过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌YBT-881-L1的筛选及鉴定

摘要

本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌基因工程菌的构建。本发明构建得到一株具有杀鳞翅目害虫棉铃虫的同时具有杀桔小实蝇的活性的过表达转录调控因子CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)基因工程菌YBT-881-L1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011040，该工程菌含有CodY蛋白，它的编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了一种新的表达载体，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。本发明的YBT-881-L1工程菌不仅对棉铃虫具有很高的杀虫活性，而且对双翅目昆虫也有较高的杀虫活性，而野生型苏云金芽胞杆菌YBT-881仅对棉铃虫有活性，对双翅目昆虫没有杀虫活性。本发明的基因工程菌可在杀虫微生物农药方面应用。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工 程菌YBT-881-L1的筛选及鉴定。本发明涉及微生物农药基因工程菌的选育与应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种天然存在的昆虫病原细菌，对无脊椎动物中 的4个门和节肢动物门中16个目的3000多种害虫有活性。随着研究的深入，cry1基因在杀虫工程菌 和转基因抗虫植物中已得到广泛的应用。但是，在实验室条件下已经发现了多种昆虫对Bt亚种或单个毒 素可以产生抗性，在小菜蛾的田间种群中也已经出现了具有抗性的个体。因此，筛选和克隆新的毒力高、 杀虫谱广、不易产生抗性和交互抗性的cry基因和基因组合是解决这些潜在危机的有效途径之一。

cry2基因在Bt中分布较广泛，而不同的Cry2类蛋白有着不同的杀虫谱和毒力。其中，Cry2Aa对鳞 翅目、双翅目害虫及直翅目的黄胫小车蝗具有杀虫活性；cry2A为沉默基因，但在国内外都已实现了有效 表达，并发现Cry2Ab对棉铃虫初孵幼虫具有高毒力，能明显抑制二化螟二龄幼虫生长；cry2Ac和cry2Ad 在苏云金芽胞杆菌中不常见。研究表明，Cry2A类蛋白与Cry1A蛋白具有不同的结合位点，害虫对这两种 蛋白不容易产生交互抗性。Cry2类蛋白与其它杀虫蛋白之间还具有增效作用。第二代抗虫棉中已出现了转 cry2Ab基因或同时转cry2Ab和cry1Ac基因的棉花，并且已经在Monsanto公司开始商业化生产。中国也 得到了对水稻主要鳞翅目害虫具有抗性的转人工改造的cry2A基因水稻。因此，对cry2基因的研究具有 重要的理论和应用价值。

生物杀虫剂优于传统农药的最大原因是由于其杀虫能力没有降低，但与传统农药相比有环保和无残留 的优点，因此近年来生物杀虫剂得到了全世界范围的关注。目前苏云金芽胞杆菌是全世界使用最广泛、最 成功的生物杀虫剂，这个过程经历了近110年的历程。1915年正式将这种有杀虫能力、革兰氏阳性、生存 在土壤中的微生物命名为苏云金芽胞杆菌，从发现到得到正式命名经历了15年(喻子牛，1990)。苏云金 芽胞杆菌之所以具有杀虫能力是由于在形成芽胞的同时形成了伴胞晶体，即杀虫晶体蛋白(Insecticidal  crystal proteins，ICPs)，这种晶体的杀虫能力是特异性的。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在稳定期大量表达并且以伴胞晶体的形式在母细胞中积累，其表达量可 达到整个细胞干重的20-40％。也就是说，每个细胞大约需要合成1-2×10⁶个ICPs分子才能组装成这样的 晶体(Schnepf and Crickmore，1998；Errington，1993)。因此，苏云金芽胞杆菌内一定存在调节机制 来调节cry基因的表达。近来一系列的研究表明，苏云金芽胞杆菌cry基因的高效表达调控机制主要涉及 转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平等多个层次的正向调节，才最终使得cry基因能够高效表 达并形成伴胞晶体。不同的cry基因调控机制也各不相同，即便是同一基因在不同宿主细胞中表达也不相 同，说明原毒素的合成存在着错综复杂的调控机制。深入认识这些调控机制，构建高效广谱工程菌具有重 要的理论意义和实践意义。

全局性转录调控因子CodY广泛存在于G+C含量较低的革兰氏阳性细菌中，它是调节稳定期早期基因和 芽胞形成基因转录的全局调控因子，它调控很多基因，包含将近200个基因。这些基因包括一些可产生与 大分子降解、营养物质运输、生物代谢、抗生素合成、趋药性等有关的物质。这些基因大都是在快速生长 期被阻遏，而营养缺乏时被诱导表达，帮助细胞适应营养匮乏时期。

在枯草芽胞杆菌细胞中，CodY通过感知细胞内GTP浓度作为营养条件的指示剂，调节稳定期早期基因 和芽胞形成基因的转录。在指数生长期，枯草杆菌细胞中的CodY可被细胞内含量较高的GTP激活成为转录 阻遏蛋白，抑制稳定期和芽胞形成基因的转录。当细胞内碳源或者氨基酸含量较少时，生长速率下降，应 急反应被激活。产生应急反应的信号是结合有空载tRNA的核糖体，该信号激活与核糖体结合的——RelA， RelA使GTP转化为pppGpp和ppGpp，细胞内的GDP和GTP含量下降，这就会导致CodY失去阻遏活性，从而CodY 的靶基因可以正常转录，调节细胞进入稳定期或者形成芽胞(Ratnayake-Lecamwasam M et al.，2001)。 因此，(p)ppGpp的积累或GTP含量的减少可能是使CodY调节的靶基因去阻遏的信号。当用德夸菌素(GMP合 成抑制剂)处理细胞时，鸟嘌呤核苷酸含量下降，会诱导稳定期基因的表达，也会促使细胞即使在营养丰 富的条件下仍然形成芽胞。CodY与GTP相互作用后会增强CodY与其靶基因的亲和力，这种亲和力的增强在 BCAAs存在时被进一步放大。两种不能水解的GTP的类似物也能激活CodY结合到靶DNA上，因此GTP对CodY的 效应并不依赖于GTP的水解(Luke D.Handke et al.，2008)。GTP作为CodY的效应分子的证据是由 Ratnayake-Lecamwasam等人首次提出的。在他们所做的实验中，ATP可以与带有放射性标记的GTP竞争结合 靶DNA，但CTP和UTP却不能。作者提出，CodY体外抑制dpp启动子的能力可被浓度为2mM的GTP极大的刺激， 但添加ATP并不能诱导CodY的阻遏效应。由于竞争实验并没有在平衡条件下进行，他们也不排除其他核苷 酸作为效应分子的可能性。

P.Serror和A.L.Sonenshein发现，BCAAs是枯草杆菌细胞中激活CodY阻遏dpp操纵子的最有效的氨基 酸；Guedon等人提出当向乳酸乳球菌的生长培养基中添加含有BCAAs的二肽时，会增强CodY对合成胞外蛋 白酶的阻遏作用；Bergara等人指出枯草芽胞杆菌细胞中CodY对鞭毛基因的阻遏与向生长培养基中添加 BCAAs有关。为了验证BCAAs是否对CodY与靶位点的结合有直接影响，Robert P.Shivers和Abraham L. Sonenshein等人向CodY与453bp大小的ilvB启动子片段的结合反应中添加Ile，Leu，Val各10mM，发现在某 种程度上添加BCAAs比GTP对增强CodY与靶位点的亲和力更有效，表明BCAAs是促使CodY与靶位点结合的直 接效应分子；但是否只有BCAAs中的三种氨基酸同时存在时才对CodY的结合能力有影响呢？他们又在GTP存 在的条件下，向结合反应中添加单个氨基酸，发现添加BCAAs中的每种氨基酸对CodY结合能力的增强都大 于GTP的单独效应，且Ile和Val的效应最大(Anuradha C.Villapakkam et al.，2010)。

因此，枯草杆菌细胞中CodY的活性，依赖于两个效应分子，即GTP和BCAAs。CodY与靶位点的体外结合 能力可同时被GTP和BCAAs增强，二者可单独或者协同作用，CodY与GTP相互作用将使CodY与DNA的亲和力增 加四倍。两个效应分子同时存在时，CodY的活性比它们单独存在时更强。但乳酸乳球菌和肺炎链球菌中的 CodY蛋白活性只受BCAAs调控(Robert P.Shivers et al.，2004)。

CodY是一种特殊的转录阻遏调控因子，因为迄今为止还没发现它还与其他类型的转录因子有明显的相 似性。至于CodY是通过何种机制识别和结合它的靶基因的启动子还尚为所知。但有一点是肯定的，那就是 CodY控制的基因富含AT，至少有一个真正的DNA弯曲结构。Serror和Sonenshein认为CodY可能识别一个DNA 的三维结构而不是线性的核苷酸序列。另一方面，CodY的羧基端含HTH区，与DNA结合的HTH结构域的研究 表明CodY可能是一个含有特殊氨基酸序列的DNA结合蛋白。

研究表明，HTH模体包括近20个氨基酸，每个d螺旋成120°角，螺旋被一个柔软区连接，柔软区含有 3-4个氨基酸，N端的一个螺旋位于大沟上，靠近DNA骨架，柔软的转角区可以使C端的另一个螺旋(识别螺 旋)与DNA大沟形成序列特异的相互作用。

通过胰脱氧核糖核酸酶印迹法，已经发现CodY的几个结合热点。CodY可与富含AT的DNA序列相互作用， 但CodY的结合位点相似性极低。CodY能识别一些不同的DNA拓扑结构而非一个具体的DNA序列。两个研究乳 酸乳球菌的研究小组提出，该菌的CodY可以高效结合一个15bp的共同序列，AATTTTCWGAAAATT或 AATTTTGNCAAAATT。目前已通过足迹法确认了这个共同序列在双乳球菌中的高效性。

在枯草芽胞杆菌和双乳球菌中，CodY可与保守序列AATTTTCWGAAAATT结合，然而最新研究表明，这个 结合热点在嗜热链球菌的14个启动子中并未发现，嗜热链球菌的CodY蛋白可以与这14个编码蛋白质水解酶 基因的启动子的保守序列微弱的结合，这就意味着他们并非是特有的结合位点。

也许是因为CodY不同的C端氨基酸序列导致了CodY与DNA序列结合时的差异，所以在以后的实验研究 中，我们应着力于探究与CodY结合的DNA保守序列，通过生物技术对其进行改造，从而提高CodY与DNA的结 合效果，增强CodY对DNA转录的调节作用，使得生物体对环境的适应能力进一步增强。 其他革兰氏阳性菌中的作用

CodY的同源蛋白几乎在存在于所有的低G+C含量的革兰氏阳性菌家族中(有机体的DNA中GC碱基对含量 少于50％)。CodY在这些细菌中也是高度保守的，通过转录微序列分析得知CodY的调节作用广泛存在于革兰 氏阳性菌中，并且有很多共同点。

金黄色葡萄球菌

在金黄色葡萄球菌的二例临床调查中，大部分致病基因，包括调节基因，编码毒素的基因，编码蛋白 酶、类膜生物合成及膜基质多糖的合成基因已经被证实在CodY突变体中被去阻遏，令人惊奇的是，在第三 个抽样中，CodY的缺失导致生物膜不能合成。Charlotte D.Majerczyk等人用2个CodY缺失功能的金黄色 葡萄球菌突变株，通过等位基因的置换，导致了一些毒力基因的过表达。这些突变株在培养液中对兔红细 胞的溶血活性增强，并产生更多的细胞间粘附分子PIA，且比他们的原始分离菌株能产生更多的生物膜。 这种表型与溶血α-毒素(hla)和agr(RNAIIand RNAIII/hld)的RNA的去阻遏水平以及负责PIA合成的操纵子 有关。这些都表明CodY在金黄色葡萄球菌中能够阻遏一些毒力因子的合成。

难辨梭状芽胞杆菌

难辨梭状芽胞杆菌造成与抗生素相关联的腹泻的首要基因，是两个毒素。它们是重要的致病因子。毒 素基因的表达依赖于一个选择性的RNA聚合酶的σ因子。达夫斯大学医学院的研究者用基因工程的方法培 育出一种缺乏cody基因的难辨梭状芽胞杆菌菌株，并将其毒素生产与其它野生型菌株进行比较，结果表明， 突变菌株产生了更高水平的毒素为确定CodY蛋白的作用模式，研究人员将该蛋白与从难辨梭状芽胞杆菌内 提取出的DNA混合。他们发现，这种蛋白以高亲和力结合到含有tcdR基因启动子区域的DNA片段，tcdR基因 编码的σ因子使RNA聚合酶能识别两种主要毒素基因的启动子及其自身的启动子。CodY蛋白也可与毒素基 因启动子结合，但是亲和力很低，说明CodY调节的毒素基因表达主要是通过直接控制tcdR基因表达完成的。 在存在GTP(鸟苷三磷酸)及支链氨基酸的情况下，CodY与tcdR启动子区域的结合得到加强，说明营养限 制与难辨梭状芽胞杆菌毒素基因表达相关。难辨梭状芽胞杆菌只在需要食物时产生毒素，CodY蛋白实际上 监测难辨梭状芽胞杆菌的饥饿水平，防止当细菌有足够食物时产生毒素。当CodY感到细胞有足够营养时， 它与这个基因段结合，防止细菌产生毒素，相反，当食物短缺时，CodY蛋白不能与这些基因结合，使难辨 梭状芽胞杆菌产生毒素攻击肠细胞(Abraham Sonenshein，2007)。

乳酸乳球菌

乳酸乳球菌中的Cody是基因的主要调控物，这些被调控的基因能够编码氨基酸氨基转移酶，胞外蛋白 酶，肽摄取体系，胞内肽的利用，同时可能直接对BCAAs产生应答。事实上，乳酸乳球菌中CodY也许仅仅 对BCAAs产生应答。尽管乳酸乳球菌的CodY基因能够部分辅助枯草杆菌CodY突变体，该突变体是一种不受 GTP变动影响的能够表达乳酸乳球菌CodY的枯草杆菌菌株。

化脓性链球菌

最近的研究表明CodY的同源物能够在其他低G+C含量的革兰氏阳性菌中控制许多稳定期前期的基因。 这些基因能够控制细胞毒性和抗生素的合成。在化脓性链球菌中，例如许多代谢，压力应答，群体感应， 毒力基因都能被氨基酸饥饿通过一种机理所诱导，这种机理是独立的严紧反应。此外，化脓性链球菌CodY 基因的失活导致许多基因的表达发生改变，包括编码一些转运蛋白，调控蛋白，毒力因子，比如透明质酸 合成酶，链球菌溶血素S，链球菌溶血素O，链球菌DNA酶，C5a肽酶，a-2巨球蛋白结合蛋白和链激酶。纯 化的化脓性链球菌CodY在体外结合在dpp和opp操纵子的启动子区域。

依赖芽胞形成的cry基因的转录

大多数苏云金芽胞杆菌cry基因的启动子都是依赖于芽胞形成的启动子。其中，cry1A就是一个典型 代表。cry1A具有两个重叠的启动子BtI和BtII，上游启动子BtII的-10区位于下游启动子BtI的-35和 -10区之间。BtI在芽胞形成的t2-t6起始转录，BtII约在t5以后起开始转录(Wong et al.，1983)。体 外实验证明，含σ³⁵的RNA聚合酶识别启动子BtI，而含有σ²⁸的RNA聚合酶识别BtII(Brown and Whiteley， 1990)。而σ³⁵和σ²⁸的氨基酸序列与枯草芽胞杆菌芽胞形成特异性的σ^E和σ^K分别具有88％和85％的同源 性，并且σ³⁵和σ²⁸能够补偿σ^E和σ^K的功能(Adams，1991)。BtI是一个强启动子，它能够在苏云金芽 胞杆菌中独立存在并发挥作用，而BtII是一个弱启动子，与BtI并存，不能单独存在于苏云金芽胞杆菌 中发挥作用。在cry1A类基因中，cry1Ab，cry1Aa具有相同的重叠启动子结构和基本相同的序列。

此外，在一些cry和cyt基因或操纵子中，例如cry4Aa，cry4Ba和cyt1Aa，还发现了许多非重叠的 BtI和BtII双启动子(P1和P2双启动子)(Brown，1993)。这些启动子BtI(或P1)和BtII(或P2) 仍然分别依赖于σ³⁵和σ²⁸的识别。大量实验结果证明，所有具有芽胞形成特异性的杀虫晶体蛋白基因都 是通过含σ^E或σ^K的RNA聚合酶识别其启动子BtI或BtI和BtII并得以转录的(Dervyn et al.，1995)。

不依赖芽胞形成的cry基因的转录

在苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(subsp.tenebrionis)中发现的对鞘翅目昆虫有毒杀作用的cry3A 基因携带有一个典型的不依赖芽胞形成启动子。研究表明，cry3A基因是在营养期被转录的(Malvar and  Baum，1994)。cry3A的转录起点位于翻译起始位点的-129和-558区域。这两个不同起始转录位点的-10 和-35区序列与依赖于σ^A的RNA聚合酶的启动子类似，可被σ^A所识别而起始转录(Agaisse and Leredus， 1994a)。研究发现，在不形成芽胞的突变株中，cry3A的表达量增加，表达时间延长。cry3A-lacZ转录融 合实验分析表明，cry3A的启动子是一个弱启动子，在对数生长末期芽胞形成的T2期有活性，并保持到芽 胞形成t7期。cry3A-lacZ融合的β-半乳糖苷酶活性的动力学曲线表明，在苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞 杆菌中，芽胞形成的同时关闭cry3A的表达。因此，cry3A的表达活性不依赖芽胞形成，不是由调节芽胞 形成的基因所调控的，而是细胞从对数期向稳定期过渡时期，某些影响基因表达的调节因子所调控 (Agaisse and Leredus，1994b；Slamitou and Agaisse，1996)。

根据两类启动子作用时间的不同，研究者利用cry3Aa等非芽胞依赖型的启动子启动cry1基因的表达。 研究发现，非芽胞依赖型的启动子虽然可以使得cry1基因提前和大量表达，但是不能形成正常的晶体， 对芽胞杆菌的正常分化也有影响。这可能是因为营养生长阶段菌体内的生理环境不利于Cry1类毒素形成 伴胞晶体。这说明Cry蛋白的表达不仅仅是启动子的问题，还要与生物个体发育过程中特殊阶段的内部环 境相互协调(邵宗泽和喻子牛，2002)。因此，通过改造cry基因的启动子虽然可以获得这些基因的超量 表达，但如何恰当充分地利用这一手段仍需做进一步的探索。

本研究是在苏云金芽胞杆菌YBT-881中研究转录调控因子CodY蛋白的作用机制时，发现该CodY蛋白 过表达后，刺激了一个沉默基因Cry2AC的表达。从而可以使菌体中同时含有两种Cry蛋白。这样的结果使 我们联想到其是否对菌体的杀虫谱有一点影响，因此，我们根据文献报道同时做了棉铃虫和双翅目害虫桔 小实蝇的生物测定，发现重组菌株具有杀桔小实蝇和棉铃虫的活性，然而原始菌株只有杀棉铃虫的活性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌 YBT-881-L1及其应用。该过表达菌株YBT-881-L1较原始苏云金芽胞杆菌YBT-881在可杀鳞翅目害虫棉铃 虫同时增加了杀双翅目害虫桔小实蝇的活性。本发明制备的过表达菌株YBT-881-L1可应用在微生物农药 方面。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人构建了一个可以使芽胞杆菌基因在营养期就高表达的过表达载体，从而使转录调控因子CodY在 苏云金芽胞杆菌YBT-881中过表达。在确定该过表达载体转化原始苏云金芽胞杆菌YBT-881后，筛选得到一 株过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌菌株，申请人将其命名为苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1。

对该过表达菌株苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的性质进行生物检测。方法是，将原始苏云金芽胞杆 菌YBT-881与过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1在完全一致的培养条件下培养，测定其OD600值，结果 显示本发明的重组菌YBT-881-L1的生长趋势与原始菌株(或称野生株)YBT-881基本一致。提取原始苏云 金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的晶体蛋白，利用SDS-PAGE对晶体蛋白进行 分离，发现过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1除具有原始苏云金芽胞杆菌YBT-881所有蛋白条带外， 还明显多了一条蛋白条带，申请人将该蛋白条带挖取做质谱鉴定，该蛋白属于Cry2AC4蛋白。提取苏云金 芽胞杆菌野生株YBT-881和过表达苏云金芽胞杆菌菌株的晶体蛋白，选棉铃虫和双翅目害虫桔小实蝇作为 生物测定的对象，发现原始苏云金芽胞杆菌YBT-881仅有棉铃虫杀虫活性，而过表达苏云金芽胞杆菌菌株 YBT-881-L1晶体蛋白不但具有杀棉铃虫还具有双翅目桔小实蝇杀虫活性，从而使苏云金芽胞杆菌YBT-881 的杀虫谱有所改变。

申请人于2011年2月17日将该过表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株YBT-881-L1送交 湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011040。 以下对本发明作进一步的描述：

一、过表达载体的构建：

为了在苏云金芽胞杆菌中过量表达CodY蛋白，申请人构建了可以在营养期时期表达的苏云金芽胞杆 菌穿梭载体pHT1K-Plip-TS。该载体的Plip是蜡状芽胞杆菌属中通用的强启动子，可以使蛋白在营养期早 期就高量表达，其中TS是一个转录终止序列。申请人根据苏云金芽胞杆菌97-27(Han CS，Xie G，2006) (subsp.kurstaki)的基因组(登录号GeneBank：AE017355)设计特异引物，用PCR的方法把cody基因 的开放阅读框扩出来，经过基因操作手段连接到载体pHT1K-Plip-TS的多克隆位点。并且经过酶切验证过 表达载体(具体构建过程见实施例1)

二、过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的获得：

将过表达载体进行质粒脱盐处理，用电转化的方法(具体过程见实施例2)转化苏云金芽胞杆菌 YBT-881，得到转化子后抽取菌体质粒并做酶切验证，证明正确后保存菌株，得到的转化菌株便是过表达 菌株。

三、菌株性质测定方法及所分离筛选得到的菌株的特性

(1)原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1生长曲线的测定

将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的菌种活化，然后转接至 液体培养基中，30℃下震荡培养，每隔2h取样，利用可见分光光度计测定培养液中的OD值，绘制生长曲 线。结果如图8所示：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1生长曲线 基本一致。

(2)苏云金芽胞杆菌YBT-881和YBT-881-L1质粒的抽提

将原始苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881和过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1活化后接种于LB液体 培养基，将过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1在添加红霉素(25mg/ml)的LB液体培养基中培养至对 数中期，离心收集菌体，用STE溶液(配方见实施例3)洗涤一次。将菌体悬于适量溶液I(配方见实施 例3)，加溶菌酶，37℃静置2h-3h，加入溶液II(配方见实施例3)，放置在冰上不能超过5min，加 入溶液III(配方见实施例3)，颠倒混匀，冰上放置10min，离心取上清，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇 (体积比25∶24∶1)震荡混匀，离心吸取上清液，加入等体积的预冷异丙醇沉淀，离心，用75％浓度的 乙醇洗涤沉淀两次。加入适量含有RNase的双蒸水溶解质粒DNA。

用7％的琼脂糖凝胶电泳分离野生株苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1菌 株的质粒，结果如图6所示：原始YBT-881及过表达菌株YBT-881-L1菌株质粒基本相同，只是过表达菌 株中多了申请人转化进去的过表达载体，从图7所示：单酶切过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1和 原始苏云金芽胞杆菌YBT-881菌株的质粒可以明显看出申请人的结果是正确的。

(3)晶体蛋白的SDS-PAGE

首先提取原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的伴胞晶体蛋白。 将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌菌种活化，于30℃液体培养至芽胞和晶体完 全脱落。用50mL离心管离心收集胞晶混合物。用1M/L氯化钠和无菌去离子水分别洗涤3次。然后用裂解 液悬浮，37℃作用1h。离心取上清，加入约1/10体积的4M/L醋酸钠，冰上沉淀3-5h，沉淀的Cry毒素 蛋白用ddH₂O洗涤3次后，再用50mmol/L Na₂CO₃缓冲液溶解。

先配制10％分离胶混匀后注入垂直板电泳槽，加水饱和正丁醇封胶，于室温下聚合30min以上，倒出 正丁醇并冲洗。配制分离胶，在分离胶之上灌入浓缩胶。插入电泳梳板，于室温下聚合1h。取制备的Cry 毒素蛋白，向其中加入等体积的2×样品buffer，沸水加热后离心，取上清液点样。拔出梳子，加入电泳 缓冲液(配方见实施例6)，取适量样品上样，于80V电压在浓缩胶中电泳，溴酚蓝进入分离胶后电压升至 120V，电泳至溴酚蓝带至凝胶底部时停止电泳。取出凝胶，固定1h，用考马斯亮蓝染液染色1h以上，再 用脱色液(配方见实施例6)脱色至凝胶背景透明。

SDS-PAGE胶图结果(如图10，11所示)，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株 YBT-881-L1有明显不同的地方。原始苏云金芽胞杆菌YBT-881没有66kDa左右大小的条带，然而过表达苏 云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1蛋白条带图上看多了一条66kDa左右大小的条带。

(4)SDS-PAGE条带质谱分析

将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1SDS-PAGE分离的130kDa和 66kDa的条带挖出，分别放入1.5mL离心管中，送往中国科技大学质谱中心，对蛋白条带进一级行质谱分 析，结果发现过表达菌株苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1中多的一条蛋白条带是Cry2AC4，而130kDa大 小的条带是Cry1G和Cry1F。然后申请人分别根据已报道的序列设计引物，以该两种菌质粒为模板PCR， 均能扩出目的条带，经过申请人比对后确信得到的质谱结果可靠。

(5)晶体蛋白对棉铃虫毒力的生物测定

将虫卵喷洒无菌水于无菌室中孵化出幼虫。利用分光光度计测定已提取苏云金芽胞杆菌YBT-881和苏 云金芽胞杆菌YBT-881-L1晶体蛋白的OD值并计算浓度。按照养虫饲料配方(配方见实施例8)配制饲料， 将Cry毒素蛋白进行10倍稀释至10^-5，取50mL的小烧杯，写好标签，分别向每个小烧杯中加入3mL对应 浓度的感染液，以无菌水作为空白对照。然后向每个装有感染液的小烧杯中加入27mL饲料，混匀后迅速 将饲料倒入24孔生测板中，每个样品做3个平行，饲料冷却凝固后，每个孔接入一只棉铃虫，盖上铺有 吹塑纸垫板的盖子。感染3天后检查结果，用镊子触动无反应者为死虫。

生测结果如图15所示，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的Cry 毒素蛋白对鳞翅目害虫棉铃虫都具备杀虫活性，并且两株菌株的毒性相近。

(6)晶体蛋白对桔小实蝇毒力的生物测定

将虫卵喷洒无菌水于无菌室中孵化出幼虫。利用分光光度计测定已提取原始苏云金芽胞杆菌YBT-881 及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的晶体蛋白的OD值并计算浓度。以麦麸、蔗糖和大豆蛋白胨为 主，适当添加山梨酸和抗坏血酸等形成桔小实蝇人工饲料配方(配方见实施例9)，将Cry蛋白进行10倍 稀释至10^-5，采用每30g人工饲料加50mL稀释液(黄天培，2908)进行生测，每个处理50头3龄幼虫， 3个重复，24、48和72h统计校正死亡率。

生测结果如图16所示，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株的Cry毒素蛋白 对桔小实蝇杀虫活性有明显的不同，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881没有杀桔小实蝇的活性，然而含有Cry2AC 蛋白的过表达菌株有杀桔小实蝇的活性。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明所使用的cody基因的开放阅读框序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明所使用的CodY蛋白的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明所构建的Pht1k-Plip-Ts质粒序列(5065bp)。

序列表SEQ ID NO：4是本发明构建载体时使用的核苷酸(TS)片段序列。

序列表SEQ ID NO：5是本发明构建载体(或称质粒Plip)时使用的核苷酸(Plip)片段序列。

序列表SEQ ID NO：6是本发明所使用的Pht1K质粒载体的序列。

序列表SEQ ID NO：7是本发明所使用的pBS KS(+)质粒载体序列。

图1：是本发明的穿梭载体pHT1K-Plip的构建流程。

图2：是本发明的穿梭载体pHT1K-Plip-TS的构建流程。

图3：是本发明穿梭载体pHT1K-Plip-TS验证图谱。M，1kb DNA ladder；EV，EcoRV；Hd，HindIII；Nd， NdeI；Ec，EcoRI；Ba，BamHI；Sm，SmaI；Ps，PstI；Cl，ClaI；Sa，SalI Xh，XhoI；Kp，KpnI.

图4：是本发明穿梭载体pHT1K-PlipcodyTS的构建流程。

图5：是本发明的过表达载体构建酶切验证图谱。泳道1：1kb marker；泳道2：过表达载体用BamHI 单酶切；泳道3：连上cody的过表达载体，用XhoI和BamHI双酶切；泳道4：连上cody的过表达载体， 用BamHI酶切。

图6：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1质粒电泳跑 胶验证图谱，泳道1：lambda HindIII marker；泳道2：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881质粒；泳道3：过 表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1质粒；泳道4：1kb marker。图中可以看出，两株菌条带基本一致，只有 过表达菌株多了一条带。

图7：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1质粒酶切电 泳跑胶验证图谱。泳道1：lambda HindIII marker；2泳道：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881BamHI单酶 切；泳道3：过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1BamHI单酶切；泳道4：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881EcoRI 单酶切；泳道5：过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1EcoRI单酶切；泳道6：1kb marker；从图中可以看 出，两株菌条带基本一致，只有过表达菌株多了一条我们转化进去的质粒条带。

图8：是本发明的原始YBT-881苏云金芽胞杆菌及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的生长曲线， 黑色曲线为原始YBT-881的生长曲线，红色曲线为过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的生长曲线。 图中纵坐标为OD600值，横坐标为不同取样时间。

图9：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的相差显微 镜的照片。其中图9A是过表达YBT-881-L1；图9B是原始YBT-881。从图中可以看出，两株菌晶体形态一 致。

图10：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1SDS-PAGE 图谱。1，3，5泳道分别是YBT-881，18，24.30小时的蛋白胶图；2，4，6泳道分别是YBT-881-L1，18，24，30 小时的蛋白胶图。从图中可以看出，过表达菌株在65KDa左右多了一条蛋白条带。

图11：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1 Cry蛋白 经过胰蛋白酶处理的SDS-PAGE图谱。图中各泳道说明如下：泳道1：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881，Cry 蛋白经过胰蛋白酶处理的结果；泳道2：过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1，Cry蛋白经过胰蛋白酶处 理的结果；泳道3：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881，Cry蛋白经过碳酸钠溶解样品蛋白胶图；泳道4：过表 达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1，Cry蛋白经过碳酸钠溶解样品蛋白胶图。从图中可以看出，本发明的过表 达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1多了一条66KDa左右的蛋白条带，并且该条带可以被碳酸钠溶解。

图12：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1和原始苏 云金芽胞杆菌BMB171及过表达苏云金芽胞杆菌BMB171的SDS-PAGE图谱。泳道1：原始苏云金芽胞杆菌 BMB171，24小时蛋白胶图；泳道2：过表达苏云金芽胞杆菌BMB171，24小时蛋白胶图；泳道3：原始苏云 金芽胞杆菌YBT-881，24小时蛋白胶图；泳道4：过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1，24小时蛋白胶图。 从图中可以看出，原始苏云金芽胞杆菌BMB171及过表达苏云金芽胞杆菌BMB171没有任何变化，而原始苏 云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1中，只有过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1 多了一条蛋白条带。

图13：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1中是否都 含有Cry2Ac基因做PCR验证图谱。泳道1：DL2000 marker；泳道2：过表达苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1 扩cry2AC；泳道3：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881扩cry2AC；从图中可以看出，两株菌中均能扩出目的条 带。

图14：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1中的Cry2Ac 基因序列比对图谱。从图中可以看出，两株菌中的Cry2Ac基因序列相同。

图15：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1棉铃虫生 物测定结果柱状图。图中纵坐标为校正死亡率，横坐标为含有不同Cry毒素蛋白的饲料。CK为未加晶体蛋 白的饲料对照。

图16：是本发明的原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1对桔小实 蝇生物测定结果。从图中可以看出，原始YBT-881对桔小实蝇没有杀虫活性，然而过表达菌株苏云金芽胞 杆菌YBT-881-L1晶体蛋白对桔小实蝇有明显；图中纵坐标为校正死亡率，横坐标为含有不同cry毒素蛋 白的饲料。CK为未加晶体蛋白的饲料对照。

具体实施方式

实施例1、过表达载体的构建

以韩国首尔大学Yeon-Ho Je教授实验室馈赠的pLip质粒(其核苷酸序列见SEQ ID NO：5所述)为 模板，利用一对特异引物，XbaIlipPro5′(TCCTCTAGAGATCTTCTCAAAAAATACTACC)和BamHIlipPro3′ (TTCGGATCC TTAGGTGGCACAAATGTGAG)，进行PCR扩增。PCR条件如表1。

表1PCR扩增条件

混匀后置PCR仪上进行反应。循环程序95℃变性5min；再接着94℃40s，退火56℃，72℃ 1～2min， 30个循环；最后72℃延伸8min。

将得到的272bp产物(其序列如SEQ ID NO：5所示)利用XbaI/BamHI双酶切，再克隆到利用同样酶 消化的pBS KS(+)载体(华中农业大学生命科技学院何璟教授馈赠，其序列如SEQ ID NO：7所示)里，构 建pBS-lip载体(见图1所示)。再利用XbaI/KpnI双酶切pBS-lip载体DNA，得到的Plip启动子片断(其 序列如SEQ ID NO：5所示)连接到pHT1K(韩国首尔大学Yeon-Ho Je教授馈赠，其序列如SEQ ID NO：6 所示)的相同酶切位点，构建得到pHT1K-Plip穿梭载体(见图1所示)。为了以后基因操作的方便，申请 人对pHT1K-Plip穿梭载体处理XbaI/KpnI双酶切，再处理klenow，然后自连，最终去掉了Plip启动子前 端的酶切位点构建了pHT1K-Plip-edel(见图2所示)。申请人以从韩国首尔大学Yeon-Ho Je教授实验室 馈赠的pProAc质粒为模板利用kpnI1AcTS5’(TTGGTACCATGCAAACTCAGGTTTAAATATC)和SacI1AcTS3’ (AACTCGAGCGATTACAA GTAAAGCATATAC)进行PCR扩增，将得到的174bp(其序列如SEQ ID NO：4所示) 的cry1Ac启动子片断，利用SacI和KpnI插入到启动子的下游，构建pHT1K-Plip-TS(见图2所示)。利 用限制性内切酶和测序证明了穿梭载体pHT1K-Plip-TS的多克隆酶切位点和内部序列(见图3所示)。

然后根据苏云金芽胞杆菌(subsp.kurstaki)97-27(参见文献：Han CS，Xie G，2006)的基因组序 列(见GeneBank登录号：AE017355)设计引物CodY-F(5’ATTGGATCCATGGAATTATTAGCAAAAAC3’)和CodY-R (5’CCGCTCGAG AACACGCTTATGACACTT3’)，由于cody基因在芽胞杆菌属中是一个保守性很强的基因，因此 本发明以苏云金芽胞杆菌YBT-881(见文献：Mingshun Li，Minglei Li，2009)总DNA为模板进行PCR 扩增就能得到网上(NCBI)公布的如苏云金芽胞杆菌(subsp.kurstaki)97-27的cody基因序列。PCR扩 增条件见表2所示。

表2PCR扩增条件

混匀后置PCR仪上进行反应。循环程序95℃变性5min；再接着94℃40s，退火60℃，72℃1～2min， 30个循环；最后72℃延伸8min。

将扩增得到的cody基因(Gene ID：2854770)780bp的片段(其序列如SEQ ID NO：1所示)，用BamHI 和KpnI双酶切消化，然后将扩增得到的cody基因片段克隆到用BamHI和KpnI双酶切消化的穿梭载体 pHT1K-Plip-TS(其序列如SEQ ID NO：3所示)上，连接转化大肠杆菌E.coli(DH5α)后利用氨苄抗性 (100mg/ml)平板筛选阳性克隆，得到cody过表达载体pHT1K-PlipcodyTS(见图4所示)。利用限制性内 切酶和PCR方法验证了载体pHT1K-PlipcodyTS的内部序列的是正确的(见图5所示)。

实施例2、转录调控因子CodY在苏云金芽胞杆菌YBT-881中的过表达重组菌的构建

挑原始苏云金芽胞杆菌YBT-881一个单菌落到5mL液体LB培养液中，30℃摇床培养8h。将菌体冰上 预冷后，倒入无菌离心管中，10000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀用冰冷的DDW重新悬起，再离心回 收，重复洗涤三次，最后重悬于1mL 40％PEG 6000(w/v)。这样就制备好了苏云金芽胞杆菌YBT-881感 受态细胞。在预冷的转化杯(2mm)中，加入上述感受态细胞300uL，再加入重组DNA质粒2-5ug，混匀后 于冰上静置10分钟。电击条件为：2.3kV，475Ohm，25μF。电击后尽快加入3mL LB，转于无菌瓶中 30℃恢复培养2小时，涂布在加有筛选抗生素的平板上，30℃培养箱中倒置培养，12-18小时挑取转化子 抽质粒验证。

申请人利用电转化(电击条件为：2.3kV，475Ohm，25μF)将重组载体pHT1K-PlipcodyTS导入到 原始苏云金芽胞杆菌YBT-881中。首先利用一对特异引物pHT-S(5’GGGCGGAGCCTATGGAA3’)和pHT-AS (5’CAGCCTCGCAGAGCACA3’)，对电转化的转化子进行PCR验证，PCR扩增条件如表3所示。

表3PCR扩增条件

混匀后置PCR仪上进行反应。循环程序95℃变性5min；再接着94℃40s，退火58℃，72℃1-2min， 30个循环；最后72℃延伸8min。

筛选到的阳性结果说明为携带有pHT1K-PlipcodyTS的转化子，将其命名为cody/kur。将提纯cody/kur 质粒，转化至大肠杆菌DH5α中，再提纯质粒DNA，利用限制性内切酶进一步证明了pHT1K-PlipcodyTS的 存在。然后同时抽提原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的质粒，并 用BamHI单酶切质粒，验证图谱(见图6，7)。最终确定得到正确的过表达重组菌株。

实施例3、原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1的抽提 所用的相关溶液如下所示：

STE溶液配方(1L)：0.1mmolNaCl，10mmolTris-HCl，50mmolEDTA。

溶液I配方(1L)：25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM Glucose。

溶液II配方(1L)：200mM NaOH，1％十二烷基硫酸钠(SDS)。

溶液III配方(1L)：3M KOAc，5M CH3COOH。

(1)将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株YBT-881-L1分别接种至新鲜的LB固体培养基内，于28℃ 过夜培养。

(2)挑取少量菌体接种于5mL LB液体培养基中，28℃振荡培养到对数期。

(3)离心收集菌体，用STE洗涤一次。将菌体悬于200μL溶液I，加20μL溶菌酶，37℃静置2h-3 h。

(4)加入200μL溶液II，放置在冰上不能超过5min，加入150μL溶液III，颠倒混匀，冰上放置 20min。

(5)离心取上清，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)震荡混匀，离心吸取上清液，加入 等体积的预冷异丙醇，冰上放置10min左右，离心。

(6)用75％浓度的乙醇洗涤沉淀两次。加入适量含有RNase的双蒸水，即为制备的质粒DNA溶液。

用7％的琼脂糖凝胶电泳分离原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株YBT-881-L1的质粒，结果如 (图6)所示，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1质粒基本相同，只 是过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1质粒图谱中多了一条转化进去的pHT1K-PlipcodyTS。因此可以 证明构建过表达CodY重组菌株正确。

实施例4、原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1生长曲线的测定

(1)将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌株菌种YBT-881-L1分别接种至新鲜的LB固 体培养基内，于28℃过夜培养。

(2)挑取少量菌体接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养到对数期。

(3)按1％(v/v)的接种量将活化后的菌液重新转接入装有50mL灭菌液体LB的三角瓶中，30℃下震荡 培养，每隔2h取样，利用可见分光光度计测定培养液中的OD值，

(4)以OD600值作纵坐标、生长时间作横坐标，绘制的曲线为生长曲线。生长曲线(如图8所示)过表 达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的生长趋势与原始苏云金芽胞杆菌YBT-881基本一致，均在大约培养 13h时进入稳定期。

实施例5、苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白的提取

提取晶体蛋白所用裂解液配方：50mmol/L Na₂CO₃，50mmol/L EDTA，50mmol/L DTT，将pH调至9.5。

(1)将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1分别接种至新鲜的LB固体培 养基内，于28℃过夜培养。

(2)挑取少量菌体接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养到对数期。

(3)按1％的接种量将活化后的菌液重新转接入装有50mL灭菌液体LB的三角瓶中置28℃，200r/min振 荡培养大约3天至芽胞和晶体完全脱落。

(4)镜检确定芽胞和晶体完全脱落后，取50mL离心管，8000r/min离心10min收集胞晶混合物。

(5)用预冷的1M/L氯化钠洗涤3次，再用预冷的无菌去离子水洗涤3次。

(6)然后用裂解液悬浮，37℃作用1h。

(7)离心取上清，加入约1/10体积的4M/L醋酸钠(pH4.4)，冰上沉淀3-5h。

(8)沉淀的蛋白用ddH₂O洗涤3次后，再用50mmol/L Na₂CO₃(pH 9.5)缓冲液溶解。

实施例6、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的SDS-PAGE

10％分离胶配方(10mL)：30％凝胶母液(29.2％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺)3.3mL，4倍分离胶 缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8)2.5mL，ddH2O 4mL，10％过硫酸铵100μL，10％SDS 100μL， TEMED 4μL。

浓缩胶配方(5mL)：30％凝胶母液0.83mL，4倍浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.8)0.63mL， ddH2O 3.4mL，10％SDS 50μL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 5μL。

染色液配方：25％(v/v)异丙醇，10％(v/v)冰乙酸，0.1％(w/v)考马斯亮蓝R-250。

固定液配方：10％(v/v)甲醇，10％(v/v)乙醇。

脱色液配方：0.5％(v/v)冰乙酸，10％(v/v)乙醇。

电泳缓冲液配方：0.192mol/L甘氨酸；25mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；0.1％SDS。

具体步骤如下：

(1)将玻璃板洗净、晾干，装到支架上。

(2)配制一定体积的10％分离胶，混匀后注入垂直板电泳槽，加封一层水饱和正丁醇，于室温下聚合30 min以上。

(3)胶聚合后，倒出正丁醇，双蒸水冲洗2次，配制一定体积的浓缩胶。混匀后注入分离胶上层，插 入电泳梳板，于室温下聚合1h。

(4)取制备的Cry毒素蛋白，向其中加入等体积的2×样品buffer，混匀，沸水加热5min。离心，点 样时取上清液。

(5)轻轻拔出梳子，加入电泳缓冲液，取适量样品上样，80V电压在浓缩胶中电泳，溴酚蓝进入分离胶 后电压升至120V，电泳至溴酚蓝带至凝胶底部0.5cm处停止电泳。

(6)撬开玻璃，取出凝胶，用清水漂洗后加入固定液固定1h以上，再用染色液染色30min以上，用自 来水漂洗凝胶1-2次后，用脱色液脱色，更换脱色液3次，直到加入的脱色液脱色后不呈色为止。

SDS-PAGE电泳胶图结果如图10和11所示：原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云金芽胞杆菌菌 株有明显不同的地方，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881没有66kDa左右大小的条带，然而过表达苏云金芽胞 杆菌菌株蛋白条带图上看多了一条66kDa左右大小的条带。

将原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1经过SDS-PAGE分离的 130kDa和66kDa的条带挖出，分别放入1.5mL离心管中，送往中国科技大学质谱中心， 对蛋白条带进一级行质谱分析，结果发现过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1较原始苏云金芽胞杆菌 YBT-881晶体蛋白的种类有变化。原始苏云金芽胞杆菌YBT-881和过表达菌株YBT-881-L1 130kDa的条带 所含蛋白均为Cry1F和Cry16，过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L166kDa的条带所含蛋白为Cry2AC4。

实施例7、Cry毒素蛋白浓度的测定

考马斯亮蓝G-250染液配方(100mL)：10mg考马斯亮蓝G-250，5mL 90％浓度的乙醇中，10mL 85％ (W/V)磷酸，用蒸馏水定容至100mL。

具体步骤如下：

(1)配制牛血清白蛋白(BSA)标准溶液：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水，定容至100mL， 得到1mg/mL标准蛋白溶液。

(2)配制考马斯亮蓝G-250染液并用滤纸过滤。

(3)制作牛血清白蛋白标准曲线：取五支10mL干净的具塞试管，按表3取样。盖塞后，将各试管中溶 液纵向倒转混合，放置2min后，在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD₅₉₅，并做标准曲线。

表4制作牛血清蛋白标准曲线溶液配比

 管号   1   2   3   4   5   6  标准蛋白液(mL)   0   0.01   0.02   0.03   0.04   0.05  蒸馏水(mL)   0.5   0.49   0.48   0.47   0.46   0.45  考马斯亮蓝G-250(mL)   3   3   3   3   3   3  蛋白含量(μg)   0   10   20   30   40   50

(4)样品溶液的浓度测定：取20μL蛋白，加蒸馏水480μL，再与考马斯亮蓝G-250染液3mL充分混 合，测定其OD₅₉₅。保证其值处于牛血清白蛋白标准曲线的取值范围内，根据牛血清白蛋白标准曲线，计算 样品中蛋白的含量。

实施例8、晶体蛋白对棉铃虫毒力的生物测定

生物测定使用饲料配方如下：

(2)棉铃虫生物测定饲料配方(总体积200ml)

酵母粉8g，黄豆粉16g，琼脂4g，苯甲酸钠0.28g，抗坏血酸1g，冰乙酸1ml，余量是水。

具体步骤如下：

(1)采集虫卵，喷洒无菌水于无菌室中孵化出幼虫，即可作为生物测定用。

(2)按照养虫饲料配方，将黄豆粉和酵母粉加入到一半水中充分搅拌，为组分1。

(3)将琼脂煮沸溶解入另一半水中，为组分2。

(4)将组分1加入组分2，充分混匀。

(5)等温度降至75℃左右时，加入维生素C，苯甲酸钠，苯甲酸，36％乙酸，搅拌均匀后，放入60℃ 的水浴中保温备用。

(6)将Cry蛋白进行10倍稀释至10^-5备用。

(7)取50mL的小烧杯，写好标签，分别向每个小烧杯中加入3mL对应浓度的感染液，以无菌水作为 空白对照。将其放入60℃水浴中预热。

(8)向每个装有感染液的小烧杯中加入27mL饲料，用玻棒充分搅拌，使每个烧杯中的感染液与饲料充 分混匀，迅速将每个不同浓度的感染饲料倒入2个24孔生测板中，冷却凝固，写好标签。

(9)随机挑取棉铃虫初孵幼虫，盖上铺有吹塑纸垫板的盖子，在28℃，RH＝70％，L:D＝14时:10小时的 条件下，每孔接1头，感染3天后检查结果，用镊子触动无反应者为死虫。生测结果如表4所示，CK为无 毒饲料对照，当蛋白浓度为10时，棉铃虫的致死率均为100％，蛋白浓度为10时，原始YBT-881的样品 致死率为50％，过表达菌株YBT-881-L1的样品致死率为37.5％；蛋白浓度为10时，原始YBT-881的样品 致死率为10.42％，过表达菌株YBT-881-L1的样品致死率为14.58％，原始YBT-881和过表达菌株YBT-881-L1 杀虫活性基本一致。见表5所示。

表5原始YBT-881和过表达菌株YBT-881-L1的棉铃虫生物测定

  蛋白浓度   CK   YBT-881   YBT-881-L1   10^-1  0％   100％   100％   10^-3  0％   50％   37.5％   10^-5  0％   10.42％   14.58％

实施例9、晶体蛋白对桔小实蝇毒力的生物测定

桔小实蝇生物测定使用饲料配方：

试验用的桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)由福建农林大学益虫研究室提供的标准化试虫。将虫卵喷 洒无菌水于无菌室中孵化出幼虫。利用分光光度计测定已提取原始苏云金芽胞杆菌YBT-881及过表达苏云 金芽胞杆菌菌株的晶体蛋白的OD值并计算浓度。首先摸索适当的浓度做生物测定(桔小实蝇人工饲料如 上所述)，将Cry毒素蛋白进行10倍稀释至10^-5，使用10^-1、10^-3、10^-5三个浓度作为生物测定浓度。取 一定量的饲料，采用每30g人工饲料加50mL稀释液进行生测，每个处理30头3龄幼虫，3个重复， 3天后统计校正死亡率。见表6所示。

表6原始YBT-881和过表达菌株YBT-881-L1的桔小实蝇生物测定

  蛋白浓度   CK   YBT-881   YBT-881-L1   10^-1  0％   1％   49％   10^-3  0％   0％   36％   10^-5  0％   0％   24％

从图16可以看出，原始苏云金芽胞杆菌YBT-881晶体蛋白对双翅目桔小实蝇几乎没有杀虫活性，而 本发明构建的过表达苏云金芽胞杆菌菌株YBT-881-L1的晶体蛋白除了可以杀棉铃虫以外，增加了对双翅 目桔小实蝇的杀虫活性，分析这与本发明的过表达菌株苏云金芽胞杆菌YBT-881-L1中刺激表达了沉默的 Cry2AC4蛋白相关。

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