ ID NOS:19]:5'-CTAGCCATGGATGTATAGATTACTAATAATC-3'

[SEQ ID NOS:20]:5'-CGGCCAACGCCTATTTCATTTGCAATAATTC-3'

[SEQ ID NOS:21]:5'-GCGAATGGCGCCAAGAAAAAGTATATTCCATG-3'

[SEQ ID NOS:22]:5'-ACGTCCCGGGCTTCTCCTCTTAAAACTCTAAG-3'

[SEQ ID NOS:23]:5'-ATTGCAAATGAAATAGCGCCATTCGCCATTCA-3'

[SEQ ID NOS:24]:5'-TATACTTTTTCTTGGGCGTTGGCCGATTCAT-3'

[SEQ ID NOS:25]:5'-CTAGCCATGGGGACTTTATTATGAAATTTAAAC-3'

[SEQ ID NOS:26]:5'-CGGCCAACGCCACTATATATGCTGACACTCC-3'

[SEQ ID NOS:27]:5'-GCGAATGGCGCTGGAATACCTGAACTTCCTAG-3'

[SEQ ID NOS:28]:5'-ACGTCCCGGGAACCCTTAAGGTTCCTTCTGC-3'

[SEQ ID NOS:29]:5'-GTCAGCATATATAGTGCGCCATTCGCCATTCA-3'

[SEQ ID NOS:30]:5'-AGTTCAGGTATTCCAGGCGTTGGCCGATTCAT-3'

[SEQ ID NOS:31]:5'-CTAGCCATGGTCCCTATATGGCAATGGCAGC-3'

[SEQ ID NOS:32]:5'-CGGCCAACGCTTAGGACTAGCGCCCATTCC-3'

[SEQ ID NOS:33]:5'-GCGAATGGCGGGAGGAGACTATACAACAGTAC-3'

[SEQ ID NOS:34]:5'-ACGTCCCGGGTTCTTTCTAAACAGCCATGGGTC-3'

[SEQ ID NOS:35]:5'-GGGCGCTAGTCCTAACGCCATTCGCCATTCA-3'

[SEQ ID NOS:36]:5'-TTGTATAGTCTCCTCCGCGTTGGCCGATTCAT-3'

通过PCR利用SEQ ID NO:37和38的引物来扩增丙醇丁醇梭菌ATCC 824的adhE1基因。将PCR产物在pIMP1exter载体的ptb基因启动子和 ctfB转录终止子之间克隆。将PCR产物和pIMP1exter载体用SalI/EcoRI限 制酶消化，然后彼此连接。将pIMP1exter的ptb启动子利用SEQ ID NO: 39和40引物扩增，并克隆到pIMP1的PstI和SalI限制酶位点(Nair和 Papoutsakis，J.Bacteriol.，176:5843-5846，1994)中。利用SEQ ID NO:41 和42的引物扩增终止子序列，并将该终止子序列克隆到已将ptb启动子克 隆到其中的载体的EcoRI和NdeI限制酶位点，从而制备pIMP1exter。通过 以下方式构建pTHL-Adh*：通过重叠PCR将利用SEQ ID NO:43和44引 物扩增的片段和利用SEQ ID NO:45和46引物扩增的片段连接到pTHL1- Cm载体，然后将该片段克隆到该载体的PstI和AvaI限制酶位点中。突变 Adh*是通过以下方式制备的人工重组蛋白质：将利用SEQ ID NO:43和46 引物扩增的adhE1片段克隆到pTHL1-Cm载体中，利用NTG在该片段中 引起突变，然后筛选。在利用NTG的突变Adh的筛选中，在SEQ ID NO: 51的氨基酸序列的氨基酸残基450-650中具有一个或多个突变的那些提高 了丁醇的生产。本实施例中使用的Adh*是通过利用序列SEQ ID NO:43至 46复制在库中最高频率变异的一种而获得。

[SEQ ID NOS:37]:5'-ATAGTCGACATGAAAGTCACAACAGTAAAGG-3'

[SEQ ID NOS:38]:5'-CGCGAATTCTTAAGGTTGTTTTTTAAAACA-3'

[SEQ ID NOS:39]:5'-TATCTGCAGTGTGGATGGAGTTAA-3'

[SEQ ID NOS:40]:5'-ATTGTCGACTTTAATCCCTCCTTT-3'

[SEQ ID NOS:41]:5'-CGCGAATTCGGGCCCATATCCAATGAACTTAGACC-3'

[SEQ ID NOS:42]:5'-CACCATATGGCCTAGAGCTGAAGTTAT-3'

[SEQ ID NOS:43]:5'-AAAACTGCAGTTTATGAAAGTCACAACAGTAAAGG-3'

[SEQ ID NOS:44]:5'-TAAATTATAGGGGTCACTACCAGTAACTATAAAGGCTC-3'

[SEQ ID NOS:45]:5'-GAGCCTTTATAGTTACTGGTAGTGACCCCTATAATTTA-3'

[SEQ ID NOS:46]:5'-CCCCCGGGGGGTTGAAATATGAAGGTTTAAGGTTG-3'

结果，制得了以下菌株：丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII，丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB，丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh，丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukIIPthlAdh*和丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*。

为了对比，以如下方式制备pTHL1-Cm载体。

以如下方式制备用于包含丙醇丁醇梭菌的硫解酶启动子和核糖体结合 位点(RBS)的外源蛋白质表达的穿梭载体。已知的是，硫解酶可以连续且稳 定地表达基因，而不会受细胞生长周期显著影响(Tummala等人，Appl. Environ.Microbiol.，65:3793~3799，1999)。因此，在本实施例中，将硫解 酶顶部的启动子(NCBI基因ID:1119056)克隆并插入到pIMP-H1del中。 pIMP-H1del是穿梭载体，其具有作为模板的pIMP1，并通过在具有两个 HindIII限制酶的pIMP1中除去3408位置HindIII位点同时留下在pIMP1 的743位置的限制酶位点来获得。利用丙醇丁醇梭菌ATCC 824菌株的总 DNA作为模板以及SEQ ID NO:47和48的引物通过PCR来扩增硫解酶启 动子。纯化并回收扩增的硫解酶启动子片段，之后用HindIII和PstI限制酶 对其处理，并与经相同限制酶处理的pIMP-H1del穿梭载体连接，从而构建 pTHL1载体。

[SEQ ID NOS:47]:5'-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3'

[SEQ ID NOS:48]:5'-AAACTGCAGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3'

此外，利用pSOS95-Cm以及SEQ ID NO:49和50的引物通过PCR来 扩增氯霉素抗性基因。纯化并回收扩增的基因片段，之后用HindIII限制酶 对其处理，并与经相同限制酶处理的pTHL1穿梭载体连接，从而构建 pTHL1-Cm载体。pSOS95-Cm可以通过将ATCC 824菌株的硫解酶启动子 克隆到pSOS95中(Nair和Papoutsakis，J.Bacteriol.，176:5843-5846，1994) 并将氯霉素/甲砜霉素抗性基因克隆到该启动子的下游来构建。

[SEQ ID NO:49]:5'-CCAAGCTTCGACTTTTTAACAAAATATATTG-3'

[SEQ ID NO:50]:5'-CCAAGCTTGACATTAAAAAAATAAGAGTTACC-3'

[SEQ ID NO:51]:MKVTTVKELDEKLKVIKEAQKKFSCYSQEMVDE IFRNAAMAAIDARELAKAAVLETGMGLVEDKVIKNHFAGEYIYNKYKDEKTCGIIER NEPYGITKIAEPIGVVAAIIPVTNPTSTTIFKSLISLKTRNGIFFSPHPRAKKSTILAAKTIL DAAVKSGAPENIIGWIDEPSIELTQYLMQKADITLATGGPSLVKSAYSSGKPAIGVGPG NTPVIIDESAHIKMAVSSIILSKTYDNGVICASEQSVIVLKSIYNKVKDEFQERGAYIIKK NELDKVREVIFKDGSVNPKIVGQSAYTIAAMAGIKVPKTTRILIGEVTSLGEEEPFAHE KLSPVLAMYEADNFDDALKKAVTLINLGGLGHTSGIYADEIKARDKIDRFSSAMKTV RTFVNIPTSQGASGDLYNFRIPPSFTLGCGFWGGNSVSENVGPKHLLNIKTVAERREN MLWFRVPHKVYFKFGCLQFALKDLKDLKKKRAFIVTDSDPYNLNYVDSIIKILEHLDI DFKVFNKVGREADLKTIKKATEEMSSFMPDTIIALGGTPEMSSAKLMWVLYEHPEVK FEDLAIKFMDIRKRIYTFPKLGKKAMLVAITTSAGSGSEVTPFALVTDNNTGNKYMLA DYEMTPNMAIVDAELMMKMPKGLTAYSGIDALVNSIEAYTSVYASEYTNGLALEAIR LIFKYLPEAYKNGRTNEKAREKMAHASTMAGMASANAFLGLCHSMAIKLSSEHNIPS GIANALLIEEVIKFNAVDNPVKQAPCPQYKYPNTIFRYARIADYIKLGGNTDEEKVDLL INKIHELKKALNIPTSIKDAGVLEENFYSSLDRISELALDDQCTGANPRFPLTSEIKEMYI NCFKKQP

实施例5:利用重组菌株生产乙醇

对含有10ml CGM培养基(表1)的30ml测试管进行消毒，用氮气填充 并在厌氧室中冷却到室温。然后，将实施例3中制备的重组微生物(丙醇丁 醇梭菌ATCC 824 ΔeutD)接种到该测试管中并在厌氧条件下在37℃预培 养，直到其达到在600nm的1.0的吸光度。

[表1]

  组分   含量(g/l)   葡萄糖   80   K₂HPO₄3H₂O   0.982   KH₂PO₄  0.75   MgSO₄  0.348   MnSO₄H₂O   0.01   FeSO₄7H₂O   0.01   (NH₄)₂SO₄  2   NaCl   1   天冬酰胺   2   PABA(对氨基苯甲酸)   0.004   酵母提取物   5

对含有200ml CGM培养基的500ml烧瓶进行消毒，并以如上相同的方 式进行处理。然后，将8ml的上述预培养物肉汤接种到该烧瓶中并进一步 在厌氧条件下37℃预培养，直到其达到在600nm的1.0的吸光度。然后， 对含有2.0L CGM培养基的5.0L发酵罐(LiFlus GX，Biotron Inc.，Kyunggi- Do，韩国)进行消毒，之后将温度从80℃以上降低到37℃，同时将氮气以 0.5vvm的流速供应到该发酵罐，持续10小时。然后，将200ml二次预培 养的肉汤接种到该发酵罐并在37℃和200rpm培养60小时。在培养期间， 通过自动供应5N NaOH将pH保持在5.0，并以0.2vvm(空气体积/工作体 积/分钟)的流速供应氮气。

通过葡萄糖分析仪(2700STAT型，Yellow Springs Instrument，Yellow  Springs，Ohio，USA)测量培养基中的葡萄糖，并且在不同的时间点收集该 培养基。通过配有填充柱(Supelco Carbopack^TM BAW/6.6%PEG20M， 2m×2mm ID，Bellefonte，PA，USA)的气相色谱仪(Agillent 6890N GC System，Agilent Technologies)测量所收集的培养基中的丙酮、乙醇和丁醇 的浓度，从而测量该有机溶剂的生产收率。测量结果示于以下表2和3 中。

[表2]

+来自Walter(1993)的数据

[表3]

如在以上表2和3中可见，对照野生型丙醇丁醇梭菌ATCC 824显示 出低于10g/L的丁醇产率，而实施例3中制备的重组微生物丙醇丁醇梭菌 ATCC824ΔeutD显示出提高的丁醇浓度和收率，表明其具有提高的生产丁 醇的能力。此外，可以看到，不仅乙醇和丁醇的最终浓度提高了，收率也 提高了。

实施例6:重组菌株生产丁醇能力的比较

下表4中所示的丙醇丁醇梭菌ATCC 824和重组菌株的发酵是在与实 施例5中相同的条件下进行。

[表4]

结果，如以上表4中可看到的，重组菌株丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh，丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*，丙 醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh*和丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*表现出提高的丁醇浓度、丁醇收率和 丁醇选择性。具体来说，这些菌株共同地表现出约18g/L或更高的丁醇浓 度，高丁醇收率(0.28g/g葡萄糖以上)和高丁醇选择性(0.80g/g总有机溶剂以 上)。

同时，可以看到，重组菌株丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutDΔbuk在收 率方面类似于删除了eutD的突变菌株丙醇丁醇梭菌ATCC 824 ΔeutD。这 是因为，即使当丁酸生产路径中的基因和乙酸生产路径中的基因都被删除 时，仍产生乙酸和丁酸。在本发明中，这样的情况是最新发现的，因此可 开发出如上所述的优异的生产丁醇的菌株。通过CoA移转酶的作用可实现 的乙酸生产是通过使用本发明删除了eutD、buk(和/或bukII)或ctfB的菌株 而最新发现的，从而完成了本发明。通过操纵代谢流，在发酵结束时，上 述菌株大多很少具有或没有丁酸和乙酸。

工业应用性

本发明提供了具有高的产生丁醇的能力及高选择性的重组微生物，其 中特定基因被删除或失活。根据本发明的重组微生物基本不产生有机酸(包 括乙酸和丁酸)、和副产物(包括丙酮)，并且可以提高每小时的丁醇生产。 因此，本发明的重组微生物可用于丁醇的生产。

虽然已参考具体特征描述了本发明，但本领域技术人员能领会的是， 本说明仅用于优选实施方式，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的 实质范围将通过所附的权利要求书及其等价物限定。

序列表

以电子文件形式提供序列表。